中国生物工程杂志  2017, Vol. 37 Issue (4): 83-88

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邵莉, 马晓慧, 王相阳, 徐寒梅.
SHAO Li, MA Xiao-hui, WANG Xiang-yang, XU Han-mei.
长效化融合蛋白药物及其药动学分析技术的研究进展
Progression of the Long-term Mechanism and Pharmacokinetics Analysis Technology of Fusion Protein Drugs
中国生物工程杂志, 2017, 37(4): 83-88
China Biotechnology, 2017, 37(4): 83-88
http://dx.doi.org/DOI:10.13523/j.cb.20170411

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收稿日期: 2016-11-15
修回日期: 2016-12-07
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邵莉, 马晓慧, 王相阳, 徐寒梅. 长效化融合蛋白药物及其药动学分析技术的研究进展[J]. 中国生物工程杂志, 2017, 37(4): 83-88.
SHAO Li, MA Xiao-hui, WANG Xiang-yang, XU Han-mei. Progression of the Long-term Mechanism and Pharmacokinetics Analysis Technology of Fusion Protein Drugs[J]. China Biotechnology, 2017, 37(4): 83-88.
长效化融合蛋白药物及其药动学分析技术的研究进展
邵莉1, 马晓慧2, 王相阳2, 徐寒梅1     
1. 中国药科大学 南京 211100；
2. 天士力制药集团股份有限公司研究院药理毒理研究中心 天津 300410
收稿日期: 2016-11-15; 修回日期: 2016-12-07
通讯作者: 徐寒梅, 电子信箱:13913925346@126.com
摘要: 融合蛋白技术应用于生物制药行业已超过25年，其目的为改善原来天然蛋白的性质，从而具有新的理化特征和生物学功能，其中最为显著的特点是改善了小分子蛋白及多肽半衰期短的缺陷。基于该技术所诞生的融合蛋白类药物已成为当前生物药研发的热点。结合已上市融合蛋白类药物，通过与传统多肽蛋白类药物比较，重点突出融合蛋白类药物自身特点，主要从融合抗体Fc段和人血清白蛋白以延长小分子蛋白及多肽半衰期的角度对融合蛋白药物长效化策略进行评述；对融合蛋白类药物在体内的吸收、分布、代谢和排泄的显著特征进行概述；综述该类药物在体内的分析技术并指出当前分析技术的优缺点及发展方向，为长效化融合蛋白药物的设计、分析研究与开发提供依据和思路。
关键词: 融合蛋白药物     长效化     药动学     分析技术    
Progression of the Long-term Mechanism and Pharmacokinetics Analysis Technology of Fusion Protein Drugs
SHAO Li1, MA Xiao-hui2, WANG Xiang-yang2, XU Han-mei1     
1. China Pharmaceutical University, Nanjing 211100, China;
2. Division of Pharmacology and Toxicology, Tasly Academy, Tianjin 300410, China
Abstract: It has been over 25 years since the application of fusion protein in the biopharmaceutical industry. The purpose to improve the original properties of natural protein, thus a new physical and chemical characteristics and biological function, one of the most remarkable characteristic is improved the small molecular protein and polypeptide short half-life of defects. Based on the technology, the birth of the fusion-protein drugs (FPDs) is becoming a hot spot of current research and development of biological medicine. Based on the fusion protein drugs already on the market, compared with traditional protein polypeptide drugs, highlighting characteristics FPDs, mainly from the fusion antibody Fc and human serum albumin by prolonging the small molecule protein and peptide half-life, and FPDs long-term strategy was reviewed. The FPDs in vivo absorption, distribution, metabolism and excretion of the salient features are summarized. And then analyses the technology of FPDs in the body and points out the advantages and disadvantages of the current analysis technology and the development direction, and sheds light on the design, research and development of FPDs.
Key words: Fusion-protein drugs     Long half-life     Pharmacokinetics     Analysis technics    

随着医药领域的发展，生物药以其独特的优势展现出了强大的生命力，是目前医药研发领域的热点。目前临床上使用的一些蛋白和多肽类药物，如胰岛素、干扰素、细胞因子等，具有疗效高、副作用少、免疫原性低等优点，但其缺点是相对分子质量较小，极易被肾脏清除，在体内的半衰期较短，临床使用时需要通过频繁给药来维持药效，因此极大地限制了这类药物在临床上的应用，对这类药物进行以延长药效为目的的改造已迫在眉睫。

同传统的蛋白质药物相比，融合蛋白药物不仅保留了原有蛋白的生物学活性，而且经过融合，其分子量得到扩增，从而不易被肾小球滤过，具有延长药物半衰期的作用。经考察，目前美国食品和药物管理局 (Food and Drug Administration，FDA) 已经批准上市了11个Fc融合蛋白药物、2个白蛋白融合蛋白药物、1个白喉毒素与IL-2的融合蛋白药物，适应症覆盖了自身免疫病、眼科疾病、肿瘤、糖尿病等。可见，在未来的一段时间内，长效化融合蛋白类药物将会大有作为[1]。

1 融合蛋白药物的长效策略

多肽和蛋白质类药物通常由于它们分子量小于70kDa而易被肾小球滤过，极大地限制了药物在体内的半衰期[2-3]。除此之外，由于肾小球基底膜带负电荷，易与带负电荷的多肽或蛋白构成电荷屏障，进而更难被肾小球滤过，而阳离子多肽则因此会较快被清除[4]。综合文献报道可通过三个途径来改善小分子多肽及蛋白的药动学行为：第一，增加多肽及蛋白的大小及流体力学半径；第二，增加多肽及蛋白的表面负电荷；第三，通过连接白蛋白及免疫球蛋白来增加蛋白及多肽的血清蛋白水平[5-7]。

为延长蛋白及多肽在体内的半衰期，以前常用聚乙二醇 (PEG) 作为蛋白修饰剂, PEG无毒，其生物相容性已通过FDA认证[8]。但有研究显示PEG成分与肾小管上皮细胞空心化有关[9]，导致相关安全性问题。据此，融合蛋白成为开发长效化蛋白药物的主要方法。主要包括白蛋白融合与IgG-Fc融合等，其中IgG1、IgG2和IgG4的半衰期约为21天，而IgG3和其它Ig的半衰期在2.5~7天范围内[10]，HSA血清半衰期可达19天[11]，根据其半衰期的优势，经FDA批准上市的融合蛋白类药物以IgG类型和HSA类型为主。

目前，经FDA批准上市了11个IgG-Fc融合蛋白药物，2个白蛋白 (HSA) 融合蛋白药物，1个白喉毒素与IL-2的融合蛋白 (ontak®)，其中ontak®的构建目的是使药物具有生物靶向性，而非延长半衰期，见表 1。其中IgG-Fc和HSA类型融合蛋白的长效化源于新生儿Fc受体 (FcRn) 介导的再循环机制[12-13]。IgG1、IgG2、IgG4及HSA通过胞饮作用进入细胞内，在早期弱酸性 (pH6.0~6.5) 的内吞体中与FcRn结合，从而逃避胞内溶酶体的降解，由于这种结合是pH依赖性的，当结合体运行到胞外，即pH为中性时，其将脱离FcRn再次进入循环，从而延长半衰期[12, 14]。而IgA、IgM、IgD及IgE不与FcRn结合，因此不具备延长半衰期的条件。IgG3则由于在FcRn结合域中存在变异，从而大大降低了其与FcRn的结合。所以，在实践中，IgA、IgM、IgD、IgE及IgG3未被用作治疗候选抗体[13]。1998年，随着第一个IgG-Fc融合蛋白药物Enbrel® (etanercept) 被FDA批准上市后，越来越多的融合蛋白药物进入上市和临床研发阶段。而融合蛋白技术也成为蛋白药物长效化最为重要的手段。

2 融合蛋白类药物体内药代动力学特征

虽然大分子融合蛋白药物发展迅速，但其药动学特征方面报道较少，融合蛋白类药物在给药途径、体内分布、代谢、消除等方面都具有鲜明的自身特点。

给药途径：目前，经FDA批准上市的融合蛋白类药物给药途径为i.v、s.c、i.m三种，剂型为溶液型注射剂和冻干粉针剂，以提高药物在体内的生物利用度。其中s.c给药为生物药给药研究新领域，有研究者对其给药的剂量、注射部位、给药体积及药效持续时间进行了深入研究[15-16]。影响融合蛋白药物生物利用度的原因有药物自身特性，体内pH值、消化酶、以及生物膜的屏障作用等[17]。

体内分布：经改造构建后的融合蛋白药物在体内的分布一般具有靶向性。如周治东等[18]构建GFE-1多肽与重组人肿瘤坏死因子α(rhTNF-α) 融合蛋白 (GFE-1-rhTNF) 在小鼠体内肺组织的富集远高于肝肾组织，且体外可显著杀伤L929细胞并特异性富集于小鼠肺组织。有研究者将药物蛋白序列与靶向分子 (如RCD片段等) 偶联，可使药物迅速富集到病灶部位，能够显著提高药物疗效和降低药物毒性[19]。融合蛋白类药物因其分子量大、极性高，使其难以通过扩散的方式分布进入组织，通常通过血液－组织液对流和内吞的方式进入，速率较慢，不易在组织蓄积。

代谢与消除：融合蛋白药物大多是通过与器官组织中的蛋白酶发生水解反应进行降解，不从肾脏以原型形式排泄，也不通过肝脏药物代谢酶代谢，其半衰期长。其消除机制可分为：吞饮作用 (Pinocytosis)、FcRn介导的抗体保护 (FcRn-mediated IgG protection)、Fcγ受体介导的消除 (FcγR-mediated elimination) 和抗药物抗体 (Anti-drug antibody, ADA) 的中和作用 (Neutralization)[20]。此外，这类药物还可通过靶点介导进行消除 (Target-mediated drug disposition，TMDD)，当药物分子与相应配体 (受体) 结合后，通过胞吞作用进入细胞，随后在溶酶体进行降解[21]。

排泄：融合蛋白药物在体内经蛋白酶降解产生的氨基酸及小肽片段，一部分经肾脏排出，一部分进入内源氨基酸库，用于内源性物质的重新合成，这些药物很少以原型药的形式排泄。

3 融合蛋白类药物体内药代动力学分析技术

随着科学技术的发展，为融合蛋白类药物的药代动力学研究提供了多种分析手段，目前，可开发作为分析融合蛋白药物的技术主要有：酶联免疫吸附测定、化学发光免疫分析技术、放射性同位素示踪、质谱分析技术以及活体成像等。

3.1 酶联免疫吸附测定 (ELISA)

酶联免疫吸附测定法 (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA) 是免疫学诊断中的一项常用技术，是目前融合蛋白药物药代动力学评价的常用方法。该方法将抗体-抗原特异性结合反应与酶的高效催化作用原理有机结合起来，具有灵敏度高、准确性好，重复性好、操作简便、适用范围广等优点。目前经FDA批准上市的13种融合蛋白类药物，其药动学分析方法均为ELISA。用于临床检验的ELISA主要分为双抗体夹心法测抗原、双抗原夹心法测抗体、间接法测抗体、竞争法测抗体、竞争法测抗原、捕获包被法测抗体、亲和素-生物素系统-酶联免疫吸附7种方法。

但该方法不能对融合蛋白药物在体内的分解产物进行分析，对此，Hall等[22]利用ligand-binding mass spectrometry (LBMS) 分析技术，对升血小板药物Nplate在体内降解产物进行分析。LBMS是将配体结合反应技术与质谱分析技术连接，实现完全代谢产物分析。

表 1 FDA批准的融合蛋白类药物 Table 1 The fusion protein therapeutic agents approved by FDA
融合类型上市药物半衰期 (天)分子结构适应症长效机制
Fc-融合蛋白Enbrel (1998)4.25IgG1 Fc-p75 of TNFα类风湿性关节炎
Amevive (2003)11CD-2 of LFA-3-IgG1 Fc慢性斑块型银屑病
Orencia (2005)16.7(12~23)CTLA4-IgG1 Fc类风湿性关节炎
Arcalyst (2008)6~8IL-1R-IgG1 FcCryopyin蛋白-周期性综合征
Nplate (2008)3.5 (1~4)GCSF-IgG1 Fc慢性免疫性血小板减少性紫癜
Nulojix (2011)8.2~9.8CTLA4-IgG1 Fc器官排斥反应抗体Fc受体[11-14]
Eylea (2011)5~6VEGFR-IgG1 Fc湿性老年黄斑变性
Zaltrap (2012)6(4~7)VEGFR-IgG1 Fc湿性老年黄斑变性
Alprolix (2014)3~4FIX-IgG1 FcB型血友病
Eloctate (2014)5FVⅢ-IgG1 FcA型血友病
Trulicity (2014)5GLP-1-IgG4 FcⅡ型糖尿病
HSA融合蛋白Tanzeum (2014)5GLP-1-HSAⅡ型糖尿病
Idelvion (2016)4FVⅢ-HASB型血友病
白介素-2与白喉毒素融合Ontak (1999)0.05DAB389/IL-2T细胞淋巴瘤白介素-2
注：表 1中数据来源于美国FDA药品数据库
表选项

近年来，有研究者用强扩增能力的DNA片段标记检测抗体，通过RT-PCR仪对标记DNA片段进行扩增定量，将传统ELISA的反应线性信号放大转变成PCR扩增指数信号，可使检测限降低3~4个数量级[23]。此外，在检测生物样品时，由于生物体内的内源性蛋白与药物代谢片段可能会对ELISA法检测造成干扰，因此常采用HPLC或LC-MS作为分离手段，将代谢片段与原型药物进行分离，以提高ELISA检测的准确性。Robert等[24]联合ELISA与2DLC/MS对血浆中胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、GLP-1N端、GLP-1C端进行分离与鉴定，准确定量了GLP-1原型药物的血药浓度。

3.2 化学发光免疫分析技术

化学发光免疫分析技术是将发光分析技术和免疫反应相结合而建立的一种免疫分析技术，具有发光分析的高灵敏性和免疫反应的高特异性，能检测微量的抗原或抗体，适合融合蛋白类药物在生物样本中的检测。

传统的ELISA免疫分析技术需要消耗数小时，较长的孵育时间常引起交叉反应出现假阳性或是假阴性的结果，限制了样品的检测通量及结果准确性。为克服这些缺点及实现免疫检测的高通量，可通过外场驱动或对溶液进行有效混合策略加快抗原、抗体等生物大分子的传质速率，或提高反应体系的温度来加速免疫反应的动力学，从而实现快速免疫检测[25]。临床免疫检测中常见的化学发光免疫类型分为化学发光酶免疫分析、微粒子化学发光免疫分析、电化学发光免疫分析[26]。Djeneba等[27]，通过研究得出基于电化学发光技术的Meso Scale Discovery (MSD) 分析技术，可为检测血浆中内生细胞因子提供更为可靠的评估。

3.3 放射性同位素示踪技术

放射性同位素示踪技术具有灵敏度高、特异性强、操作简便等特点，是大分子药物体内药代动力学研究的常用方法，适合融合蛋白类药物的检测。常用的标记核素包括125I，3H等，其中125I因放射性比活性较高，半衰期适宜，标记简单而最为常用。在药物的检测中，放射性同位素示踪技术常与酸沉淀法、SDS-PAGE、HPLC联合使用。姜国华等[28]，对含有125I-NGF的检测样品进行电泳分离后，进行射线信号检测，获得了125I-NGF在小鼠体内的血药浓度、组织分布、排泄等全部资料。该方法以其独特的优势常用来研究药物组织分布及排泄。然而，放射性同位素示踪技术只能测得具有免疫活性的物质，无法测出具有生物活性而无免疫活性的物质；且不能进行人体药代动力学研究；同位素标记后可能会引起药物的生物活性及其在生物体内的代谢行为发生变化。由于融合蛋白类药物进入体内会被蛋白酶等降解代谢成小肽或氨基酸，当这些小肽或氨基酸与其他蛋白质结合时，总的放射性强度不能代表药代动力学过程[29]。

3.4 质谱分析技术

由于判定融合蛋白药物在体内代谢后，其产物是整个融合蛋白分子还是其他分解产物，从分析角度上仍是挑战。因此，设想利用质谱分析技术收集大量代谢产物数据，将大大提高研究者对融合蛋白药物药动学特征的分析。如前所述LBMS技术，其中电喷雾 (ESI) 和基质辅助激光解析 (MALDI) 离子源等“软电离源”技术，使质谱可用于分析部分电离性能较强的多肽片段[30]。对于大分子融合蛋白的药代动力学检测，可尝试对融合蛋白进行前处理，将其酶解成不同的肽段再进行分析，其对样品纯度及肽段稳定性要求较高，检测难度较大。

后期方法开发可将多种方法联用，如Navarrete等[31]创建了新型在线固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法 (SPE-HPLC-MS/MS) 自动化分析系统，灵敏度高，能够有效地简化样品的前处理，提高检测效率以及准确性。彭晓云[32]利用胰酶酶切人血清中英夫利昔单抗后，利用LC-MS/MS技术测定一段特征性肽段来代表整个抗体含量，线性范围为0.39~100μg/ml。有研究者独具创新地利用LC-MS/MS技术测定了免疫磁珠-酸解离法洗脱液中残留的抗体药物、内源性IgG和中和性抗体 (NAb)，其结果表明该方法具有特异性及多重性优势，可为免疫学实验的多种成分提供快速直接的测定方法[33]。上述分析技术联用，可为以后开发融合蛋白质谱分析提供参考和思路。

3.5 活体成像技术

活体成像技术 (Living animal imaging technology) 是一类以分子标记与体外显影成像技术为基础的在体实时监测技术，其中核素活体成像与荧光标记技术等以其自身优势特点，可为以后研究融合蛋白类大分子药物的代谢和生理学事件提供技术支持。

3.5.1 荧光标记技术

荧光成像技术发展迅速, 表现在成像探针种类越来越多，功能越来越强大[34]。量子点 (Quantum dots, QDs) 荧光标记是纳米技术和体内荧光成像技术结合的一种新技术。除了能对活细胞进行长时间动态荧光观察与成像，对细胞间、细胞内及细胞器间的各种相互作用的原位实时动态示踪外，还可以将其他需要研究的物质进行标记，如待测药物、生物大分子等，示踪其活动，该技术在活体示踪方面具有自身特有的应用优势[35]。如覃光炯等[36]以异硫氰酸标记的牛血清白蛋白作为标记药物 (FITC-BSA)，建立了同步荧光法考察FITC-BSA在大鼠体内的药代动力学特征，检测过程中激发波长和测定波长同时变化，可有效减少血浆中杂质对FITC-BSA荧光检测的干扰。

3.5.2 核素活体成像技术

正电子发射断层成像技术 (Positron emission tomography, PET) 和单光子发射计算机断层成像术 (Single-photon emission computed tomography, SPECT) 是核医学的两种显像技术。PET与SPECT通过给动物静脉注射少量放射性核素标记的药物，在体外采用特定的检测仪器对射线信号进行收集，从而获得目标分子在体内的实时分布信息。Kameia等[37]以68Ga-DOTA-insulin作为示踪剂，应用PET定量监测了Insulin-CPPs在大鼠体内的肠道吸收与组织分布。结果显示，细胞穿透肽 (CPPs) 的加入有利于胰岛素在肠道的吸收以及在肾、肝脏中的积累。

4 结语与展望

融合蛋白类药物能有效改善小分子蛋白及多肽半衰期短的缺陷，具有长效、多功能性。在生物体内，这类药物具有体内靶向分布、受体介导消除、极少以原型药物形式排泄，血浆蛋白结合率较高等特征。与多肽类药物相比，融合蛋白药物的药动学分析面临着更多的挑战。如何区分游离药物、代谢片段以及结合药物浓度，目前仍是药动学检测分析的一大难点。在对融合蛋白类药物药代动力学进行评价时，应根据这类药物的分子结构、理化性质以及药代动力学特征制订合理的实验方案、选择适当的分析方法，可将多种方法联合使用，以获得药物在体内吸收、分布、代谢和排泄的全面可靠信息。

参考文献
[1] William R. Fusion proteins for half-life extension of biologics as a strategy to make biobetter. BioDrugs, 2015, 29(4) : 215–239. DOI:10.1007/s40259-015-0133-6
[2] Caliceti P, Veronese F M. Pharmacokinetic and biodistribution properties of poly (ethylene glycol)-protein conjugates. Adv Drug Delivery Rev, 2003, 55(10) : 1261–1277. DOI:10.1016/S0169-409X(03)00108-X
[3] Jevsˇevar S, Kunstelj M, Porekar V G. PEGylation of therapeutic proteins. Biotechnol J, 2010, 5(1) : 113–128. DOI:10.1002/biot.v5:1
[4] Tang L, Persky A M, Hochhaus G, et al. Pharmacokinetic aspects of biotechnology products. J Pharm Sci, 2004, 93(9) : 2184–2204. DOI:10.1002/jps.20125
[5] Andersen J T, Pehrson R, Tolmachev V, et al. Extending half-life by indirect targeting of the neonatal Fc receptor (FcRn) using a minimal albumin binding domain. J Biol Chem, 2011, 286(7) : 5234–5241. DOI:10.1074/jbc.M110.164848
[6] O'Connor-Semmes R L, Lin J, Hodge R J, et al. GSK2374697, a novel albumin-binding domain antibody (albudAb), extends systemic exposure of extendin-4:first study in humans-PK/PD and safety. Clin Pharmacol Ther, 2014, 96(6) : 704–712. DOI:10.1038/clpt.2014.187
[7] Sockolosky J T, Kivimäe S, Szoka F C. Fusion of a short peptide that binds immunoglobulin G to a recombinant protein substantially increases its plasma half-life in mice. PLoS One, 2014, 9(7) : e102566. DOI:10.1371/journal.pone.0102566
[8] Pasut G, Veronese F M. Second-generation pharmaceutical proteins-EUFEPS workshop on optimizing biotech medicines. IDrugs, 2007, 10(3) : 162–164.
[9] Bendele A, Seely J, Richey C, et al. Short communication:renal tubular vacuolation in animals treated with polyethylene-glycolconjugated proteins. Toxicol Sci, 1998, 42(2) : 152–157. DOI:10.1093/toxsci/42.2.152
[10] Keizer R J, Huitema A D, Schellens J H, et al. Clinical pharmacokinetics of therapeutic monoclonal antibodies. Clin Pharmacokinet, 2010, 49(8) : 493–507. DOI:10.2165/11531280-000000000-00000
[11] Ghetie V, Ward E S. Transcytosis and catabolism of antibody. Immunol Res, 2002, 25(2) : 97–113. DOI:10.1385/IR:25:2
[12] Peters J T. All about Albumin:Biochemistry, Genetics, and Medical Applications. California:Academic Press, 1995.
[13] Roopenian D C, Akilesh S. FcRn:the neonatal Fc receptor comes of age. Nature Rev Immunol, 2007, 7(9) : 715–725. DOI:10.1038/nri2155
[14] Baker K, Qiao S W, Kuo T, et al. Immune and non-immune functions of the (not so) neonatal Fc receptor, FcRn. Semin Immunopathol, 2009, 31(2) : 223–226. DOI:10.1007/s00281-009-0160-9
[15] Kagan L, Turner M R, Balu-Iyer S V, et al. Subcutaneous absorption of monoclonal antibodies:Role of dose, site of injection, and injection volume on rituximab pharmacokinetics in rats. Pharm Res, 2012, 29(2) : 490–499. DOI:10.1007/s11095-011-0578-3
[16] Kagan L, Mager D E. Mechanisms of subcutaneous absorption of rituximab in rats. Drug Metab Dispos, 2013, 41(1) : 248–255. DOI:10.1124/dmd.112.048496
[17] Ledger, Tucker I G, Walker G F. The metabolic barrier of the lower intestinal tract of salmon to the oral delivery of protein and peptidedrugs. Journal of Controlled Release, 2002, 85(1-3) : 91–103. DOI:10.1016/S0168-3659(02)00289-4
[18] 周治东, 李维娜, 王存, 等. GFE-1多肽与重组人肿瘤坏死因子α融合蛋白的构建及其体外活性和体内分布研究. 生物技术通讯, 2013, 24(2) : 178. Zhou Z Z, Li W N, Zhang C, et al. Construction, bioactivity and distribution of GFE-1-rmhTNF fusion protein. Letters in Biotechnology, 2013, 24(2) : 178.
[19] Liu S. Radiolabeled cyclic RGD peptides as integrin αvβ3-targeted radiotracers:maximizing binding affinity via bivalency. Bioconjug Chem, 2009, 20(20) : 2199.
[20] 郭建军, 王丽丽, 张琪, 等. 单克隆抗体药物的药代动力学研究进展. 中国药理学通报, 2016, 32(2) : 172–176. Guo J J, Wang L L, Zhang Q, et al. Progress on pharmacokinetic studies of therapeutic monoclonal antibodies. Chinese Pharmacological Bulletin, 2016, 32(2) : 172–176.
[21] Luu K T, Bergqvist S, Chen E, et al. A model-based approach to predicting the human pharmacokinetics of a monoclonal antibody exhibiting taret-mediated drug disposition. J Pharmacol ExpTher, 2012, 341(3) : 702. DOI:10.1124/jpet.112.191999
[22] Hall M P, Gegg C, Walker K, et al. Ligand-binding mass spectrometry to study biotransformation of fusion protein drugs and guide immunoassay development:Strategic approach and application to peptibodies targeting the thrombopoietin receptor. AAPS J, 2010, 12(4) : 576–585. DOI:10.1208/s12248-010-9218-9
[23] Yin H H, Zhu Y Y, Xu L G, et al. Ultrasensitive detection of melamine based on a DNA-labeled immunosensor. Biosens Bioelectron, 2013, 42(1) : 51.
[24] Robert E M, Arvind G K. Combined use of immunoassay and two dimensional liquid chromatography mass spectrometry for the detection and identification of metabolites from biotherapeutic pharmacokinetic samples. J Pharmaceut Biomed, 2010, 53(3) : 221. DOI:10.1016/j.jpba.2010.04.028
[25] 汪晨, 吴洁, 宗晨, 等. 化学发光免疫分析方法与应用进展. 分析化学, 2012, 40(1) : 3–10. Wang C, Wu J, Zong C, et al. Chemiluminescent immunoassay and its application. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2012, 40(1) : 3–10.
[26] 农天雷. 常用化学发光免疫分析技术及其特点. 现代医药卫生, 2011, 27(14) : 2156–2158. Nong T L. Commonly used analysis technology and characteristics of Chemiluminescenct immunoassay. Modern Medicine & Health, 2011, 27(14) : 2156–2158.
[27] Djeneba D, Joseph B, Margolick J L, et al. Multiplex measurement of proinflammatory cytokines in human serum:comparison of the Meso Scale Discovery electrochemiluminescence assay and the Cytometric Bead Array. J Immunol Methods, 2011, 372(1-2) : 71–77. DOI:10.1016/j.jim.2011.06.033
[28] 姜国华, 刘忠敏. 同位素示踪法研究125I-NGF在小鼠体内的吸收、分布及排泄. 现代仪器, 2012, 18(1) : 10. Jiang G H, Liu Z M. Study on absorption distribution and elimination of nerve growth factor in mice by radioactivity isotope tracing method. Modern Instruments, 2012, 18(1) : 10.
[29] Ferraiolo B L, Mohler M A, Gloff C A. Protein Pharmacokinetics and Metabolism. NewYork, Plenum Press, 1992 : 82–88^1-10.
[30] Armando A R, Ludger S R, Zaharenko A J, et al. Combining multidimensional liquid chromatography and MALDI-TOF-MS for the fingerprint analysis of secreted peptides from the unexplored sea anemone species Phymanthus crucifer. J Chromatogr B, 2012, 903(16) : 30.
[31] Navarrete A, Paz M, Martínez A, et al. Simultaneous online SPEHPLC-MS/MS analysis of docetaxel, temsirolimus and sirolimus in whole blood and human plasma. J Chromatogr B, 2013, 921(6) : 35.
[32] 彭晓云. LC-MS/MS测定人血清中英夫利昔单抗血药浓度方法的建立及临床应用. 广州: 华南理工大学, 2015. Peng X Y. Development and validation of LC-MS/MS method for the quantitation of infliximab in human serum. Guangzhou:South China University of Technology, 2015. http: //www. cnki. com. cn/Article/CJFDTotal-ZGYA201614013. htm
[33] Jiang H, Xu W, Titsch C A, et al. Innovative use of LC-MS/MS for simultaneous quantitation of neutralizing antibody, residual drug, and human immunoglobulin G in immunogenicity assay development. Analytical Chemistry, 2014, 86(5) : 2673–2680. DOI:10.1021/ac5001465
[34] Terai T, Nagano T. Fluorescent probes for bioimaging applications. Curr Opin Chem Biol, 2008, 12(5) : 515–521. DOI:10.1016/j.cbpa.2008.08.007
[35] Bentolila L A, Ebenstein Y, Weiss S. Quantum dots for in vivo smal l-animal imaging. Journal of Nuclear, 2009, 50(4) : 493–496. DOI:10.2967/jnumed.108.053561
[36] 覃光炯, 高云华. 同步荧光法测定大鼠血浆中牛血清白蛋白的研究. 影像科学与光化学, 2010, 28(5) : 354–360. Qin G J, Gao Y H. Study on the determination of bovine serum albumin in rat plasma by synchronous fluorescence spectrometry. Imaging Science and Photochemistry, 2010, 28(5) : 354–360. DOI:10.7517/j.issn.1674-0475.2010.05.354
[37] Kameia N, Morishitaa M, Kanayamab Y. Molecular imaging analysis of intestinal insulin absorption boosted by cell-penetr-ating peptides by using positron emission tomography. J Controll Release, 2010, 146(1) : 16. DOI:10.1016/j.jconrel.2010.05.004
长效化融合蛋白药物及其药动学分析技术的研究进展
邵莉, 马晓慧, 王相阳, 徐寒梅