1 内皮祖细胞的生物学特性

1997年，日本学者Asahara等^[1]首次使用免疫磁珠分选法从人外周血中分离出CD34⁺的EPCs，并证实了EPCs可迁移到缺血组织，并能分化成为成熟ECs，发挥血管新生作用。随后大量的研究发现EPCs不仅存在于外周血中，还存在于骨髓、脐血、胚胎，以及心脏、骨骼肌、血管和脂肪组织中。根据EPCs的细胞表型、出现时间的差异、以及其生物学特性，可以将其分为两种类型:即早期内皮祖细胞(early EPCs)和晚期内皮祖细胞(outgrowth endothelial cells, OECs or ECFCs or late EPCs)^[2]。

early EPCs，大约培养4~7天后出现，细胞形态呈梭形，培养2~3周生长旺盛，4周开始死亡，增殖能力和传代次数有限，表现为单核细胞的特征；late EPCs大约在培养2~3周出现，呈铺路石样或鹅卵石样形态，呈克隆性生长，4~8周生长旺盛，可以长至12周，增殖能力较强，能传30代左右，表现为成熟ECs的特征。此外，尽管两种类型的EPCs都具有血管生成功能，然而，体外试验证实，early EPCs不能从头形成新生血管，也不能嵌入既存的血管结构^[3]，它是通过分泌各种血管生成因子(如vascular endothelial growth factor, VEGF、interleukin-8, IL-8等)，刺激血管生成，而late EPCs是通过并入血管内皮，直接参与血管的生成过程^[4]。Hur等^[2]认为体外培养的late EPCs较early EPCs可产生更多一氧化氮，具有更强的内皮再生功能和体内血管形成能力。

2015年，Minami等^[5]在Hur研究的基础上，进一步将EPCs分为早期内皮祖细胞(early-outgrowth EPCs, EOCs)、中度晚期内皮祖细胞(moderate-outgrowth EPCs, MOCs)、晚期内皮祖细胞(late-outgrowth EPCs, LOCs)和超晚期内皮祖细胞(very late-outgrowth EPCs, VOCs)。EOCs约在培养3~7天出现, MOCs约在培养10~16天出现，LOCs约在培养17~23天出现，以及VOCs约在培养24~30天出现。

目前，关于EPCs表面的特异性标记仍存有争议。早期的研究(Asahara，1997)认为循环EPCs表达造血干细胞标记CD34和内皮细胞标记血管内皮细胞生长因子受体2^[1](KDR or VEGFR2)。近来的研究发现EPCs不仅仅表达CD34和VEGFR2，CD133在EPCs中也有表达。并且，体外扩增培养时，CD133⁺细胞可分化为ECs。因此，目前国际普遍的观点认为EPCs共同表达CD34⁺VEGFR2⁺CD133⁺。然而，无论是单独或结合在一起，这些标记都不是EPCs高度特异的标记，因此，围绕者CD34⁺VEGFR2⁺CD133⁺这个细胞群体，引发了非常激烈的争议(表 1)。

由于CD133仅表达于干/祖细胞上而不表达于成熟ECs上，因此，Peichev等^[6]提出了更令人信服的观点，他们认为CD34⁺VEGFR2⁺CD133⁺是early EPCs的独特性标记，而CD34⁺VEGFR2⁺CD133^-则代表late EPCs细胞群体。值得注意的是，由于early EPCs(CD133⁺/CD34⁺/VEGFR2⁺)同时也表达造血细胞表面标记CD14和CD45，因此，Case等^[7]认为这群细胞并不是真正意义上的EPCs，它更倾向于是CD45⁺造血干细胞，且体外扩增培养时，其不能分化为ECs。Cheng等^[8]通过基因测序分析，对比early EPCs与单核源巨噬细胞的基因谱，发现early EPCs特异表达CD204、CD169、GPNMB以及其它膜蛋白，与单核巨噬细胞极其相似，而late EPCs特异表达CXADR、OSAP、CD106基因水平的标记物，进一步证实了early EPCs并不是真正意义上的EPCs。与early EPCs不同的是，late EPCs还表达CD146、CD31、vWF、血栓调节蛋白(TM)、VE-钙粘素、E-选择素、Flt-1、eNOS等成熟ECs特异性表面标记，因此，Medina等^[9]认为OECs更倾向于是真正意义上的ECs，他们还从转录、蛋白以及超微结构水平证实了OECs具有本质的内皮细胞特性，它可以直接参与损伤后血管的修复。

2 内皮祖细胞的分离、培养及鉴定 2.1 内皮祖细胞的分离培养及培养体系的优化

EPCs不仅存在于外周血中，还存在于骨髓、脐血、胚胎, 以及心脏、骨骼肌、血管和脂肪组织中。然而，这些来源EPCs的数量是非常有限的。例如，健康成人外周血可获得的EPCs细胞数仅为总单核细胞的0.01%~0.0001%。因此，体外扩增培养EPCs以达到足够的细胞数，用于治疗各种缺血性疾病，就显得尤为重要。自从1997年Asahara等^[1]首次从人外周血中分离培养出EPCs以来，针对不同组织来源的EPCs分离培养方法的研究不断涌现，其分离培养体系也得到不断地优化。由于EPCs的定义及其表面标记并没有统一的标准，因此，我们必须承认，目前仍没有一种特异的方法可分离并培养出真正意义上的人类或其他脊椎动物的EPCs，也就是说，EPCs培养体系的优化，仍需要克服许多困难。目前，分离培养EPCs的方法主要有四种：单核细胞贴壁培养法、免疫磁珠分选法、差速贴壁培养法以及差速消化分离法，以下将就每种方法的应用情况、优势及劣势做简要的介绍。

单核细胞贴壁培养法：该法利用密度梯度离心法分离骨髓、外周血或脐血中的单核细胞(MNCs)，直接进行细胞贴壁培养。由于该法操作简单，是目前应用最多，也是最成熟的研究方法。从骨髓^[10]、外周血^[11]、脐血^[12]获取的MNCs接种于胶原蛋白/纤连蛋白/明胶/玻连蛋白包被的培养皿中，2~7天后去除未贴壁细胞，贴壁细胞继续培养，即为EPCs。

免疫磁珠分选法：该法可应用于各种来源EPCs的分离培养，主要利用EPCs表面的特异性抗原(CD34、CD133和VEGFR2等)，表面包被有相应抗体的免疫磁珠与细胞表面相应的分子抗原特异结合来分选EPCs。该法得到的细胞纯度较高，但费用昂贵、分选难度较大、获取的细胞量较少，因此难以满足实验的要求，并且分选后的细胞由于失去了细胞间共生共长的关系而不利于细胞的扩增培养，因此，免疫磁珠分选法难以推广使用。2013年，Hager等^[13]利用此法从脂肪组织中分选出CD133⁺CD34⁺CD31⁺CD146⁺细胞，并通过体外成血管实验证实这群细胞为EPCs。

差速贴壁培养法：此法利用骨髓或外周血基质细胞贴壁较快，而EPCs贴壁较慢的特点来筛选EPCs，将获取的单核细胞接种培养，培养24小时后去除贴壁的细胞，将未贴壁的细胞置于另一培养瓶中继续培养，24小时后去除未贴壁细胞，即为所得的EPCs。该法的分选难度不大、经济、实用性强、对操作要求不高，可能会成为最佳的分离方法。Sekiguchi等^[14]研究发现，骨髓单核细胞(BMMNCs)接种培养24小时后，将贴壁(attached cells, AT)细胞和悬浮(floating cells，FL)细胞分别置于不同的培养瓶中继续培养，发现AT细胞更具有单核/巨噬细胞的特征；而FL细胞则具有内皮样细胞特征，其在体外可以形成稳定的血管样结构，将其移植入心肌梗死模型鼠体内，FL细胞可被寡集到缺血区域边缘，发挥有效的治疗作用，说明了FL细胞更有可能是EPCs。这证实了BMMNCs中的基质细胞贴壁较快，而EPCs贴壁较慢。

差速消化分离法：该法主要应用于脂肪组织EPCs的分离培养，主要是通过胶原酶消化法从脂肪组织中获取脂肪基质细胞(stromal vascular cells, SVF)，将获得的SVF进行接种培养，培养7天后，利用脂肪干细胞(adipose stem cells, ASCs)和EPCs对胰蛋白酶的敏感性不同，ASCs对胰蛋白酶较敏感，在其作用下易于脱落，而EPCs不易脱落，实现ASCs和EPCs分离。但该法对操作技术要求较高，难以重复操作。2015年，Zhou等^[15]利用此法从脂肪组织中分离培养出EPCs，且免疫组织化学染色结果显示分离培养出的EPCs高度表达ECs系表面标记CD31⁺/CD34⁺/ VEGFR-2⁺/Stro-1⁺/eNOS⁺，而单核细胞表面标记CD14、CD45和成纤维细胞表面标记α-SMA表达阴性。

值得注意的是，近年来，初步的临床试验证实EPCs移植治疗各种严重缺血性疾病的疗效是值得肯定的。然而，骨髓、脐血、外周血等，其EPCs(CD34⁺, CD133⁺, CD34⁺/VEGFR2⁺, CD133⁺/VEGFR2⁺ or CD34⁺CD133⁺VEGFR2⁺)的含量是非常少的，尤其是年老或合并有心血管疾病的病人，其EPCs的数量更少，其细胞功能也大大削弱。因此，EPCs培养体系的优化就变得尤为重要。2012年，Masuda等^[16]建立了一种新的培养体系，这种培养体系可大大提高EPCs的数量，并能有效地增强EPCs功能。他们主要是通过优化EPCs的培养条件，即无血清培养基中添加干细胞生长因子(SCF)、促血小板生成素(TPO)、血管内皮生长因子(VEGF)、白细胞介素6(IL-6)和flt-3配体(flt-3 ligand)。EPCs在这种培养体系优化培养7天后，其分化为内皮细胞的潜能增加。同时，内皮祖细胞的血管形成能力增强，其分泌的促血管生长因子(如VEGF、HGF)增多。更重要的是，EPCs的增殖潜能得到了大大的提高。2013年，Bueno-Beti等^[17]通过对比不同的培养条件，以寻找出从外周血获取EPCs的最佳培养体系，他们发现外周血体积为30ml、使用肝素抗凝、培养基质为纤连蛋白、培养基FBS的浓度为20%时，可获得的EPCs数量最多，其EPCs集落出现的时间也最早。

2.2 内皮祖细胞的鉴定

(1) 形态特征:在体外培养时，各时期的EPCs具有不同的形态学特征，刚贴壁的EPCs呈卵圆形的细胞形态，逐渐生长变为呈纺锤形、梭形，即early EPCs，培养2周左右，细胞开始成簇生长，开始出现late EPCs，一般以铺路石样的方式生长。

(2) 标志物检测:一般采用免疫细胞化学、流式细胞检测技术或RT-PCR等检测，主要的表面标记物有VEGFR2(Flk-1/KDR)、CD34、AC133、血管性血友病因子(vWF)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、血管内皮钙粘蛋白(VE-cadherin)等。目前，EPCs的特异性表面标记尚缺乏统一的标准，一般认为VEGFR2⁺CD34⁺AC133⁺三阳性细胞为EPCs。

(3) 细胞功能测定:可以用免疫荧光染色鉴定EPCs，因EPCs在一定条件下可吞噬乙酰化低密度脂蛋白(acLDL-DiI)和结合荆豆凝集素(UEA-1-FITC)，在荧光显微镜下观察吞噬DiI-ac-LDL的EPCs呈红色荧光，FITC-UEA-1呈绿色荧光，若出现双阳性的荧光细胞则鉴定为EPCs；然而，UEA-1也可以结合上皮和间皮细胞。并且，内皮祖细胞在特定的条件下(即将内皮祖细胞接种到Matrigel人工基底膜)，可形成血管腔样的结构。

3 内皮祖细胞与血管形成

血管形成是一个复杂的、综合的过程，其机制目前仍然未能完全理解。在器官胚胎发育和生长、缺血组织血流恢复以及建立肿瘤血液供应等过程，血管形成是至关重要的^[18]。

血管形成主要包括血管新生(angiogenesis)、血管发生(vasculogenesis)以及动脉生成(arteriogenesis)三种生理学过程。

血管新生是指从已经存在的血管上以出芽的方式形成新的血管，这是经典的血管形成方式。这一过程在损伤组织的修复过程中发挥着重要作用。缺氧是刺激血管床的重要因素，例如：缺氧诱导因子(HIFs)可以上调促血管生成因子(VEGF)的表达，进而刺激血管形成、血管稳态维持、血栓形成、炎症和血管重建等生理和病理过程。

血管发生则是指血管内皮前体细胞从头形成血管结构，是胚胎发育时期血管新生的主要方式^[19]。这一过程主要通过各种生长因子调节，如：VEGF、FGF、转化生长因子(transforming growth factor)、和血管生成素-1(angiopoietin-1)以及它的受体，包括VEGF1(VEGFR1/FLT1)、VEGFR2(KDR/FLK1)、Tie-2。以往的研究认为血管发生仅仅发生于胚胎发育阶段，现已经证实血管发生不仅仅发生在胚胎发育阶段，也存在于成人血管形成阶段。

动脉生成(arteriogenesis)是指从已经存在的动脉以出芽的方式在动脉网络之间形成侧支血管，这一过程是通过ECs和平滑肌细胞(SMCs)共同完成的。研究发现，尽管EPCs在血管新生、血管发生和动脉生成过程中都发挥了重要的作用，但SMCs仅仅参与动脉生成的过程。

4 移植内皮祖细胞与治疗性血管新生

目前，国内外大量研究表明内皮祖细胞(EPCs)与各种缺血性疾病密切相关，已成为临床干细胞研究的热点之一。而近年来，越来越多的研究表明移植EPCs可增强缺血组织的血管新生作用，并促进损伤内皮的再内皮化，进而提高缺血组织的血流灌注，最终恢复血管的功能。因此，EPCs的移植为各种缺血性疾病(如急性心肌梗死、不稳定型心绞痛、中风、糖尿病视网膜病变、动脉粥样硬化以及缺血性视网膜病变等)和非缺血性疾病(如阿尔茨海默氏症、肺动脉高压等)提供了新的治疗选择。

4.1 内皮祖细胞移植(动物实验研究)

近年来的研究表明, EPCs能特异性归巢于缺血部位并分化为成熟血管内皮细胞参与血管新生, 为缺血性疾病治疗提供了新思路。移植EPCs到缺血部位后, 可增加毛细血管密度和血管新生，并能有效改善机体的功能。Hecht等^[19]研究发现，将胚胎干细胞诱导的EPCs移植到SD大鼠慢性脑缺血模型中，移植的EPCs不仅可以与脑血管内皮相互作用，而且可通过间接旁分泌和自分泌信号机制，刺激侧支血管生长，并能有效地恢复脑血流。这表明在慢性脑缺血疾病的治疗中，EPCs可能会是一种新型的治疗药物。Iskander等^[29]将人脐带血AC133⁺ EPCs移植到缺血性脑卒中(MCAO)模型鼠体内，磁共振成像(MRI)显示移植的细胞聚集在缺血梗死区域，且移植后14天，MCAO模型鼠的缺血体积显著地减少，这表明移植的AC133⁺ EPCs可能参与了血管新生和神经再生的过程，从而发挥了有效的治疗作用。2015年，Bai等^[21]进一步证实了移植骨髓EPCs可增强MCAO模型鼠的血管和神经再生，并能促进机体的功能恢复。值得注意的是，EPCs还在阿尔茨海默氏症^[22]、肺动脉高压^[23]等非缺血性疾病中表现出较好的治疗效果。

4.2 内皮祖细胞移植(临床试验研究)

治疗性血管新生的主要目的是促进新生血管的形成和提高缺血组织的血流灌注。动物实验证实，EPCs表现出强大的治疗潜能，给早期的临床试验研究带来了希望。伴有缺血性疾病的患者，移植EPCs可促进侧支血管的形成，并增强血管的新生，这对于减轻严重缺血组织的损伤是一个重要的治疗策略。近来大量的研究表明，EPCs可用于治疗下肢缺血、糖尿病足、心绞痛等缺血疾病。早在2009年，Kawamoto等^[24]通过多中心临床试验研究证实CD34⁺ EPCs可用于治疗下肢缺血性疾病，接受治疗的患者下肢缺血情况得到了显著的改善。随后，大量的研究表明移植自体骨髓MNCs可增加非截肢患者的存活率、下肢的血液灌注，进而提高患者的生活质量^[25-26]。

2014年，Tanaka等^[27]用自体外周血CD34⁺ EPCs治疗难治性糖尿病足时，也显示出有效的治疗效果，移植治疗后的病人腿部疼痛得到显著的改善，溃疡面积缩小，以及无痛步行距离增加，这种良好的治疗效果至少可保持2年。Jimenez-Quevedo等^[28]将CD133⁺ EPCs心内膜下注射到难治性心绞痛患者心肌内，发现患者每月心绞痛发作的次数和心功能分级得到显著的改善，且该方法是安全可行的。Lee等^[29]也证实了冠脉内注射自体CD34⁺细胞是安全有效的，可提高患者的左心室射血分数，进而改善患者心脏功能和心力衰竭的症状。

值得注意的是，目前，越来越多EPCs临床试验研究不断涌现，涉及到下肢缺血、心肌梗死、缺血性脑梗死等缺血性疾病，及肺动脉高压、自身免疫性疾病、前列性癌、肝硬化等非缺血性疾病(表 2)。

5 内皮祖细胞治疗应用的未来展望

综上所述, 一系列动物实验和早期临床研究为各种疾病提供了新思路，并给缺血性疾病和非缺血性疾病患者带来了新的希望，展示了EPCs良好的应用前景。但是随着研究的深入，不断出现的新问题亟待解决：(1)EPCs的来源广泛, 不同来源的EPC是否具有相同的治疗潜能；(2)EPCs的确切定义和表面标记仍未有统一的定论，这对于EPCs的分离纯化具有重要意义；(3)EPCs参与血管再生、组织修复的确切机制；(4)缺血、缺氧及炎症等病理微环境对EPCs的影响；(5)寻求最佳EPCs体外扩增体系, 为治疗缺血性疾病提供足量的有活力的细胞源；(6)体外扩增培养的EPCs是否与循环EPCs具有正常的生理功能。(7)寻求最佳来源的EPCs，外周血EPCs移植的前景相对较好，主要是操作简单、创伤小，但细胞数量少；骨髓提取EPCs虽然细胞数量较多，但操作复杂、创伤大、费用高；脐带血提取EPCs虽然细胞数量较多、创伤小，但涉及伦理问题。脂肪组织EPCs具有来源广泛、获取容易及对机体创伤小等优势，但难以从SVF获得高纯度的EPCs，其含有脂肪干细胞(AD-MSC)、周细胞等多种细胞系，影响治疗的安全性。

尤其值得注意的是，应用EPCs进行治疗的同时可能产生各种副作用。如EPCs可能参与动脉粥样硬化斑块内血管新生, 因此移植的EPCs可促进斑块生长，会导致斑块的破裂; EPCs也可能归巢至肿瘤血管床, 从而促进潜在肿瘤的生长, 这些都对治疗产生不利的影响。目前，EPCs治疗大多局限于动物实验，更多地进行人体研究，将对治疗的可行性、安全性及有效性做出长期的观察和评价。相信随着基础研究的深入, 这些问题的解决将为EPCs更广阔的临床应用前景带来新的希望。