2016, Vol. 36文章信息
- 裴丽丽, 黄芳, 李瑰婷, 庞书英, 任文华.
- PEI Li-li, HUANG Fang, LI Gui-ting, PANG Shu-ying, REN Wen-hua.
- 鲫鱼TNFSF13b (BAFF)基因的克隆、可溶性表达及生物学功能分析
- Molecular Cloning, Expression and Functional Analysis of TNFSF13b (BAFF) Gene in Goldfish, Carassius auratus
- 中国生物工程杂志, 2016, 36(12): 21-27
- China Biotechnology, 2016, 36(12): 21-27
- http://dx.doi.org/DOI:10.13523/j.cb.20161204
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文章历史
- 收稿日期: 2016-06-23
- 修回日期: 2016-07-25
2. 南京师范大学生命科学学院 南京 210046
2. Jiangsu Province Key Laboratory for Molecular and Medical Biotechnology, College of Life Sciences, Nanjing Normal University, Nanjing 210023, China
BAFF (B细胞活化因子，也被称为BLyS, TALL-1, THANK, zTNF4, 或TNFSF13b)是一种新型的肿瘤坏死因子家族的配体，属于TNF (肿瘤坏死因子)家族成员[1-4]。TNF家族成员及其受体在免疫系统中起重要作用[5]。而BAFF在B细胞存活，增殖和分化中起着主要作用[6]。BAFF是一种Ⅱ型膜结合蛋白，经弗林蛋白酶水解后可以获得可溶性的三聚体配体[7]。非淋巴细胞(唾液腺上皮细胞，星形胶质细胞和成纤维样滑膜细胞)和上皮细胞包括支气管和鼻腔上皮细胞可以诱导BAFF蛋白的分泌，但BAFF蛋白主要由骨髓细胞(巨噬细胞，单核细胞和树突状细胞)分泌[8-10]。先天免疫细胞和某些淋巴细胞分泌的BAFF蛋白在免疫应答中发挥重要作用。BAFF氨基酸序列与APRIL (增殖诱导配体)具有33%的相似度，与TNF-α具有20%的相似度[11]。通过弗林蛋白酶切割获得的BAFF C-末端的胞外结构域是具有生物活性的可溶性因子[11]。目前研究结果表明，BAFF促进B细胞发育和存活的受体主要是BAFF-R [12]。
鲫鱼在亚欧地区是一种非常流行的商品鱼，由于它们具有生长迅速，高效的饲料转化率和较高的市场价值，所以是重要的水产养殖品种。在国内，鲫鱼具有很高的市场价值，是养殖业的主要品种之一。目前，鲫鱼的遗传和免疫学知识很少有人研究，所以对鲫鱼的免疫学研究有助于养殖业的发展。我们成功克隆了鲫鱼BAFF的全长cDNA序列。构建了重组表达载体，获得可溶性Nus-His-CasBAFF蛋白。体外实验证明，可溶性Nus-His-CasBAFF蛋白能够促进鲫鱼B淋巴细胞的存活。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物、细胞和宿主菌鲫鱼(500~700g)是从中国江苏南京惠民桥市场购买。淋巴细胞是用淋巴细胞分离液(BD Pharmingen，USA)从鲫鱼脾脏中分离获得。高于97%纯度的B淋巴细胞是用抗CD19磁性氟珠(购自Miltenyi)，从新鲜的鲫鱼脾细胞悬浮液中分离获得。大肠杆菌E.coli、Top10、BL21和SUMO载体由本实验室保存；pMD19-T载体购于TaKaRa公司。
1.1.2 试剂动物组织RNA提取试剂盒(RNeasy Mini Kit, Qiagen)；PrimeScriptTM 1st Strand cDNA合成试剂盒、pMD19-T载体试剂盒、SMARTTMRACE cDNA扩增试剂盒、Taq DNA聚合酶、感受态细胞制备试剂盒、蛋白Marker、rTaq酶、限制性内切酶等均购自TaKaRa公司；鼠His6一抗，辣根过氧化酶标记的山羊抗鼠IgG购自TIANGEN公司；FITC标记的羊抗鼠IgG抗体(R & D Systems Inc.，USA)；所有引物合成及测序由上海英俊公司完成。
1.2 方法 1.2.1 鲫鱼脾脏总RNA的提取利用动物组织RNA提取试剂盒，按照说明书操作，提取鲫鱼脾脏细胞的总RNA。
1.2.2 鲫鱼BAFF基因的克隆通过序列比对分析已知的斑马鱼，虹鳟鱼，草鱼和大西洋鲑鱼BAFF cDNA序列，设计2对简并引物：第一对为CaBAFF 1和CaBAFF 2；第二对为CaBAFF 3和CaBAFF 4 (表 1)。用第一对引物进行RT-PCR；然后用RT-PCR的产物为模板，以第二对引物进行二次PCR，以获得CaBAFF的中间片段。扩增参数：95 ℃，5 min；35个循环(94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min)；72 ℃，7 min。进行琼脂糖凝胶电泳，观察结果。按Axygene公司的DNA胶回收试剂盒操作进行割胶回收DNA片段。分离纯化后的DNA片段采用TA克隆方法装入pMD-19T载体，转化至E.coli Top10细胞中后送英俊公司测序。用clastalW软件对CaBAFF序列和其他已知物种BAFF序列进行序列比对。
| Primer | Sequence (5′-3′) |
| CaBAFF 1 | CTNTCTGCNNTGTCTCTNTACC |
| CaBAFF 2 | GCACCAAANAANGTNNCNTCTCC |
| CaBAFF 3 | GACAGNACNTTTGCNATGGG |
| CaBAFF 4 | CNCCNAANAANGTGGCGTCNCC |
| GSP-U5′ | CATGGGTGATGAAATGCCACTGAAGTGT |
| GSP-N5′ | ATCAGAAGCTCCAGTCTGTCCCCAGAGT |
| GSP-U3′ | TCCGCTGTATTCAGAGCATGAATCGAGT |
| GSP-N3′ | CTACACTGGAGGCCTAGTGAAGTTGGAC |
| QCaBAFF1 | ATGCCTGTTGAAGATGTTGGT |
| QCaBAFF2 | TCAGGCCAGTTGTATTGCTCCT |
| RT-CaF | CAGACCATACTGTCCTGTCA |
| RT-CaR | GAAGGCCTTCCTCTTTGATT |
| RT-G1 | GAGCTGAATGGGAAGCTCAC |
| RT-G2 | GGAGGAGTGGGTGTCACTGT |
| CaBAFF-F | GAAGGCCTGCGGGACACTAGAAGAAGTGG |
| CaBAFF-R | CCCAAGCTTCACTAGGCCTCCAGTGTAGCATGT |
| UPM (long) | CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT |
| UPM (short) | CTAATACGACTCACTATAGGGC |
| NUP | AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG |
| Notes: (1) Degeneracy bases, N=A or C or G or T; (2) the underlined part of the primer is restriction endonuclease (StuⅠ or Hind Ⅲ) site | |
1.2.3 快速扩增CaBAFF的cDNA末端(RACE)
根据上述得到的CaBAFF同源性片段设计两对RACE引物：5′端嵌套引物为GSP-U5′和GSP-N5′；3′端嵌套引物为GSP-U3′和GSP-N3′ (见表 1)。然后根据SMARTTM RACE cDNA扩增试剂盒扩增5′和3′ RACE cDNA，利用基因特异性引物GSP、UPM和NUP分别扩增CaBAFF全长基因的5′端和3′端(包括5′和3′非编码区)。
1.2.4 CaBAFF全长cDNA序列的拼接和鉴定根据获得的全长序列开放阅读框(ORF)首尾末端设计一对特异性引物：QCaBAFF1和QCaBAFF2(表 1)，一步PCR法扩增CaBAFF编码区全长序列。扩增所得片段TA克隆挑选阳性菌落送去测序，由5个克隆确定。
1.2.5 生物信息学分析对克隆所得CaBAFF cDNA序列进行生物信息学分析，使用以下软件和网站：(1)从NCBI网站获得BAFF基因序列、氨基酸序列，以及CaBAFF的开放阅读框(open reading frame, ORF)，并对相应的氨基酸序列进行预测；(2)使用ClastalW软件进行多重比对分析。
1.2.6 Real-time qPCR检测CaBAFF的组织分布解剖鲫鱼，提取脾、心、肝、肾、鳃、肠等组织的总RNA，用Primer 3 Input软件设计鲫鱼BAFF引物如下：RT-CaF和RT-CaR (表 1)；内参GAPDH引物：RT-G1和RT-G2 (表 1)。Real-time PCR反应程序：94℃，5 min；40个循环(94℃，15 s；62℃，20 s；72℃，15 s)。分别取3 μl PCR扩增产物，以2﹪的琼脂糖凝胶进行检测PCR产物是否为单一特异性条带。
1.2.7 融合表达载体SUMO-CasBAFF的构建据CaBAFF的胞外可溶片段设计一对含有SUMO酶切位点的基因特异性引物，扩增可溶性CaBAFF片段(命名为CasBAFF)，引物如下：CaBAFF-F (StuⅠ site)和CaBAFF-R (HindⅢ)(表 1)。PCR反应程序：94 ℃ 5 min，35 cycle (94 ℃ 30 s；54 ℃ 30 s；72 ℃ 1 min)，72 ℃, 7 min。纯化回收PCR产物。StuI、HindⅢ双酶切PCR产物与SUMO载体，进行连接，构建SUMO-CasBAFF表达载体。
1.2.8 空载体SUMO标签蛋白及重组蛋白的体外表达及鉴定首先分别将SUMO标签(即Nus-His标签蛋白)及测序正确的连接产物转化入大肠杆菌BL21(DE3)，分别选取含SUMO标签及重组体的表达菌株，置于LB培养基中(加入Kan+)，37 ℃，220 r/min培养，加入IPTG至终浓度为0.2 mmol/L，16℃，100 r/min振荡培养24 h，分别诱导Nus-His标签蛋白及Nus-His-CasBAFF蛋白的表达。超声破碎分离上清和沉淀，用镍柱亲和层析法分别获得Nus-His标签蛋白及可溶性的Nus-His-CasBAFF蛋白，用SDS-PAGE跑胶鉴定，然后用1× PBS (pH8.0)对目的蛋白液进行透析。经Western blotting鉴定纯化目的蛋白。经测定获得Nus-His标签蛋白浓度为1.342 mg/ml; Nus-His-CasBAFF蛋白浓度为1.125 mg/ml。
1.2.9 激光共聚焦实验将纯化的鲫鱼脾脏B淋巴细胞(106cell/ ml)放到含10%FBS的RPMI 1640培养基中培养。利用免疫荧光染色确定Nus-His-CasBAFF蛋白与鲫鱼脾淋巴B细胞的结合。37℃下，用Nus-His-CasBAFF蛋白(8 μg/ml)或Nus-His标签蛋白(作为对照)孵育30 min。然后将细胞用小鼠抗His抗体(TIANGEN)(1:1 000)孵育1小时，用PBS (磷酸盐缓冲盐水)缓冲液洗涤3次，然后用FITC标记的鼠IgG二抗与培养物(1:1 000)在37℃，孵育30 min。洗涤3次，使用激光共聚焦扫描显微镜分析荧光的分布(Leica TCS SP5; excitation, 488 nm; emission 522 nm)。
1.2.10 Nus-His-CasBAFF蛋白生物活性测定实验采用MTT法对已获得的纯化的Nus-His-CasBAFF蛋白进行生物学活性检测，检测其对鲫鱼B淋巴细胞的作用，并以Nus-His标签蛋白作为对照。
2 结果 2.1 鲫鱼全长CaBAFF cDNA序列和预测的氨基酸序列将RT-PCR和RACE-PCR扩增得到的片段拼接后获得1 639bp的完整cDNA片段(图 1)。经BLAST比对证实其为CaBAFF基因的全长cDNA序列，此序列已递交到GenBank数据库(GenBank Accession No. JF798633)。
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| 图 1 鲫鱼CaBAFF基因的cDNA序列和氨基酸序列 Figure 1 The nucleotide and deduced amino acid sequences of CaBAFF cDNA GenBank accession number JF798633, the stop codon is indicated by asterisk "*" |
CaBAFF的全长cDNA序列分析发现，它是由一个408bp的5′末端非编码区(5′-UTR)，大小为795bp的开放阅读框(ORF)，和一个438bp的3′末端非编码区(3′-UTR)3部分组成，共编码264个氨基酸。序列中A+T和G+C的百分比分别是55.5%和44.5%(图 1)。
如图 2a，CaBAFF的全长cDNA编码264个氨基酸，含有跨膜区(23个氨基酸)和胞外结构域组成的茎区(含144个氨基酸)和一个TNF结构域(图 2a)。鲫鱼和草鱼(No. AGG11791.1)，斑马鱼(No. NP_001107062.1)，大西洋鲑(No. NP_001135232.1)或虹鳟(No. NP_001118036.1)之间的氨基酸序列同源的比例为85%，77%，59 %，59%(图 2b)。鲫鱼蛋白质的分子量为29.826 kDa，等电点(PI)为5.72。利用SignalP软件分析表明鲫鱼CaBAFF没有信号肽，缺乏信号肽表明CaBAFF是一种II型膜蛋白，是典型的TNF配体家族的成员。氨基酸结构分析显示，CaBAFF蛋白具有保守性的长D-E环(以下简称“Flap”)和三个半胱氨酸残基(Cys121，Cys212和Cys224)(图 2b)。
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| 图 2 CaBAFF蛋白结构域分析及同源性序列比对 Figure 2 The CaBAFF domain structure predicted and amino acid sequence alignment (a) The CaBAFF domain structure predicted by SMART. Transmembrane segments were predicted by the TMHMM2 program (┃). Highly conserved regions of TNF homology are shown in pink. Amino acid numbers of the domain boundaries for CaBAFF are labelled on the above (b) Amino acid sequence alignment of BAFF from several species |
用实时荧光定量PCR以GAPDH作为内参分析CaBAFF的mRNA在不同组织中的相对表达量。SYBR Green实时荧光定量PCR分析表明CaBAFF的mRNA在心(heart)、肝(liver)、脾(spleen)、鳃(gill)、肾(kidney)、小肠(intestine)均有表达。但是mRNA水平在不同的组织中表达有差异如图 3所示。其中在脾脏中mRNA表达量最高，其次是肾脏，鳃，肝脏，小肠，表达量最低的是心脏。脾脏是机体最大的免疫器官，这些结果表明CaBAFF在免疫系统中起重要作用。
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| 图 3 鲫鱼BAFF基因在各个组织中的表达 Figure 3 Expression analysis of the CaBAFF gene in various tissues analyzed using real time qPCR Data are 2-ΔΔCt levels calculated relative to the tissue with lowest expression (Heart) set to 1.00, normalized against GAPDH mRNA levels. Vertical bars represent the mean±standard error (SE). Three independent experiments were performed |
为检测蛋白的生物学活性，将Nus-His-CasBAFF蛋白表达于大肠杆菌BL21(DE3)。经SDS-PAGE检测(图 4)显示，在大约34 kDa处为目的蛋白，经IPTG诱导24 h达到最大表达量。经Ni2+-NTA柱纯化后，收集的蛋白经SDS-PAGE分析，以抗His标签为标记的Western blotting鉴定显示，纯化后的Nus-His-CasBAFF蛋白能与抗鼠His单抗发生特异性反应，结果如图 4。经测定获得Nus-His标签蛋白浓度为1.342 mg/ml; 获得Nus-His-CasBAFF蛋白浓度为1.125 mg/ml。
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| 图 4 SDS-PAGE分析重组SUMO-CasBAFF蛋白在大肠杆菌中的表达 Figure 4 SDS-PAGE analysis of CasBAFF protein expressed in E. coli BL21 (DE3) Lane 1 indicates cell lysates of bacteria transformed with SUMO-CasBAFF without IPTG induction. Lane 2 represents cell lysates of bacteria transformed with SUMO-CasBAFF under IPTG induction (0.2 mmol/L) induction at 16℃ for 24 h. Lane 3 shows the first fusion protein purified by the Ni-IDA affinity chromatography. Lane 4 shows the secondary purified protein from the first purified protein by the Ni-IDA affinity chromatography. Lane 5 indicates Western blotting analysis of purified CaBAFF using mAb against His6-tag. M is low molecular weight marker |
实验中用激光共聚焦显微镜检测Nus-His-CasBAFF蛋白与B淋巴细胞的结合。如图 5所示，Nus-His-CasBAFF融合蛋白与B淋巴细胞发生膜结合而显示出环形的绿色荧光，而Nus-His标签蛋白因为没有与B淋巴细胞结合而不显示环形绿色荧光，因此，实验结果表明，与B淋巴细胞结合的是鲫鱼BAFF的可溶性区段。
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| 图 5 Nus-His-CasBAFF体外结合B淋巴细胞实验 Figure 5 Confocal laser microscopic images of SUMO-CasBAFF bound to goldfish spleen B cells Visualised by indirect immunofluorescence staining. Images were captured using a CCD camera with identical settings below the saturation limits. Cells were treated with SUMO-CasBAFF (A, B). (A) Image with transmitted light (phase contrast) and FITC fluorescence (green) following excitation at 488 nm (B) The same image merged with FITC fluorescence (green) following excitation at 488 nm; Cells were treated with SUMO tag protein as a control (C, D) (C) Image with transmitted light (phase contrast) and FITC fluorescence (green) following excitation at 488 nm (D) The same image merged with FITC fluorescence (green) following excitation at 488 nm |
为了确定Nus-His-CasBAFF对鲫鱼B淋巴细胞的存活/增殖的影响，不同浓度的Nus-His-CasBAFF蛋白与抗小鼠IgM一起处理新鲜分离的B淋巴细胞进行培养。结果表明，Nus-His-CasBAFF在体外可促进鲫鱼B淋巴细胞的存活/增殖(图 6)。PBS和Nus-His标签蛋白作为阴性对照没有任何效应(图 6)。
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| 图 6 Nus-His-CasBAFF对鲫鱼B淋巴细胞的影响 Figure 6 The SUMO-CasBAFF promoted survival of goldfish splenic lymphocytes MTT assay showed that SUMO-CasBAFF stimulated survival of goldfish splenic lymphocytes in vitro. Freshly isolated goldfish lymphocytes were cultured with indicated dose of SUMO-CasBAFF. SUMO and PBS were used as control. Three independent experiments were performed. Values were expressed as mean counts±standard error (SE). ***pb0.001, and ** pb0.01, compared to the PBS-treated group |
本实验中，我们成功地从鲫鱼脾脏中克隆得到了B细胞活化因子(BAFF)的cDNA序列，CaBAFF的全长cDNA由1639个碱基，包括一个795 bp的开放阅读框编码264个氨基酸(图 1)。预测蛋白质的分子量为29.826 kDa，并且经SDS-PAGE检测(图 4)显示，在大约34 kDa处存在目的蛋白，与预测结果相符。
与其他报道的BAFF蛋白相似，CaBAFF编码的蛋白质包含一个有23个氨基酸组成的跨膜结构域的(TMD)(图 2a)，预测的弗林蛋白酶切割位点RKKR (R-X-R/K-R)(图 2b)和3个保守的半胱氨酸残基(Cys121，Cys212和Cys224)(图 2b)。但在几个硬骨BAFF序列中，没有弗林蛋白酶切割位点(如斑马鱼和虹鳟鱼)。CaBAFF没有信号肽说明其是一种II型跨膜蛋白，是典型的TNF配体家族的成员。
序列比对显示，鲫鱼和草鱼，斑马鱼，大西洋鲑和虹鳟之间的氨基酸序列同源性分别为85%，77%，59%，59%(图 2b)。如图 2b所示，BAFF的胞外氨基酸序列比细胞内更加保守。CaBAFF的胞外功能区与预测的受体结合位点(包括长D-E环和三个保守的半胱氨酸残基)与其他BAFFs具有显著的同源性。这表明，在鱼类中，BAFF的氨基酸序列是比较保守的，并且胞外区比胞内区和跨膜区更保守。
实时荧光定量PCR显示BAFF在鲫鱼脾脏中的表达量最高，这与在人中BAFF的分布是一致的。这些暗示着CaBAFF与人BAFF可能具有类似的功能，CaBAFF可能在鲫鱼的免疫系统中也起着重要的作用。
BAFF结合三种细胞表面受体：BAFF-R，BCMA和TACI。激光共聚焦实验结果显示Nus-His-CasBAFF蛋白能够结合到鲫鱼淋巴细胞的表面。抗IgM与和BCR (B细胞抗原受体)之间的相互作用信号可以触发BAFF受体在B细胞表面的表达。人sBAFF蛋白被证明在体外与抗-IgM共刺激能够促进B细胞增殖[13]。已有研究证实，由于BAFF的高度保守性，功能性的交叉反应不仅存在于哺乳动物和家禽BAFFs之间，而且也在哺乳动物和鱼类BAFFs之间，如斑马鱼BAFF，可结合小鼠BAFF受体，并对小鼠B细胞具有生物活性[14-17]。在这项研究中，MTT分析证实CasBAFF具有促进鲫鱼脾B淋巴细胞的增值。
综上所述，本次实验首次成功地克隆了CaBAFF的全长cDNA序列，分析了序列的蛋白质的结构，检测了其生物活性。我们的研究结果显示，CaBAFF在促进B淋巴细胞的存活/增值中起着重要的作用。本实验的研究结果有助于理解鱼的抗细菌免疫作用，为进一步用重组蛋白来调节鱼类免疫应答提供依据。
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