2016, Vol. 36文章信息
- 朱少义, 管丽红, 林俊堂.
- ZHU Shao-yi, GUAN Li-hong, LIN Jun-tang.
- CRISPR-Cas9系统在疾病模型中的应用
- CRISPR-Cas9 System and Its Applications in Disease Models
- 中国生物工程杂志, 2016, 36(10): 79-85
- CHINA BIOTECHNOLOGY, 2016, 36(10): 79-85
- http://dx.doi.org/DOI:10.13523/j.cb.20161011
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文章历史
- 收稿日期: 2016-06-14
- 修回日期: 2016-06-30
2. 河南省医用组织再生重点实验室 新乡 453003
2. Henan Key Laboratory of Medical Tissue Regeneration, Xinxiang 453003, China
在后基因组时代，深入研究基因在发育和疾病中的生物学功能是一个巨大的挑战。定向诱导突变是一种很好的阐明基因生物学功能的方法。利用同源重组和胚胎干细胞技术将特异改造基因引入动物基因组的基因打靶技术使生物医学研究发生了重大变化[1]。转基因动物，特别是基因敲除小鼠，作为人类疾病模型是非常有价值的。随着基因编辑技术的发展，目前出现了3种新型基因打靶技术：锌指核酸酶技术(ZFN)、转录激活因子样效应因子核酸酶技术(TALEN)、规律成簇间隔短回文重复序列相关核酸酶技术(CRISPR-Cas)[2]，这3种新型基因编辑技术操作简便且周期短，基因敲除效率高。其中，CRISPR-Cas是由RNA引导内切酶的新一代基因工程技术，与ZFN和TALEN相比，其敲除效率更高[3-4]，可以同时敲除多个基因[5]，并且不需要药物筛选，应用最为广泛[6]。
随着对CRISPR-Cas系统的研究，根据Cas蛋白的结构及功能不同，目前已经将CRISPR-Cas系统分为5种类型[7]，其中Ⅱ型和Ⅴ型CRISPR基因座分别结合Cas9和Cpf1蛋白就能切割核酸链，而其他类型则需要结合多个Cas蛋白形成复合体才能发挥其功能。目前，CRISPR-Cas9系统经人工改造，single-guide RNA (sgRNA)代替了与Cas9结合的trans-activating CRISPR RNA (tracrRNA)，通过特异sgRNA序列的引导可以作用于任何靶向序列的不同PAM位点。因而CRISPR-Cas9技术已经在动植物细胞及活体中得到广泛应用。本文主要对CRISPR-Cas9系统介导的基因编辑技术及应用进行综述。
1 CRISPR-Cas系统 1.1 CRISPR-Cas系统的分类CRISPR-Cas9是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御系统，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA[8-9]。CRISPR-Cas9系统将入侵噬菌体和质粒DNA的片段整合到CRISPR基因座中，并利用相应的CRISPR RNAs (crRNAs)指导同源序列的降解，抵御入侵外源体，从而提供免疫性。CRISPR体系由CRISPR基因座和cas基因相连，CRISPR-Cas的类型由于Cas蛋白的组成不同而有所差异。由于CRISPR-Cas系统基因组成的复杂性，有一个统一的分类更有利于CRISPR的发展。目前，Makarova等[7]根据已经发现的CRISPR-Cas系统将其分为5种类型，包含16个亚型(表 1)。其中，Ⅰ型系统是最复杂的，分为7个亚型，其作用过程中有6个Cas蛋白参与，Cas3蛋白起主要作用。Ⅱ型系统，即CRISPR-Cas9系统，只需要1个Cas9蛋白，因此，该系统被改造并且广泛应用于基因编辑。Ⅲ型CRISPR系统中，Cas6发挥主要作用，所有的Ⅲ型系统都有一个由信号基因cas10编码的多区域蛋白。Ⅳ型和Ⅴ型系统中分别有一个独特的大亚基Csf1和Cpf1而区别于其他类型。与Cas9不同的是，Cpf1不仅能切割DNA，还可以切割RNA，而且不需要其它组分的参与[10]。因此，Cpf1虽然是一个大蛋白(约1 300个氨基酸)，但结构比Cas9更简单。CRISPR-Cpf1是迄今为止发现的一种最简单的CRISPR免疫系统，更具应用潜力。
1.2 CRISPR-Cas9系统的结构及作用机理
CRISPR-Cas系统由CRISPR基因座与cas基因组成。CRISPR基因座由多段同向重复序列(direct repeat, DR)与间隔序列(spacer)组成。其中，间隔序列的长度根据物种的不同而存在巨大差异，主要与细菌种类和CRISPR位点有关，一般长20~72bp；DR一般长21~48bp，在同一物种内高度保守，具有回文序列，可以形成发卡结构。DR与基因座5′端相邻的前导序列(leader sequence, LS)相连，LS的5′端与一系列的CRISPR相关基因(CRISPR-associated)，即cas基因相连[11-12]。总之，CRISPR基因座、前导序列和cas基因共同构成了CRISPR-Cas系统。
CRISPR-Cas9系统结构简单，其作用原理亦不复杂。Cas9是一种CRISPR关联核酸内切酶，有核酸酶结构域和解旋酶结构域，可以定位在特定的DNA位点，并且在反式激活tracrRNA的指引下使DNA双链断裂[13-14]。tracrRNA通过活化宿主核糖核酸酶Ⅲ(RNaseⅢ)和CRISPR相关CsnⅠ蛋白指导crRNA的成熟[14]。有研究表明tracrRNA可以双向指导CRISPR相关蛋白Cas9的两个不同的有效位点RuvC和HNH断裂目标DNA的两条链，断裂的DNA片段与crRNA互补[15-16]。经过人工改造后，tracrRNA由sgRNA来代替。sgRNA包含的5′端20个核苷酸序列决定DNA目标位点，3′端根据碱基互补配对原则绑定cas9双链结构[15]。总之，sgRNA复合体由3个结构域组成，分别是与DNA特异性结合的互补区域(长20 bp)、与Cas9蛋白结合的发夹结构域(长42 bp)和1个来源于酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的转录终止子(长40 bp)[17]。CRISPR-Cas9系统通过sgRNA-Cas9复合体断裂目标DNA的双链，然后通过非同源末端连接(non-homologous end-joining, NHEJ)或同源介导的修复(homology-directed repair, HDR)对DNA进行修复，从而改造基因组。通过改变sgRNA的序列，可以指导CRISPR-Cas9作用于任何目标DNA序列的不同PAM位点(图 1)。现已证明CRISPR-Cas9是一种可对多种细胞进行基因组编辑的有效方法。CRISPR-Cas9的简便性使得该系统广泛应用于不同物种的有效基因编辑。
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| 图 1 CRISPR-Cas9的作用原理 Figure 1 Schematic of CRISPR-Cas system Blue area indicated Cas9 protein, target sites were indicated red error symbol, PAM in yellow, donor DNA in purple, and foreign DNA in green |
随着生命科学研究的快速发展，CRISPR-Cas9技术已经成为研究基因功能的重要方法。目前，CRISPR-Cas9技术已经广泛应用于细胞[18]、细菌[19]、果蝇[20]、斑马鱼[21]和小鼠[22]等的基因功能研究。
2.1 利用CRISPR-Cas9系统构建细胞模型CRISPR-Cas9系统与胚胎干细胞技术的结合将生物医学研究推向了一个新的高度。CRISPR-Cas9技术在细胞上比在活体上有更高的作用效率，大大缩短了研究时间。2013年，Ding等[23]利用CRISPR技术在人类多能干细胞中进行了基因编辑，发现CRISPR介导的基因编辑比TALEN突变效率高，并且在突变中有7%~25%的纯合突变。Schwank等[24]培养囊性纤维化患者的肠干细胞，使用CRISPR-Cas9技术修复了囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)，使修正后的等位基因得以正常表达，肠干细胞恢复功能。随后，Xie等[25]使用CRISPR-Cas9技术，结合piggyBac转座子有效纠正人类血红蛋白β(HBB)基因突变的诱导多能干细胞(iPSC)，未发现脱靶效应并保留了iPSC完整的多能性和正常的核型，进一步将iPSC诱导分化成红细胞，其基因表达水平恢复正常。四川大学生物治疗国家重点实验室的胡袁等[26]运用改良的CRISPR-Cas9系统建立了HtrA2敲除细胞株，为研究HtrA2的线粒体保护机制提供了重要的细胞模型。2015年，卢利沙等[18]利用CRISPR-Cas9技术构建了敲除MEIS2基因的人胚肾细胞系(HEK 293T)，为进一步研究MEIS2基因的功能提供了有效的细胞模型。我们课题组使用CRISPR-Cas9技术成功敲除了HEK 293T细胞的CTNNB1基因(结果未发表)。该基因编码的β-catenin蛋白通过经典Wnt/β-catenin信号通路决定细胞命运。CTNNB1基因缺失7 bp导致其不表达β-catenin蛋白，细胞增殖能力明显下降。目前，CRISPR-Cas9技术已经被应用于多种细胞的基因研究。
2.2 利用CRISPR-Cas9系统构建疾病小鼠模型基于同源重组和胚胎干细胞的基因编辑技术已被用于动物基因组修饰，基因编辑在基因突变和表型的因果关系中具有重要作用。CRISPR-Cas9技术是目前发现的较简单的一种基因编辑技术，将其与干细胞结合可以发挥更大的作用。已有研究结果表明CRISPR-Cas9技术可快速生成对目标基因修饰的各种生物模型[27]。这将大大推进功能基因组学的发展。
通过显微共注射Cas9 mRNA、sgRNAs和变异寡核苷酸可以获得特异位点突变的基因敲除模型。例如将编码Cas9的mRNA和特异的sgRNA显微注射到一细胞阶段的斑马鱼胚胎，在活体内以一种简单、快速和可伸缩的方式有效地修改目标基因[27-28]。2014年，Mizuno等[29]利用CRISPR-Cas9技术成功构建了白化病小鼠模型。他们将Cas9载体、sgRNA和ssDNA显微共注射到一细胞阶段的受精卵中对酪氨酸酶基因(Tyr)进行打靶，产生了白化小鼠。对产生白化病症状的28只小鼠进行基因组测序分析显示：11只Tyr基因发生单核苷酸替换，其中1只为纯合突变，剩余白化小鼠发生了碱基的缺失和插入。该研究证明了CRISPR-Cas9系统能够高效进行定点突变，构建特定的小鼠疾病模型，并且可以稳定地遗传给后代。同年，马元武等[30]利用同样的方法，将Cas9 mRNA和sgRNA混合物显微共注射入SD大鼠的受精卵中，获得了稳定遗传的胰岛素受体底物1(Irs1)基因突变大鼠。2015年，周庭友等[31]利用CRISPR-Cas9系统构建了纤维鞘CABYR结合蛋白基因(fscb)打靶载体，显微注射到B6J小鼠受精卵，获得了敲除fscb基因的纯合子小鼠，为进一步分析FSCB蛋白的功能提供了基因敲除小鼠模型。2015年，Wang等[32]利用电穿孔的方法把Cas9 mRNA和sgRNA转到成纤维细胞，对肌肉生长抑制素(MSTN)基因突变的成纤维细胞进行体细胞核移植，最终得到基因突变的克隆猪。这一研究证明了CRISPR-Cas9技术可以有效地繁育生物安全的转基因猪。
此外，已有研究表明CRISPR-Cas9系统可以同时编辑多个基因。将Cas9 mRNA和针对多种基因的sgRNAs显微共注射到小鼠受精卵，再将其移植到假孕母鼠体内继续发育，可筛选到多等位基因突变的小鼠[33]。2013年，Li等[34]用CRISPR-Cas9系统同时编辑大鼠的Tet1、Tet2、Tet3基因，获得了三基因突变的大鼠，其效率达到59.1%。同年，Wang等[35]使用针对Tet1、Tet2、Tet3、Sry、Uty-8五个不同基因的sgRNAs生成多种特定基因缺失的小鼠。
与ZFN和TALEN相比，CRISPR-Cas9具有明显的优势。ZFN和TALEN分别需要构建锌指蛋白和TALEN蛋白。锌指蛋白的构建过程繁琐，成本高；TALEN蛋白可能引起机体的免疫反应，不利于构建动物模型。CRISPR-Cas9只需构建sgRNA载体，设计不同的sgRNA可作用于多种基因，操作简单，安全高效。
2.3 CRISPR-Cas9介导的基因编辑技术用于基因治疗1972年，Friedmann等[36]首次提出了基因治疗的概念。基因治疗是指将外源正常基因导入靶细胞，以补偿或纠正因基因缺陷和基因异常而引起的疾病，从而达到治疗的目的。传统的基因治疗通常是利用基因同源重组或者慢病毒递送的方法进行的。然而，基因同源重组效率很低，并且慢病毒载体可以随机插入到受体基因组，存在着一定的安全隐患。CRISPR-Cas9技术的出现为基因治疗带来了新的希望。
2.3.1 CRISPR-Cas9对遗传疾病的校正CRISPR-Cas9最令人激动的应用之一是治疗遗传疾病。2013年，Wu等[37]研究表明，小鼠Crygc基因的显性突变导致的白内障可以通过将Cas9 mRNA和针对突变等位基因的特异sgRNA显微共注射到受精卵而得到治疗。根据提供的外源寡核苷酸或内源等位基因，通过HDR修复突变的基因。表型恢复的小鼠能够生育并且可以把产生的等位基因遗传给后代。因此，这一研究为利用CRISPR-Cas9系统治疗遗传疾病提供了依据。
2014年，Anderson等在成年动物体内利用CRISPR-Cas9技术纠正了突变基因，治愈了患肝病的小鼠(见文献[38])。该病是由于延胡索酰乙酰乙酸水解酶(FAH)的缺失，导致酪氨酸代谢受阻，毒性代谢产物积累引起肝损伤。研究人员以携带突变FAH基因的成年小鼠为模型，设计了3种sgRNA和靶向靠近突变的不同供体DNA序列。将这些sgRNA、Cas9mRNA及供体DNA序列采用高压尾静脉注射的方法共注射到小鼠体内，最终作用于肝细胞。修复细胞约占全部肝细胞的1/3，使得小鼠能够脱离2-(2-硝基-4-三氟甲基苄基)-环己烷-1，3-二酮(NCTB)药物生存下来。这个实验验证CRISPR-Cas9系统修正疾病基因的可能性。
2014年，美国科学家Long等[39]利用CRISPR-Cas9技术治愈了小鼠的杜氏肌营养不良症。杜氏肌营养不良症是一种X染色体上编码抗肌萎缩蛋白基因突变引起的遗传症，其致病基因为DMD，该基因编码的蛋白质是保证肌纤维完整性所必需的。DMD的突变多为缺失1个或几个碱基导致移码突变或编码提前终止，不能合成正常的抗肌萎缩蛋白。研究人员利用CRISPR-Cas9技术对突变的基因进行编辑，使患病小鼠得到治疗。治愈的小鼠表型和野生型小鼠一致，并且肌肉组织结构和功能也得到恢复。
Yang等[40]于2016年在尿素循环障碍的新生小鼠体内静脉注射2个腺病毒载体(AVV)，其中一个表达Cas9，另一个携带sgRNA和供体DNA，使由于鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)突变的代谢障碍小鼠10%的肝细胞得以恢复正常，延长了小鼠的存活时间。
染色体倒置会使F8基因无法正常表达凝血因子Ⅷ导致血友病，Park等[41]从患此病的患者体内得到iPSC，用CRISPR-Cas9矫正它们的染色体片段，最终有6.7%的iPSC得以矫正并且没有发现脱靶现象。由矫正的iPSC分化成的血管内皮细胞能够表达F8蛋白，使凝血因子Ⅷ得以行使正常功能。这一研究结果为在iPSC中染色体重组的功能矫正提供了依据，也暗示CRISPR-Cas9技术在人类疾病治疗中存在着潜在的应用。
目前，对遗传性疾病的主要治疗方法是进行手术并以药物辅助，虽然可以治愈，但仍然会遗传给后代。另外，通过逆转录病毒介导的基因治疗，其整合效率低，并且可能激活原癌基因引发癌症[42]。与之相比，CRISPR-Cas9技术更安全高效，也更有可能用于人类遗传疾病的治疗。
2.3.2 CRISPR-Cas9在病毒感染疾病治疗中的应用CRISPR-Cas9作为最新的基因编辑手段，不仅用于遗传性疾病的治疗，也可用于感染性疾病的治疗。Ramanan等[43]发现CRISPR-Cas9可在体内外抑制乙型肝炎病毒(HBV)的复制和表达，因而这可能是治疗HBV感染的一种新方法。Lin等利用CRISPR-Cas9技术编辑iPSC使C-C趋化因子5(CCR5)基因发生32 bp的缺失，再用HIV-1分别感染CCR5突变的细胞和正常细胞，在正常的细胞中检测到了HIV，而CCR5突变的细胞中没有检测到HIV(见文献[44])。这一结果表明CRISPR-Cas9编辑的CCR5突变细胞可以有效阻止HIV入侵从而防止新的艾滋病毒感染。2013年，Ebina等[45]针对HIV-1长末端重复序列(long terminal repeat, LTR)设计了sgRNA表达载体，与Cas9 mRNA共转染到含有HIV-1骨架的Jurkat细胞，成功限制了前病毒激活和抑制病毒基因表达，结果表明CRISPR-Cas9系统可以清除侵入宿主细胞并整合到染色体上的病毒基因。2014年，Hu等[46]证明了Cas9 mRNA和sgRNAs编辑感染HIV-1的基因组的高度特异性。Cas9/sgRNAs使潜伏在感染细胞(包括小胶质细胞、单核细胞和T细胞)中的病毒基因失去表达和复制的活性，以防止HIV-1感染。目前的抗病毒治疗并不能根除病毒，而CRISPR-Cas9的出现为根治艾滋病等疾病带来了新的希望。这些研究均表明，CRISPR-Cas9技术可以作为一个应用于临床治疗传染性疾病的潜在工具。
3 问题与展望CRISPR-Cas9系统为构建高效的基因定点修饰技术提供了全新的平台，虽然尚处于起步阶段，但已表现出巨大的应用潜力。CRISPR-Cas9系统因快速高效地作用于基因组而受到科研人员的青睐，但基因治疗的发展仍需继续优化或开发新的基因运转工具，探索如何将这项颠覆性的技术安全地延伸到临床应用中。2015年，CRISPR-Cas9技术作为基因编辑技术中的焦点已经成为世界十大科研主题之一，吸引了众多学者的眼球。作为2013年最新发展的一种基因编辑技术，CRISPR-Cas9系统更加简单快捷、安全高效，应用也更为广泛，在基因编辑领域具有开创性意义。CRISPR-Cas9系统已经应用到不同种属、不同细胞和活体生物中对特定基因进行改造，如在小鼠、水稻、斑马鱼等生物上得到应用[47]。CRISPR-Cas9系统结合现有干细胞技术必将快速推动疾病模型的构建、基因治疗以及基础生物学理论的研究。
2016年，Han等发现了一种新型的基因编辑工具，即NgAgo-gDNA (Natronobacterium gregoryi Argonaute-guide DNA)。与CRISPR-Cas9系统不同的是NgAgo-gDNA系统不受PAM位点的限制，并且Argonaute结合单链DNA切割靶基因，对富含G+C的基因组具有更高的编辑效率(见文献[48])。随着对基因编辑技术研究的不断深入，CRISPR-Cas9技术和NgAgo-gDNA技术必将在基础研究和基因治疗领域展现广阔的应用前景。
致谢 感谢新乡医学院博士科研启动资助项目(No. XYBSKYZZ201523)和河南省生物精神病学重点实验室开放课题(No. ZDSYS2015004)对本文的支持，同时也感谢课题组杨慈清副教授、刘彦礼博士、乔梁博士等对本文的修改意见。| [1] | Mak T W. Gene targeting in embryonic stem cells scores a knockout in Stockholm. Cell , 2007, 131 (6) : 1027–1031. DOI:10.1016/j.cell.2007.11.033 |
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