肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，全球由肺癌造成死亡人数高达10万，约19.4 %，位居第一^[1-2]。肺癌通常分为两类，非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC)，其中非小细胞肺癌占肺癌所有发病率的80%左右^[3]。由于肺癌缺乏有效的早期筛查手段，大多数肺癌患者确诊时已为晚期。NSCLC的常见治疗方法有手术、放疗和化疗，然而，我国肺癌的5年生存率仅为1%左右^[4]。近年来，多项研究表明EGFR、ALK、c-MET、K-RAS、BRAF可作为NSCLC分子靶向治疗的相关靶点^[5-6]。分子靶向治疗作为一种新型肿瘤治疗方案，通过研究特定基因的变化有助于开发个性化治疗，改善预后情况，延长患者生存率^[7]。

卤地菊Wedelia prostrate(Hook. et Am.) Hemsl.为菊科蟛蜞菊属植物，一年生草本，适合生长于海岸干燥沙土地区^[8]。在《福建民间草药》中，其别名为黄花龙舌草，具有清热解毒，祛痰止咳等功效，可用于治疗急性扁桃腺炎、喉蛾、喉痹、百日咳、肺热喘咳、鼻衄、痈疖疔疮等症状^[9]。其化学成分研究表明，卤地菊主要含有黄酮类、萜类、有机酸类以及甾体类等化学活性成分^[10]。有研究表明，卤地菊的醇提物显示具有良好的细胞毒作用，且其在结肠癌SW480细胞中诱导典型的凋亡细胞死亡^[11]。

本课题组从卤地菊中分离纯化出7种单体，利用MTT法从中筛选出了具有明显抗肿瘤效果的活性单体W40化合物，根据化学上的系统命名法则命名为1β，9α-diacetoxy-4α-hydroxy-6β-isobutyroxyprostatolide^[12], 其结构式见图 1a。经文献检索，尚未有W40单体抗肿瘤作用机制的报道。本文进一步探究W40对肺癌GLC-82细胞的抗肿瘤作用机制，并为W40的临床应用提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 材料

卤地菊W40(C₂₆H₃₆O₉)为本课题组库存分子。HepG2细胞、MDA-MB-231细胞、GLC-82细胞、PC-9细胞和A549细胞由中山大学附属肿瘤医院提供，Caspase -3、Caspase -9、PARP、Bax、Bcl-2、Mcl-1、Stat3、p-Stat3、BRAF、p-BRAF、MEK、ERK、p-MEK和GAPDH等一抗均购自美国Cell Sgnaling Technology, MTT和结晶紫购自美国Sigma公司，Annexin V—TC /PI双染试剂盒购自上海罗氏生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

用DMEM/T12培养液含有10% FBS)培养HepG2细胞、MDA-MB-231细胞、GLC-82细胞、PC-9细胞和A549细胞，置于37℃、含5% CO₂的恒温培养箱中常规培养。每两天更换新鲜培养液，细胞融合度达到80%左右时，用0.25%胰酶消化传代。

1.2.2 MTT法测定细胞增殖

收集对数生长期的细胞接种在96孔板中，1 000个/孔，设置3个复孔，每孔含有培养液10 μl。待细胞贴壁后加人100 μl含有不同浓度药物的培养液，继续培养细胞24、48、72 h，实验终止前4 h每孔加人10 μl 5 mg/ml的MTT试剂并孵育4 h，弃去培养液，加人100 μl DMSO溶解结晶，待结晶全部溶解后，在酶标仪上检测570 nm波长下每孔的吸光度(OD值)并记录下结果，计算细胞存活率。存活率(%) =(A实验组/A对照组)×100%，实验重复3次。

1.2.3 克隆形成抑制实验

取对数生长期的GLC-82细胞，胰酶消化后处理为细胞悬液，接种于6孔板中(800个/孔，连续培养14天后弃去上清液，用PBS洗涤细胞3次，用4 %多聚甲醛固定细胞30 min, 弃去固定液后，用0.1 %结晶紫染色30 min。轻轻冲洗后干燥，最后拍照记录结果。

1.2.4 细胞划痕实验

取对数生长期的GLC-82细胞接种于6孔板中，培养24 h后细胞密度达到90 %左右，用200 μl的无菌枪头在铺满单层细胞的上面迅速划2道痕呈”十”字划痕。PBS洗去脱落细胞后，换为无血清培养液，设置DMS0对照组和加药组，每组3个复孔，置于37 ℃、含5 % CO₂的恒温培养箱，分别取0 h、24 h和48 h作为观察时间点并拍照记录，比较细胞划痕修复速度及方式的差异。

1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡

取对数生长期的GLC-82细胞接种于6孔板，加人不同浓度的药物以及DMS0作为对照组。24 h后收集细胞，1 200 r/min, 离心3 min，弃去上清液，PBS洗涤细胞2遍，加人500 μl Binding Buffer悬浮细胞，再加人5 μl Annexin V-FITC、5 μl PI混勻后于室温避光染色15 min，最后在流式细胞仪上检测细胞凋亡。

1.2.6 Western blotting检测相关信号通路蛋白

用不同浓度的W40处理GLC-82细胞24 h，用预冷的PBS洗细胞2遍，加人细胞裂解液含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂冰上裂解1 min，12 000 r/min，4℃离心15 min，吸取上清液转移到新的EP管中，用BCA法测定蛋白质浓度。取适量蛋白质上样至SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，封闭。4℃一抗孵育过夜，TBST洗膜10 min/次，共3次; 二抗室温孵育2 h，TBST洗膜10 min/次，共3次; 于暗室发光显影洗片，扫描机扫描。

2 结果 2.1 W40对肺癌GLC-82细胞的细胞毒作用

利用MTT法检测W40对肝癌HepG2细胞、乳腺癌MDA-MB-231细胞以及3种肺癌细胞株GLC-82、PC-9和A549细胞的细胞毒作用，见图 1(b~f)。结果显示，W40作用于乳腺癌MDA-MB-231、肺癌GLC-82和PC-9细胞的IC₅₀分别为47.13±1.60、15.81±0.47和69.86±1. 31 μmol/L; 而W40作用于肝癌HepG2和肺癌A549细胞的IC₅₀均大于80 μmol/L。其中W40对肺癌GLC-82细胞有较为明显的细胞毒作用，且呈现出剂量依赖关系。

2.2 W40抑制肺癌GLC-82细胞的细胞迁移和细胞增殖

利用细胞划痕实验检测W40对GLC-82细胞迁移能力的影响。与对照组比较，不同浓度W40(20μmol/L、40 μmol/L)处理GLC-82细胞24 h和48 h，细胞迁移能力受到抑制，并呈现浓度依赖性，见图 2a。同时，W40作用GLC-82细胞14天，与对照组相比，随着药物浓度増加，细胞克隆数显著减少，并且克隆体积显著变小。当药物浓度为5 μmol/L时，GLC-82细胞克隆几乎完全被抑制，见图 2b。

2.3 W40诱导GLC-82肺癌细胞凋亡

利用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡，结果显示，W40诱导GLC-82细胞凋亡，且随着W40浓度的増加，GLC-82细胞的凋亡率逐渐升高。用不同浓度的W40 (0、10、20、40 μmol/L)处理GLC-82细胞24h，GLC-82细胞中早晚期细胞凋亡率分别为1.5%、3.4%、3.8%和31.1%，见图 3a。

2.4 W40对MAPK/ERK信号通路的影响

MAPK信号通路的异常活化会影响肿瘤的发生发展。ERK作为MAPK家族的成员之一，广泛存在于各MAPK信号通路的异常活化会影响肿瘤的发生发种组织，参与细胞的増殖、凋亡、分化的调控。为了研究W40是否通过MAPK/ERK信号通路来影响细胞凋亡，我们检测了涉及MAPK/ERK信号通路的相关蛋白的活化情况。当W40作用于GLC-82细胞24 h，随着W40作用浓度的増加，P-BRAF，P-MEK和P-ERK均表达下降，而BRAF，MEK和ERK的表达无明显变化，见图 4。这说明W40抑制了MAPK/ERK信号通路的活化，导致细胞凋亡发生。

2.5 Western blotting检测细胞凋亡相关蛋白的表达

细胞凋亡是由基因控制的自主、有序的死亡过程，它对于维持内环境的稳定具有十分重要的意义。细胞凋亡的基本过程是细胞感受到凋亡刺激信号后，调控凋亡的分子进行相互作用，促进蛋白水解酶Caspase)的活化，最后启动细胞发生凋亡。结果显示，当W40处理GLC-82细胞24 h后，随着药物浓度的増加，CaSpase-9、CaSpase-3活化，且PARP被切割，见图 5。Caspase-3剪切PARP后，破坏了其结构的完整性，使PARP失去其酶活力，加速细胞的不稳定，从而促进细胞凋亡。

2.6 Western blotting检测Stat3信号通路相关蛋白

在肿瘤发生中，异常激活的STAT蛋白能够调控某些与细胞増殖和存活相关基因的表达，因此我们检测了STAT信号通路。结果显示，当W40处理GLC-82细胞24 h后，随着药物浓度的増加，p-Stat3表达水平逐渐下降，其下游蛋白Mcl-1、Bcl-2表达下降，Stat3信号通路被抑制。此外，抗凋亡蛋白Bcl-2表达减少，促凋亡蛋白Bax表达増加，二者比值下降，促进了细胞凋亡。表明W40通过抑制Stat3信号通路而诱导肿瘤细胞发生凋亡，见图 6。

3 讨论

卤地菊Wedelia prostrate(Hook.et Arn.)Hemsl.为菊科蟛蜞菊属植物，在我国主要分布于广东、福建、台湾、浙江等地^[13]。在《福建民间草药》的记载中，卤地菊可用于治疗急性扁桃腺炎、喉蛾、喉痹、百日咳、肺热喘咳、鼻衄、痈疖疔疮等症状。可发挥治喉蛾，喉痹，白喉，百日咳，肺热喘咳，鼻衄，痈肿，疔疮等功效^[14]。实验研究表明，卤地菊提取物对白血病K562)，肝癌(HePG2) 和胃癌SGC-7901) 均有一定的细胞毒作用，但其作用机制尚不明确^[11]。

W40是本课题组从卤地菊乙醇提取物中提取的一种单体成分，同时三裂叶蟛蜞菊中也存在^[12]，但关于W40化合物的抗肿瘤机制研究尚缺乏相关报道。结果表明，我们通过MTT实验发现W40对肺癌GLC-82细胞有较为明显的细胞毒作用；克隆形成实验以及细胞划痕实验发现W40抑制肺癌GLC-82细胞増殖以及细胞迁移能力；Annexin V-FITC/PI双染实验发现W40诱导肺癌GLC-82细胞凋亡。

MAPKs家族由细胞外信号调节激酶(ERK)，p38和c-Jun氨基末端激酶(JNK)组成。MAPK通过磷酸化核转录因子、细胞骨架蛋白及酶类等参与细胞増殖、分化、转化及凋亡的调节，并与炎症、肿瘤等多种疾病的发生密切相关^[15-16]。MAPK/ERK信号通路是研究得比较清楚的一条通路。在外界因子的刺激下Ras激活，将Raf从胞浆转移到胞膜并激活，活化的Raf通过磷酸化MEK环上的丝氨酸残基而将其激活。MEK再将ERK激活，进而磷酸化许多与胞质和胞膜相连的底物^[17]。ERK还可被快速地转位到细胞核激活AP-1、ELK-1、SAP等涉及増殖的转录分子，发挥促进细胞増殖、抑制细胞凋亡的作用^[18]。

STAT蛋白作为转录因子，主要是调控宿主的应激反应，可广泛地调控细胞各种生理活动，包括细胞増殖，侵袭和凋亡^[19]。特别是STAT3，通常在肿瘤处于持续激活状态，可诱导肿瘤恶性増殖和凋亡抑制^[20]。在我们的研究中，W40抑制了STAT3的磷酸化，导致STAT3的下游靶基因的转录产物Bcl-2、Mcl-1等表达降低，Bcl-2不能与Ba结合，促进了Bax释放形成同源二聚体，抑制Bd-2的抗凋亡作用。同时，Bax形成同源二聚体可引起线粒体内、外膜之间的通透性转换孔开放，线粒体体膜电位下降，释放Cytochrome C，导致下游Caspase家族级联活化反应，引起内源性细胞凋亡；活化的Caspase还可以切割PARP，加速细胞的不稳定，共同促进细胞凋亡^[21]。

本文发现W40能抑制肺癌GLC-82细胞的増殖和迁移能力，并且对其分子机制做了初步探讨。W40能在一定程度上抑制肺癌GLC-82细胞迁移能力，W40还能促进肺癌GLC-82细胞凋亡，细胞内抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低而促凋亡蛋白Bax表达増加，同时W40能抑制STAT信号通路的靶基因的蛋白表达，促进细胞凋亡。此外，本实验显示W40还可以通过抑制MAPK/ERK信号通路发挥诱导细胞凋亡、抑制肺癌细胞増殖的作用，在治疗肺癌方面表现出良好的应用前景，这为卤地菊的临床应用提供了更多的理论依据。

致谢 本研究受到暨南大学科研培育与创新基金跃升计划11615424, 21615465) 的资助，特此致谢。