多柔比星(Doxorubicin，DOX)临床使用时的心脏毒性一直是限制其使用的一个因素，其机制尚未完全解释清楚^[1]。有研究表明miR146a可以通过调节幼红细胞白血病病毒癌基因同源体4(ErbB4) 的表达部分地参与了多柔比星的心脏毒性效应^[2]。miRNA通常可以调节多个基因的表达发挥其生理功能^[3]，因此很可能有其他通路也参与了多柔比星的毒性效应。

常间回文重复序列丛集(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)是近几年发展迅速的一种基因编辑技术，可以简单有效地敲除基因的表达^[4]。本研究中我们使用CRISPR技术敲除大鼠心肌细胞中miR146a的表达，获得了显著优于现有抑制miRNA功能方法的效果。在此基础上，我们证实了敲除miR146a可以抑制多柔比星导致的心肌细胞毒性，Smad家族成员4(Smad4) 是miR146a的一个靶基因，并且参与了这一过程。本研究为探索多柔比星的毒性机制提供了一些新的证据。

1 材料与方法 1.1 试剂和仪器

大鼠心肌细胞系H9c2购于中国科学院细胞库；293FT细胞购于Life Technologies公司。多柔比星购于Sigma-aldrich公司；DMEM培养基，胰酶，双抗购于Life Technologies公司；蛋白提取液，BCA蛋白浓度测定试剂盒购于碧云天生物技术研究所；ECL化学发光检测试剂盒购于Bio-rad公司；Smad4，Caspase3抗体购于Cell Signaling公司；CCK-8试剂盒购于碧云天生物技术研究所；Blasticidin和Puromycin购于Life Technologies公司；荧光素酶检测试剂购于Promega公司；miR-146a检测试剂盒购于Applied Biosystems公司。普通PCR仪(Thermo Scientific，USA)，Nanodrop2000分光光度计(Thermo Scientific，USA)，Stratagene MX3000p荧光定量PCR仪(Agilent，USA)等。

1.2 CCK-8细胞活力检测

检测过程按照试剂盒说明进行。按10⁴/孔将细胞铺入到96孔板中，每组5个孔，4h后加入DOX处理，24h后，加入10μl CCK-8检测试剂，混匀，孵育1h后，测定450nm吸光度值。

1.3 Western blot

用胰酶消化收集培养的细胞，加入蛋白提取液裂解，离心后收集上清，用BCA试剂盒测定蛋白浓度，取适量蛋白提取液进行SDS-PAGE电泳，按照常规操作流程进行Western blot检测目的蛋白表达。

1.4 miR146a表达检测

弃去培养细胞的上清，用PBS洗一次，然后加入Trizol裂解，按说明书流程提取RNA，然后按miR-146a检测试剂盒说明书步骤进行荧光定量PCR检测，通过U6作为内参校正miR-146a表达量。

1.5 4miR146a靶点预测

通过TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_71/)进行miR146a的靶点信息学分析^[5]。

1.6 载体构建

在网站http://crispr.genome-engineering.org/设计针对大鼠miR146a基因序列的sgRNA靶点，共设计两个，靶点1：ctctgagaactgaattccat，靶点2：gctaaagaactgaacttcac。按序列合成寡聚核苷酸，用BbsI酶切敲除载体pLentis-U6-sgRNA-SFFV-Cas9-T2A-PURO，将合成的寡聚核苷酸退火以后连入酶切的载体中，得到针对miR146a的敲除载体pLentis-U6-sgmiR146a-SFFV-Cas9-T2A-PURO，通过测序验证载体构建正确，针对两个不同靶点的干扰载体分别用sgmiR146a-1和sgmiR146a-2表示。

合成连续的5个miR146a的部分互补序列^[2]，然后用BbsI连入载体pLentis-CMV-PURO的puromycin基因后，得到针对miR146a的Decoy病毒载体。

合成250bp包含miR146a发卡区的基因组序列，然后用BbsI连入载体pLentis-CMV-PURO的puromycin基因后，得到miR146a的表达病毒载体，此载体中puromycin和miR146a的表达均由CMV启动子启动，以表达miR30的载体作为对照。

合成Smad4基因100bp包含miR146a结合靶点的UTR序列，然后用BbsI连入载体pLentis-CMV-Luc-PGK-Bsd的Luciferase基因后，得到针对miR146a的荧光素酶报告载体。

所用载体示意如下。

1.7 慢病毒制备

病毒制备按照文献[6]报道方法进行。通过磷酸钙转染法将病毒载体和包装质粒共转染到293FT细胞中，培养48h后收集上清，用0.45μmol/L滤器过滤后置于－20度保存。

1.8 细胞转染

用胰酶消化培养的H9c2细胞，按2×10⁴/孔铺入24孔板中，24h后加入病毒液(转染复数20)，培养20h后换为新鲜的DMEM培养基，待细胞长满后传代，带有PURO基因的病毒用Puromycin筛选，带有Bsd基因的病毒用Blasticidin筛选，获得稳定转染的细胞。

1.9 统计学分析

实验结果用GraphPad Prism 5进行处理，组间差异使用非配对t检验，P＜0.05认为有统计学差异。

2 结果 2.1 多柔比星毒性作用伴随miR146a表达增加

多柔比星处理大鼠心肌细胞后，细胞活力为对照组的67.1±3.1%(图 1a)，Western blot检测发现DOX处理后胞内有较明显的Caspase3表达(图 1b)，而处理细胞的miR146a表达增加3.60±0.24倍(图 1c)。

2.2 使用CRISPR敲除miR146a表达

设计针对miR146a的两个sgRNA靶点并构建病毒载体(图 2a)，用构建的敲除病毒转染细胞并筛选后，检测miR146a的表达。两条序列均可以有效地敲除miR146a，1#靶点miR146a表达是对照细胞的12.8±1.7%，2#靶点是正常细胞的20.4±1.5%，选用sgmiR146a-1进行后续的实验(图 2b)。

2.3 CRISPR与Decoy对miR146a抑制效果比较

Decoy是常用的抑制miRNA研究其功能的方法^[7]，使用miR146a Decoy的病毒转染细胞并筛选后，检测到miR146a的表达是对照细胞的42.4±3.7%，CRISPR介导的miR146a敲除效果显著优于Decoy(图 3)。

2.4 敲除miR146a抑制多柔比星的毒性作用

敲除miR146a的细胞用DOX处理后，miR146a的增加不明显(1.08±0.06倍，ns)(图 4a)，处理细胞活力为对照组的80.4±5.7%(图 4b)，Western blot显示Caspase3表达也不明显(图 4c)，证明敲除miR146a抑制了多柔比星对心肌细胞的毒性作用。

2.5 miR146a通过Smad4参与多柔比星的毒性作用

靶点预测显示Smad4是miR146a的潜在靶基因(图 5a)，用Smad4 UTR的荧光素酶报告病毒转染细胞建立稳定表达细胞后，再用表达miR146a的病毒转染此细胞，相对于对照，miR146a表达显著抑制了荧光素酶的表达(139 900±10 650 vs 67 630±8 419，P＜0.01)(图 5b)。而在DOX处理的心肌细胞内，Western blot检测发现Smad4表达下降(图 5c)。

进一步检测发现在敲除miR146a的细胞中，Smad4表达升高，而DOX处理此细胞，Smad4变化不明显(图 6)。

3 讨论

揭示多柔比星的毒性作用机制，对于减小副作用，改良药物临床应用有着重要的意义。miRNA是一类重要的胞内小RNA，参与了细胞内各种基因的表达调控^[3]。由于一个miRNA可以通过结合不同的UTR区同时调控多个基因的表达，因此它常会参与多种细胞生理行为。本文中描述的miR146a，一些免疫细胞中能够通过调节TRAF6影响细胞的凋亡^[8]，而在心肌细胞中，却通过调控另一个基因ErbB4影响细胞凋亡^[2]。在我们的研究中，发现Smad4也是miR146a的一个靶基因，在多柔比星处理的细胞中，miR146a通过抑制Smad4促进细胞凋亡。这意味着miR146a在此过程中是一个重要的效应分子，可以通过多条通路介导多柔比星的细胞毒性效应。敲除miR146a可以显著抑制多柔比星的毒性，提示miR146a抑制剂有可能作为一种选择来缓解临床上多柔比星导致的心脏毒性。

Smad4是转化生长因子受体β(TGFβ)通路中的一个重要的信号分子，介导了TGFβ的胞内信号传递，对于细胞的增殖或凋亡有重要的影响^[9]。在不同的细胞中，miR146a对Smad4的调控可能会产生不同的结果。通常在肿瘤细胞中，TGFβ通路是细胞生长的负向调节因素，miR146a上调表达抑制Smad4，从而抑制TGFβ通路，促进了细胞的生长^[10]。而在另一些细胞，如软骨细胞，肝脏星形细胞中，TGFβ通路作为细胞增殖的正向调节因素，miR146a上调表达会抑制Smad4，从而导致细胞凋亡^[11-12]。由于细胞行为是多种信号共同控制的结果，因此对于特定的细胞由于内源性基因表达的差异，需要进行特定的分析，因此本研究证明在心肌细胞上，miR146a表达的增加通过抑制Smad4表达最终产生促进凋亡的效果(见以下图示)。

CRISPR作为现在最热门的基因编辑技术，广泛地应用于基因功能研究中。使用CRISPR可以非常简单地进行基因组的精确修饰。但在其应用中，对于miRNA的编辑研究并不多见^[13]，有研究使用CRISPR或CRISPRi抑制miRNA的表达^[14]，由于其采用的瞬时转染技术，对miRNA的表达抑制率并不高。在本研究中，我们结合了慢病毒载体技术，从而获得高转染效率，有效地敲除了细胞中内源性的miRNA表达。并且与传统的使用Decoy或者Sponge的miRNA抑制方法相比^[7]，具有更高的抑制效率。本研究中使用的这一方法，对于miRNA的功能研究，具有积极的意义。