Sma的典型代表是来源于Serratia marcescens^[1]的非特异性内切核酸酶^[2]。它能够降解各种形式DNA和RNA，对单链、双链、线状、环状和超螺旋形式的DNA和RNA的磷酸二酯键均具有很高的活性，产生5′-磷酸核苷酸或5′-磷酸寡核苷酸，且对核酸没有序列要求。无论是实验研究，还是工业用途，Sma都是目前唯一同时有效去除DNA和RNA的酶。

它的优点是能够降解各种形式的DNA和RNA却不会降解蛋白质。可以应用于：(1)降低细菌裂解时核酸释放产生的黏度，并且适用于任何裂解方式，包括溶菌酶、冻融、高压；蛋白质纯化。(2)在大规模的层析纯化时，避免由于大量的核酸吸附在层析介质上降低蛋白质的有效载量从而降低纯化得率。(3)在ELISA、二维电泳和免疫印迹分析中，提高分辨率和回收率。(4)消除重组蛋白、疫苗等生物制品的外源性核酸残留：美国食品和药品管理局(FDA)制定的治疗用重组生物制品生产准则规定，成品的外源性核酸残留量应不超过100pg/剂。因此Sma具有广阔的应用前景。

此类酶在市场中的商品化产品名为Benzonase。目前，该酶主要是在大肠杆菌中表达的，由于该酶具有信号肽，生成的核酸酶一般有少量被分泌到胞外，还有一些在周质和以无活性的包涵体形式存在于胞内。有些工艺采用将包涵体增溶和复性，虽然得到了具有活性的酶，但是比活不高。由于该酶的产量低、工艺烦琐、价格昂贵，限制了其应用范围，需要开发新的工艺来提高其产量及性能。本文主要从提高目的蛋白表达量、提高目的蛋白表达纯度两方面入手，并在改变工艺的同时保证该酶的活性不受影响。

1 材料与方法 1.1 材料

表达载体pET28a-ompA为本实验室构建保存，在pET28a载体融合了信号肽ompA；大肠杆菌(E. coli) BL21(DE3)、DH5α和K12菌株均为本实验室保存。PCR扩增引物由Invitrogen公司合成。Taq酶、限制性内切核酸酶、DNA连接试剂盒、DNA Marker均购自宝生物工程(大连)有限公司；PCR产物纯化试剂盒，质粒DNA小量抽提试剂盒购自上海Sangon公司；Bradford蛋白浓度测定试剂盒购自ThermoFisher Scientific公司；离子交换层析柱购自GE healthcare公司。其他生化试剂：琼脂糖，丙烯酰胺，甲叉丙烯酰胺，十二烷基磺酸钠，过硫酸铵，四甲基乙二胺，卡那霉素，鱼精DNA等均为Amresco进口分装。高氯酸，乙醇，乙酸购自上海国药集团。

1.2 方法

1.2.1 重组质粒ompA-Sma的构建

根据Sma的编码基因序列，由Invitrogen公司合成两条引物Sma-Fp：5′GGCGCATATGGCTAGCGCTGATAC3′(划线处为NdeI酶切位点)；Sma-Rp：5′GGCTAAGCTTAACGGTCTACTACAAG 3′ (划线处为HindIII酶切位点)。

PCR反应条件为：95℃预变性5min、95℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸1min、30个循环后72℃延伸10min。将从大肠杆菌K12中扩增出的Sma基因的PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳回收。按照PCR产物纯化试剂盒说明手册对PCR产物进行纯化后，用内切酶NdeI和HindIII对pET28a-ompA质粒和纯化产物进行双酶切，酶切反应体系置于37℃恒温水浴中反应4h。酶切产物用2%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收pET28a-ompA和Sma的目的片段，T4连接酶于20℃恒温反应4h。将连接产物转化至已制备好的DH5α感受态细胞中，然后将菌液涂于含Kan(终浓度50μg/ml)的LB平板上，37℃恒温箱内倒置培养12~16h。挑取单个菌落至含Kan的LB培养基试管中，37℃、180r/min过夜培养。按照前述PCR条件对菌液进行鉴定，并将鉴定为阳性的重组质粒送Invitrogen公司测序鉴定。

1.2.2 Sma的表达条件筛选

构建成功的质粒pET28a-ompA-Sma转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，然后将菌液涂于含Kan(终浓度50μg/ml)的LB平板上，37℃恒温箱内倒置培养12~16h。挑取单个菌落至含Kan的5ml LB培养基试管中，37℃，180r/min过夜活化。次日按比例将菌液转接到100ml含Kan的LB培养液锥形瓶中，37℃、180r/min培养至OD₆₀₀≈0.4时，降低温度至25℃后加入IPTG(终浓度0.1mmol/L)进行诱导。继续培养4h后离心收集菌体，菌体称重记录。同时，另取一管过夜培养的活化菌液5ml，3 000r/min离心5min后弃上清。菌体用5ml M9培养液轻柔混悬清洗后，3 000r/min离心5min后弃上清。按比例将清洗后菌液转接到100ml含Kan的M9培养液锥形瓶中。同上述LB培养液条件培养诱导，最后收集菌体并称重。

1.2.3 Sma的提取

将LB和M9培养后的菌体分别在25mmol/L Tris-HCl、500mmol/L sucrose、1mmol/L EDTA，pH8.0的缓冲液重悬至OD₆₀₀≈5，冰浴30min，14 000r/min离心5min。沉淀用同体积的25mmol/L Tris-HCl、1mmol/L EDTA，pH8.0的缓冲液重悬，冰浴30min，18 000r/min离心10min。上清即为含目的蛋白粗提物的溶液。取不同培养基表达前后菌体及提取后上清样品跑SDS-PAGE电泳，比较诱导表达量及可溶提取量。

1.2.4 Sma粗提蛋白的活性定义

将待测底物鱼精DNA溶解于50mmol/L Tris、2mmol/L MgCl₂，0.1mg/ml BSA，pH8.0的缓冲液中，鱼精DNA终浓度为1μg/μl。反应总体系为：Sma粗提蛋白溶液12.5μl，含鱼精DNA(1μg/μl)的缓冲液250μl。空白体系为：25mmol/L Tris-HCl、1mmol/L EDTA，pH8.0的缓冲液12.5μl，含鱼精DNA(1μg/μl)的缓冲液250μl。将反应管和空白管在37℃中水浴，分别间隔15min、30min、45min、60min取样50μl并加入50μl高氯酸(4%)。将此样品在冰中放置30min后14 000r/min离心6min。取离心后上清测A₂₆₀。代入公式蛋白质活性(U/μl)=△A₂₆₀×39 375/t计算。将4次计算后的值取平均，即为Sma粗提蛋白的活性(U/μl)。

1.2.5 Sma蛋白的纯化和保存

通过表达、可溶及活性的综合比较，挑选较佳培养基条件下的蛋白质粗提物在25mmol/L Tris、20mmol/L NaCl，pH8.0的缓冲液中透析过夜。将HiTrap DEAE FF柱与HiTrap CM FF柱串联，用25mmol/L Tris、20mmol/L NaCl，pH8.0缓冲液平衡层析柱。缓慢上样后，再用平衡缓冲液洗柱至平衡。之后，用25mmol/L Tris、1mol/L NaCl，pH8.0缓冲液洗柱至平衡。用20mmol/L乙酸钠、20mmol/L NaCl，pH5.6缓冲液平衡Resource S柱。将上一步过柱后流穿液用乙酸调至pH5.6后上Resource S柱。上样后用平衡缓冲液洗柱。含20mmol/L NaCl至100mmol/L NaCl的20mmol/L乙酸钠，pH5.6的缓冲液线性梯度洗脱。最后用20mmol/L乙酸钠、500mmol/L NaCl，pH5.6缓冲液洗脱。取各上样及洗脱组分制电泳样，SDS-PAGE分析结果及纯度。

收集纯度大于95%的目的蛋白洗脱组分在100mmol/L Tris、40mmol/L NaCl、4mmol/L MgCl₂，pH8.0缓冲液中透析过夜。超滤浓缩蛋白质至0.6mg/ml，加入等体积100%甘油混合均匀，至－20℃保存。

1.2.6 成品Sma蛋白的活性定义和活性检测

取1.6μl Sma用50mmol/L Tris、2mmol/L MgCl₂、0.1mg/ml BSA, pH8.0缓冲液稀释至10ml。再取200μl稀释后Sma用上述缓冲液稀释至1ml。其余操作同前“Sma粗提蛋白质的活性定义”。

将待测底物pUC19用50mmol/L Tris、2mmol/L MgCl₂、0.1mg/ml BSA，pH8.0的缓冲液稀释到100ng/μl。将上述定义活性后的Sma粗提蛋白质稀释至1U/μl、0.1U/μl、0.01U/μl、0.001U/μl；采用同样的方法稀释商品化酶至1U/μl。将3μl酶溶液与150μl pUC19混合，37℃水浴反应。分别间隔5min、15min、30min取样10μl，加入6μl loading buffer终止反应。跑2%琼脂糖凝胶电泳，比较底物消化的量。

1.2.7 Sma酶活性能测试反应

缓冲液：50mmol/L Tris、2mmol/L MgCl₂、0.1mg/ml BSA，pH8.0。待测底物鱼精DNA溶解于反应缓冲液中，终浓度1μg/μl。Sma用反应缓冲液稀释31 250倍(稀释方法同上述活性定义)。每个反应体系加入250μl鱼精DNA和12.5μl Sma，阴性对照中以反应缓冲液替代Sma。阳性对照中以商品化酶替代Sma。将三组反应管和空白管分别在4℃、25℃、37℃中水浴反应60min取样50μl并加入50μl高氯酸(4%)。将此样品在冰中放置30min后14 000r/min离心6min。取离心后上清测A₂₆₀。检测温度对Sma酶活影响并比较商品化酶与Sma在同等温度条件下性能优劣。

2 结果 2.1 重组质粒ompA-Sma的构建鉴定

构建的重组质粒pET28a-ompA-Sma经PCR鉴定，大小一致，约810bp。将筛选的阳性质粒送上海英骏测序，证实插入序列的正确。

2.2 Sma的表达条件筛选

重组质粒pET28a-ompA-Sma经IPTG诱导后及渗透休克提取总蛋白质。SDS-PAGE结果显示，M9培养基与LB培养基(图 1)诱导后在27kDa左右皆出现明显条带，与预计的蛋白质条带大小一致。仅从诱导后的目的蛋白条带对比，Sma蛋白表达量差异不大。但从总蛋白质量条带对比来看，LB培养基诱导后杂蛋白质量相比于M9培养基诱导后多。从渗透休克提取后的上清和沉淀来看，LB培养基中目的蛋白在上清和沉淀中分布较均匀，M9培养基中目的蛋白主要在上清中。综上所述，M9培养基表达的Sma蛋白相比于LB培养基可溶性更好且纯度更高。

2.3 Sma粗提蛋白的活性定义

根据1.2.4中公式蛋白质活性(U/μl)=△A₂₆₀×39 375/t，检测经LB培养得到的Sma粗提蛋白质活性为63U/μl，经M9培养得到的Sma粗提蛋白质活性为118U/μl。表明，经M9培养得到的Sma粗提蛋白活性更高。综合2.2及2.3结果，挑选M9培养基条件下的蛋白质粗提物进行下一步纯化。

2.4 Sma蛋白的纯化

各层析柱纯化的蛋白质样品及洗脱组分经SDS-PAGE分析结果显示，第一次HiTrap DEAE FF柱与HiTrap CM FF柱串联纯化后，大量杂蛋白质被层析柱吸附，Sma蛋白存在于流穿液中。流穿液经第二次Resource S柱纯化后，Sma蛋白在NaCl浓度20~100mmol/L线性梯度中洗脱，Bradford法测浓度后计算蛋白质产量为7mg/L，纯度大于95%(图 2)。

2.5 成品Sma蛋白的活性定义和活性检测

根据1.2.4中公式蛋白质活性(U/μl)=△A₂₆₀×39 375/t，得到的Sma蛋白活性为273U/μl，高于商品化产品的250U/μl。

根据1.2.8中检测方法检测成品Sma蛋白活性，2%琼脂糖凝胶电泳分析结果显示，3U的Sma可在5min内将15μg底物消化完全(图 3)。0.3U的Sma可在15min内将15μg底物消化完全(图 4)。Sma的活性不低于商品化产品。

2.6 Sma酶活性能测试

根据1.2.9 Sma酶活性能测试，收集不同温度条件下酶活反应终止后A₂₆₀数据(图 5)显示，酶在4℃时几乎没有活性，随着温度的升高，酶的活性逐渐上升。相同温度条件下，Sma的活性高于Benzonase。

3 讨论与分析

本研究拟解决的主要问题是提高目的蛋白表达量和目的蛋白纯度，在改变工艺的同时保证该酶的活性不受影响。

第一，周质空间的蛋白质^[3]含量低, 蛋白酶活性要比胞质中低, 使所表达的蛋白质能避免胞内降解从而稳定地存在, 有利于目标蛋白的浓缩。对周质分泌型菌体采用定向释放技术, 使细胞外膜破损而不损害细胞内膜, 定向释放周质空间的蛋白质^[4], 从而使下游纯化简单有效, 使来自宿主菌的污染减小到最低。将信号肽ompA与目的蛋白融合构建至表达载体^[5]，大肠杆菌有内膜和外膜组成的双层膜结构, 在内膜和外膜之间的区域即所谓的周质(periplasmic space) ^[6]。利用大肠杆菌系统，在外源基因蛋白序列的N端融合一段细菌蛋白的疏水信号肽，可将目的蛋白运送到周质空间，经信号肽酶将信号肽切除后，即可获得与天然蛋白一致的构象(不含N端多余的甲硫氨酸)^[7]。E. coli的细胞周质中含有一系列的酶，并提供了一个氧化的环境，这些都有利于二硫键的正确形成^[8]，促进蛋白质的正确折叠，使有活性蛋白质的产量得到提高。

第二，采用极限培养基^[9-10]即仅含碳水化合物(提供碳源和能量)和提供氮、磷、微量元素的无机盐培养基进行蛋白质表达，一方面由于表达时提供的养分有限，蛋白质缓慢表达不易形成包涵体，提高了蛋白质的可溶性；另一方面，用此类培养基表达的蛋白质中的杂蛋白质含量更少。

本研究从这两个方面提高了蛋白质的纯度，配合有效的纯化方案，获得了>95%纯度的目的蛋白。