人巨细胞病毒(human cytomegalovirus, HCMV)属于疱疹病毒科的双链DNA病毒，病毒颗粒由外到内主要由包膜、被膜、核衣壳组成^[1]。HCMV在人体内的感染以潜伏感染为主。当人体免疫功能不成熟或缺陷时，潜伏病毒重新激活、原发性HCMV感染或新HCMV毒株的感染都可引起病毒大量增殖，导致损伤和疾病^[2-4]。研究发现并证实，HCMV参与多种疾病的发生，如单核细胞增多症、CMV综合征、胃肠疾病、肺炎、肝炎、动脉粥样硬化病等；HCMV还会引起先天性的感染，导致胎儿宫内发育迟缓，脾脏肿大，血小板减少，脉络膜视网膜炎，肝炎^[5-8]等先天性疾病。因此，HCMV也是影响优生优育的重要致病因子之一。

机体受HCMV原发感染后，会建立起长期的免疫机制。由于HCMV属于胞内感染，只有体液免疫和细胞免疫的共同作用才能彻底有效的清除病毒。机体对HCMV的体液免疫反应是由位于病毒颗粒外层的糖蛋白主导激发的。包膜糖蛋白B(glycoprotein B，gB)是研究较多的糖蛋白，它能激发主要的中和反应，是中和抗体和保护性抗体的重要靶标^[9-11]。而外被磷蛋白65(phosphoprotein65，pp65) 是可诱导CD8⁺CTL反应的最具有免疫原性的病毒抗原，在细胞免疫中发挥重要的作用^[12]。

到目前为止，仍没有HCMV疫苗可以获准上市。近年来，国内外学者对于HCMV疫苗的研制已取得一定进展，如HCMV pp65蛋白疫苗、gB蛋白疫苗、DNA疫苗等^[13-17]，通过实验证明可以诱导机体的体液免疫或细胞免疫反应。能同时引起机体体液免疫和细胞免疫的亚单位疫苗却鲜有报道。一方面，重组表达一种蛋白质同时实现体液免疫和细胞免疫尚需技术突破；另一方面，分别重组表达pp65和gB部分蛋白质，进行复合制备抗原也需要大量的优化工作。根据文献及生物信息学方法分析，pp65蛋白的490~508位氨基酸序列和gB蛋白的607~621位氨基酸序列具有较强的免疫原性，可认定为免疫优势表位。因此，本研究选取pp65_490~508和gB_607~621基因，表达成融合蛋白，制备一种同时含有T细胞和B细胞的优势抗原表位的HCMV疫苗，能同时诱导体液免疫和细胞免疫反应，可以有效防治HCMV感染，为今后相关疫苗研究及HCMV相关疾病的防治奠定基础。

1 材料与方法 1.1 材料

E. coli DH5α和E.coli BL21(DE3) plys菌株均为本实验室保存。pET-32a载体用于蛋白质表达，为本实验室保存。质粒提取、DNA回收试剂盒购自Omega公司，BamHΙ和HindⅢ限制性内切核酸酶、Taq酶、DNA连接酶、DNA Marker购自宝生物工程(大连)有限公司，引物由华大基因有限公司合成。IFN-γ定量检测试剂盒购自美国R&D公司(进口分装)，IL-2、IL-12定量检测试剂盒购自上海朗顿生物科技有限公司。人HCMV阳性血清由辽阳市第三人民医院检验科收集，二抗为辣根过氧化为酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG抗体和羊抗人IgG抗体，购自武汉三鹰生物科技有限公司。Balb/c小鼠由大连医科大学动物研究中心提供。

1.2 方法

1.2.1 pp65_490~508-GGGGS-gB_607~621基因的克隆及重组质粒的构建

基于Genbank中HCMV AD169株pp65基因序列和gB基因序列，设计选取pp65蛋白490~508aa和gB蛋白的607~621aa的基因片段，两者之间加入GGGGS柔链区，人工合成编码基因；以合成编码基因序列作为模板，设计引物P1(5′-GACACGGATCCGGCATCCTGGCCCGCAAC)、P2(5′-GTGTCAAGCTTT CACCCGGCGATGAAGAT)，酶切位点为BamHΙ和HindⅢ。PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min。经扩增后的目的基因和pET-32a载体用BamHΙ和HindⅢ双酶切，1%琼脂糖凝胶电泳及DNA回收纯化后，用T4 DNA连接酶16℃过夜连接，将连接产物转化E. coli DH5α感受态细胞。提取质粒进行双酶切验证，并送至华大基因有限公司测序，获得阳性克隆。再将重组质粒转化BL21(DE3) plys感受态细胞，提取质粒并测序，用BLAST进行序列比较及分析。

1.2.2 目的蛋白的表达及纯化

挑取阳性菌落接种于5ml LB培养液中，37℃培养12h后，以1:100转接于新鲜的LB培养液中，37℃培养至OD₆₀₀约为0.6时，加入终浓度为1mmol /L的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，25℃培养8h，诱导蛋白质的表达。

离心收集菌体，加入含有20mmol/L磷酸钠、0.5mol/L NaCl、20mmol/L咪唑、pH7.4的磷酸钠缓冲液重悬，冰上超声破碎5min。将匀浆物在4℃下，12 000r/min，离心15min。取上清进行镍离子亲和层析柱(1ml HisTrap excel，GE Healthcare，美国)，用AKTA explorer蛋白质纯化系统(GE Healthcare，美国)纯化蛋白质，用含有20mmol/L磷酸钠、0.5mol/L NaCl、500mmol/L咪唑、pH7.4的洗脱缓冲液洗脱。SDS-PAGE法检测蛋白质纯度，BCA法测定蛋白质浓度。

1.2.3 动物免疫

取6~8周龄的Balb/c雌性小鼠16只，随机分成两组，分别为实验组和生理盐水对照组，每组8只。将纯化后的重组蛋白与弗式完全佐剂乳化，腹腔注射，100μg/只，免疫实验组小鼠，2周后将重组蛋白与弗式不完全佐剂乳化，以同样的方式和剂量再次免疫，1周后进行加强免疫，共免疫3次。同时，以同样的方式和剂量用生理盐水与佐剂混合注射对照组小鼠。于末次免疫一周后分离血清，－20℃分装保存。

1.2.4 Western blotting法检测抗血清的特异性

将重组蛋白进行SDS-PAGE，电转至PVDF膜，用含5%脱脂奶粉的TBST室温下封闭2h；分别加入1:1 000稀释的小鼠阳性血清、阴性血清，4℃过夜孵育，TBST洗膜；加入1:5 000稀释的HRP标记的羊抗鼠的IgG，室温下孵育1h，TBST洗膜；加入ECL试剂后，显色曝光。同时设置一抗为人HCMV阳性血清，二抗为HRP标记的羊抗人IgG作为阳性对照。

1.2.5 间接ELISA法检测免疫后小鼠抗血清效价

纯化后蛋白质包被酶标板，100μl/孔，4℃过夜孵育，洗净；用含5%脱脂奶粉的PBS缓冲液封闭2h，洗剂；加入进行一系列梯度稀释(1:400~1:204 800) 的阴性血清、阳性血清，37℃孵育1h，洗净；加入1:5 000稀释的HRP标记的羊抗鼠的IgG，37℃孵育1h；洗净甩干后加入TMB显色液，避光反应15min，加入2mol/L的H₂SO₄终止液。测定阴性血清、阳性血清的OD_450nm值，以P/N≥2.1判定为阳性，P/N≥2.1的最大稀释度作为被检血清的抗体效价。

1.2.6 双抗夹心ELISA法检测抗原

取一系列梯度稀释(1:100~1:12 800) 的小鼠阳性血清、阴性血清包被酶标板，100μl/孔，4℃过夜孵育，洗净；用含5%脱脂奶粉的PBS缓冲液封闭2h，洗净；加入重组蛋白，37℃孵育1h，洗净；加入1:100稀释的人HCMV阳性血清，37℃孵育1h，洗净；加入1:5 000稀释的HRP标记的羊抗人的IgG，37℃孵育1h；洗净甩干后加入TMB显色液，避光反应15min，加入2mol/L的H₂SO₄终止液。测定阴性血清、阳性血清的OD_450nm值，以P/N≥2.1判定为阳性。

1.2.7 流式细胞仪检测

用流式细胞仪检测小鼠外周血中CD4⁺ T细胞和CD8⁺ T细胞的百分比。取小鼠抗凝血(阴性、阳性血)50μl于流式细胞仪专用上样管中，分别加入PE-CD8和APC-CD4单抗，避光放置20min，加1 500μl的NH4Cl震荡数秒裂解红细胞，15min后流式细胞仪检测。

1.2.8 IFN-γ、IL-2、IL-12浓度的测定

采用双抗夹心ELISA法检测小鼠血清中IFN-γ、IL-2、IL-12的浓度。分别取小鼠的阴性血清、阳性血清，按试剂盒说明书检测IFN-γ、IL-2、IL-12的浓度。

1.3 统计学分析

应用SPSS13.0软件，对实验数据进行分析，采用t检验法分析，P＜0.05代表差异有统计学意义。

2 结果 2.1 pp65_490~508-GGGGS-gB_607~621基因的克隆及重组质粒的双酶切验证

PCR扩增目的片段经1.5%琼脂糖凝胶电泳后，在142bp处有一条特异性条带，与预期目的条带的大小一致(图 1)。重组质粒经BamHΙ和HindⅢ双酶切，琼脂糖凝胶电泳分析，在142bp、5 900bp处有特异性条带，说明目的片段和载体片段大小与预期值是一致的(图 2)。测序结果经BLAST比对与理论基因序列一致。

2.2 目的蛋白的表达及纯化

纯化后蛋白进行12%SDS-PAGE电泳实验，结果如图 3所示，纯化后蛋白在22kDa附件处有一条明显的条带(目的蛋白理论分子质量为21.6kDa)，经ImageJ软件分析电泳条带灰度，测得蛋白质的纯度为80.1%。采用BCA法测定蛋白质浓度为0.62mg/ml，纯化样品蛋白质含量为30.5mg，纯化后所得样品蛋白含量为9.3mg，得率为30.51%。

2.3 Western blot检测

利用Western blot检测抗血清与重组蛋白结合的特异性，结果显示在22kDa附近处有特异性条带，在人HCMV阳性血清实验中也有特异性条带，而小鼠的阴性血清检测没有条带，说明免疫后的小鼠阳性血清中抗体可以与重组蛋白特异性结合，进一步证明所制备的HCMV疫苗可以使小鼠产生体液免疫反应(图 4)。

2.4 抗血清效价的测定

间接ELISA法测定抗血清的效价，以P/N≥2.1的最大稀释度作为被检血清的抗体效价，因此测定抗血清的效价为1:102 400(表 1)。

2.5 双抗夹心ELISA法检测抗原特异性

双抗夹心ELISA法结果显示，抗原能与小鼠阳性血清和人HCMV阳性血清特异性结合，说明重组蛋白含有HCMV抗原表位，具有较好的特异性(表 2)。

2.6 流式细胞仪检测

用流式细胞仪检测小鼠外周血中CD4⁺ T细胞和CD8⁺ T细胞的百分比。结果显示，与对照组相比，实验组小鼠外周血中CD4⁺ T细胞和CD8⁺ T细胞的数量有显著增加，差异有统计学意义(P＜0.01)，如图 5所示。

2.7 IFN-γ、IL-2、IL-12浓度的测定

采用双抗夹心ELISA法分别对小鼠血清中IFN-γ、IL-2、IL-12浓度进行测定。结果显示，与对照组相比，实验组小鼠血清中IFN-γ、IL-2、IL-12的浓度有了显著的提高，差异有统计学意义(P＜0.01)，如图 6所示。

3 讨论

近20年来，随着免疫低下状态人群(爱滋病、放射损伤、器官移植和恶性肿瘤等患者)的增多，HCMV感染及其引发的严重疾病日益增加，而HCMV的药物治疗方法会产生较强的副作用，因此制备HCMV疫苗是防治HCMV最有效的方法。对于HCMV优势抗原表位，即能够产生较强的免疫反应的抗原表位，目前已经研究报道的有pp65、gB、pp150、IE-1、gH蛋白等多个抗原表位^[18]。而gB蛋白和pp65蛋白是目前研究最多，也是被证明能分别产生较强的体液免疫和细胞免疫反应的两种蛋白质。

通过生物信息学技术，本研究选取pp65蛋白的490~508aa和gB蛋白的607~621aa作为优势抗原表位，制备HCMV疫苗，通过免疫小鼠，检测免疫后血清的指标来探究它的体液免疫和细胞免疫活性，Western blot和间接ELISA方法可以检测小鼠产生的特异性抗体和对应抗原的特异性及抗体的效价。

CD4⁺ T细胞和CD8⁺ T细胞作为两种重要的免疫细胞，在机体体液和细胞免疫中发挥重要作用。CD8⁺ T细胞能诱导产生IFN-γ，主要在细胞免疫中发挥重要作用。CD4⁺ T细胞可分为Th1和Th2两大类细胞^[19]。Th1细胞分泌IFN-γ、IL-2、IL-12等细胞因子，主要介导细胞免疫应答，并可通过细胞表面的CD40L与巨噬细胞表面的CD40特异性结合，使巨噬细胞接收信号，进一步清除宿主细胞内的病原体；而Th2细胞主要介导体液免疫应答，产生抗体。虽然CD8⁺ T细胞被认为是对抗病毒的主要效应细胞，然而HCMV的彻底清除可能高度依赖于数量和功能正常的CD4⁺ T细胞的协助。因此，本研究通过检测小鼠外周血中CD4⁺ T细胞和CD8⁺ T细胞的数量，以及Th1型细胞因子的浓度来探究疫苗在小鼠体内的细胞免疫活性。进一步研究可通过细胞毒性试验、ELISPOT实验等来探究抗原多肽特异性的CD8⁺ CTL细胞的产生。

综上，本研究通过生物信息学技术选取能产生较强体液免疫和细胞免疫反应的优势序列表位肽段，通过短肽柔链串联，构建人工抗原表位；采用蛋白质工程技术合成HCMV人工抗原表位编码基因并与表达载体pET-32a连接，通过表达制备重组抗原，利用重组的His标签实现金属螯合层析有效分离纯化，作为HCMV亚单位疫苗，能诱导小鼠产生较强的HCMV体液免疫和细胞免疫反应，对HCMV的防治及研制HCMV临床应用疫苗具有重要意义。