2016, Vol. 36文章信息
- 刘瑞琪, 王玮玮, 吴勇延, 赵秋云, 王勇胜, 卿素珠.
- LIU Rui-qi, WANG Wei-wei, WU Yong-yan, ZHAO Qiu-yun, WANG Yong-sheng, QING Su-zhu.
- CRISPR-Cas9研究进展及在基因治疗上的应用
- Research Progress of CRISPR-Cas9 and Its Application in Gene Therapy
- 中国生物工程杂志, 2016, 36(10): 72-78
- CHINA BIOTECHNOLOGY, 2016, 36(10): 72-78
- http://dx.doi.org/DOI:10.13523/j.cb.20161010
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文章历史
- 收稿日期: 2016-03-24
- 修回日期: 2016-04-06
基因编辑技术是通过人为操作引起特定基因的插入、缺失或替换等，对基因组进行精确修饰和定向编辑的一种技术。该技术被广泛应用于研究基因在生物和疾病中的功能作用和分子机制，也可利用此技术进行基因治疗。基因编辑技术主要包括三种[1]：(1)Cre-LoxP[Cyclization recombination protein/locus of crossing-over (X) in P1]，该技术重组效率高，但实验周期长，操作对象主要为胚胎干细胞，限制了其应用范围。(2)RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术，实验周期较短，成本低，但该技术对细胞毒害作用较大，定向编辑效率较低。(3)人工内切核酸酶技术，与前两种类型相比，人工内切核酸酶技术摆脱了依赖胚胎干细胞的限制，应用更加广泛，且定向编辑效率较高。
目前，人工内切核酸酶技术有三类，分别是锌指核酸酶(zinc-finger nucleases, ZFNs)、转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases, TALENs)和CRISPR-Cas[Clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)/CRISPR-associated (Cas)]技术。ZFNs和TALENs都是基于特制的DNA-结合特异性的蛋白质系统，它们通过束缚核酸内切酶的催化区域，调节DNA结合蛋白，引起特定位点的靶向双链DNA断链[2]，这两种人工内切核酸酶的识别位点非常有限，操作复杂，成本较高。然而，CRISPR技术通过一小段与靶向DNA碱基互补配对的RNAs及其引导Cas蛋白，引起DNA位点特异性靶向双链DNA断链，产生靶基因修饰。这项技术便于设计，切割效率更高，成本较低，应用范围广，且适用多重基因编辑。
本文主要针对CRISPR技术中的CRISPR-Cas9系统，着重从CRISPR-Cas9的结构、作用机制、修复方式及其在基因治疗上的应用等方面介绍CRISPR-Cas9的研究进展。
1 CRISPR-Cas9的兴起1987年，Ishino等[3]报道Nakata等发现大肠杆菌中一段特殊的29nt的重复序列，此序列被5段32nt的间隔序列隔开。随着微生物基因组测序的完成，Mojica等[4]将这类成簇的规律间隔的短回文重复序列归类于成簇的重复元件，此元件存在于40%的细菌和90%的古细菌中。2002年，Jansen等[5]将这类成簇的规律间隔的短回文重复序列命名为CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)。同时，许多保守的CRISPR相关(CRISPR-associated，Cas)基因在重复序列的附近被发现，并且根据Cas基因的不同将CRISPR系统分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型[6]。随后，实验证明[7]CRISPR-Cas是一种原核生物特有的适应性免疫机制，在抵御质粒或噬菌体入侵中起重要作用。直至2013年，Cong等[8]成功地在哺乳动物细胞内利用Ⅱ型CRISPR系统(即CRISPR-Cas9)完成了基因编辑。由此，CRISPR基因编辑系统在生物科学研究领域掀起了热潮。
2 CRISPR-Cas9结构 2.1 CRISPR-Cas9的基因结构自然界的CRISPR基因结构的主体是由保守的重复序列(repeat)和间隔序列(spacer)构成的多段R-S结构，称为CRISPR基因座(CRISPR locus)。R-S结构的5′端存在前导序列(leader)和一系列Cas蛋白基因座，leader可能是CRISPR基因座的启动序列[9]。Cas蛋白基因座编码的蛋白质具有核酸酶，整合酶，解旋酶和聚合酶等活性，可参与基因修饰，目前发现的Cas蛋白基因有10多种。Cas蛋白基因，leader，CRISPR基因座共同构成了CRISPR基因序列。根据Cas蛋白序列和结构的不同，可将CRISPR-Cas系统分为I型、Ⅱ和Ⅲ型，每种类型的CRISPR系统都包含一簇Cas基因及与其相应的CRISPR序列。Ⅱ型CRISPR系统的核心蛋白为Cas9蛋白，只需要通过RNA引导内切酶Cas9识别和切割靶序列[10]，目前应用最为广泛。
CRISPR基因座被转录成一段长链的CRISPR RNA前体(pre-crRNA)，包括leader和CRISPR基因座。CRISPR-Cas9一个必须的结构--反式激活crRNA(transactivating crRNA, tracrRNA)，它是一小段反式编码的Ⅱ型CRISPR-Cas位点上游序列的RNA。TracrRNA由一段与repeat部分互补(anti-repeat)的14nt序列和三个tracrRNA茎环组成[11]，由此构成CRISPR-Cas9的回文结构。Pre-crRNA的重复序列通过tracrRNA，RNA酶Ⅲ和Cas9蛋白经过两步剪切，而后通过Cas9加工为成熟的crRNA[12]。成熟的crRNA由20nt的向导序列和12nt的repeat组成。原型间隔序列毗邻基序(Protospacer Adjacent Motif, PAM)是CRISPR-Cas9至关重要的一部分，序列为5′-NGG-3′。PAM区是一段高度保守的序列，随proto-spacer整合到CRISPR基因座中。它在识别靶向DNA中有重要的作用，只有靶序列位于PAM的5′端时，Cas9核酸酶才对靶序列进行切割[13]。
Ⅱ型CRISPR系统中，tracrRNA与crRNA部分互补形成杂合体，并与Cas9内切酶结合，crRNA作为此复合体的向导，寻找位于PAM区5′端且与crRNA互补的20nt外源核酸靶序列，切割与crRNA碱基互补配对的DNA序列[14]。为了更加简便地进行基因编辑，将tracrRNA:crRNA杂合体人工设计成sgRNA，由它引导Cas9核酸酶功能区域。改造后的CRISPR-Cas9，由异源表达人优化密码子的Cas9核酸酶和必需的RNA元件组成。该元件由两个部分组成：(1)sgRNA 5′端的20个核苷酸序列，它决定着与之碱基互补的DNA打靶序列；(2)sgRNA 3′端的双链结构，它与Cas9蛋白结合，形成了稳定的复合物结构[15]。这是一个简单的双组分系统，只需改变sgRNA 5′端的20个核苷酸即可打靶毗邻PAM区任何感兴趣的DNA序列。
2.2 CRISPR-Cas9蛋白结构Cas9蛋白具有双叶结构，分别是打靶识别叶(recognition lobel，REC)和核酸酶叶(nuclease lobel，NUC)。REC是sgRNA和靶DNA结合所必须的。NUC由位于蛋白质中部的HNH区域和位于蛋白质N端的RuvC区域，还有负责与PAM作用的C端区域(PAM-interacting，PI)组成[13]。有研究[16]表明HNH和RuvC区域可能负责在质粒或噬菌体入侵的地方引起DSBs，干扰质粒的转化率。Cas9用HNH切割与sgRNA互补的DNA链；RuvC切割反向互补的DNA链，从而产生平末端。HNH或RuvC突变能引起单链DNA断链(nickase)。将RuvC结构中的一个天冬氨酸突变为丙氨酸(D10A)，可以改变RuvC结构区核酸酶活性，形成突变的Cas9蛋白(Cas9n)，cas9n只能在双链DNA上产生单链缺口[17]。
3 作用机制通过电子显微镜和X射线晶体学技术研究Cas9的分子结构，发现在结合sgRNA时，Cas9蛋白质发生结构重排，由一个富含精氨酸的α螺旋形成的桥螺旋(Bridge helix)作为中枢，连接Cas9蛋白质的两个结构叶(REC和NUC)形成了一个带正电荷的通道，用于结合负电荷的sgRNA:靶向DNA杂合体[13]。sgRNA:DNA以及sgRNA的三个茎环构成T型结构，sgRNA:DNA处于正电荷通道中，sgRNA的三个茎环结构延伸至RuvC区域处，茎环-1对形成功能性Cas9:sgRNA是必须的，茎环-2和茎环-3促使sgRNA:DNA结构在Cas9蛋白质中稳定[18]。桥螺旋在sgRNA结合靶向DNA时发挥重要作用，它负责3′端8~12nt sgRNA:DNA的结合。Cas9构型改变可能是靶向DNA双链解旋和sgRNA入侵的部分机制。PAM对sgRNA结合靶向DNA十分重要，研究表明[19]PAM对Cas9的结合构象到切割构象的转化是必须的。缺乏PAM时，即使打靶序列与sgRNA序列完全配对，Cas9也无法识别。值得一提的是，Cas9介导的DSB在PAM区上游的~3bp处[20]。Cas9蛋白质C端的PI与PAM相互作用，在非互补链处形成大沟。sgRNA非互补链DNA与RuvC区域的活性位点结合，sgRNA互补链DNA与NHN区域的活性位点结合，引起链的解旋，Cas9促使解螺旋的DNA链末端形成30°的螺旋，形成为R-环，同时稳定R-环的结构，此外，PAM区远端的原型间隔序列也起到稳定R-环的作用[21-22]。R-环位于PAM区的上游+1处[16]。PAM识别后，靶向DNA解旋开始，R-环的形成，向原型间隔序列的远端扩张，同时伴有sgRNA的入侵和sgRNA-DNA杂合子的形成，HNH和RuvC通过构型改变分别引起与sgRNA互补和非互补的DNA链断裂，之后引起DNA损伤修复，完成基因编辑过程。
4 CRISPR-Cas9对DNA损伤的修复CRISPR-Cas9中DNA损伤修复有两种主要的途径--易错配的非同源性末端连接(non-homologous end joining, NHEJ)和高保真性的同源重组修复(homology-directed repair, HDR)，这两种途径都可以获得预期的编辑结果[23]。NHEJ无修复模板，能高效引入多种长度的插入/缺失(indels)突变，这可破坏转录因子结合位点的翻译阅读框；发生在编码的外显子时，可引起移码突变和提前终止。NHEJ介导的DNA修复能够破坏打靶基因或基因组元件的功能。然而，NHEJ修复具有一定的随机性，难以完全掌控，研究者通常选用HDR修复方式。HDR介导的修复能通过靶位点和外源提供的DNA修复模板重结合，引入特异位点突变或插入预设的序列。修复模板是侧翼连有插入序列的传统的双链DNA的同源臂打靶结构，或是单链DNA寡核苷酸(single-strand oligodeoxynucleotides，ssODNs)。ssODNs为基因组中小型编辑提供了有效并简单的方法，如插入单核苷酸突变体。不同于NHEJ，HDR通常出现在分裂细胞中，修复效率取决于细胞类型和细胞状态，以及基因位点和修复模板[24]。
5 CRISPR-Cas9在基因治疗中的应用CRISPR-Cas9广泛应用于基因功能研究，动物模型建立[25-26]等领域，同时，它给医学研究带来了变革，为多种疾病提供了基因治疗的方法[27]。目前的研究思路主要有以下几种：(1)对于功能缺失型突变引起的基因遗传病，可利用CRISPR-Cas9将功能基因片段插入，改正引起疾病的突变体；(2)对于显性基因遗传病，也可利用CRISPR-Cas9引起NHEJ使显性致病基因切除，从而获得治疗效果；(3)对于基因重复复制所引起的疾病，CRISPR-Cas9用多个sgRNA同时引起多个DSB切除重复区域，达到治疗效果[28]。此外，CRISPR-Cas9也可直接用于体细胞定向基因编辑，将细胞在体外进行定向编辑，再融入患者体内，定向修饰基因，从而起到治疗作用[29]。
5.1 CRISPR-Cas9在HIV-1病毒治疗中的应用1型人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus, HIV-1)通过破坏人体的T淋巴细胞，阻断细胞免疫和体液免疫，造成免疫系统瘫痪，最终引起艾滋病。尽管高效抗逆转录病毒治疗能有效降低感染HIV-1的死亡率，但HIV-1的基因组被永久地插入到宿主DNA中。目前针对潜伏期HIV-1前病毒的形成并没有好的治疗方法，患者必须终生利用药物来控制，无法根除此病毒，这使患者仍处在危险中。近年来，随着CRISPR-Cas9技术的不断发展，科学家期望利用此技术抑制宿主细胞中HIV-1的表达，甚至敲除HIV-1病毒。HIV-1基因的表达由长末端重复序列(long terminal repeats, LTR)启动子和增强子活性调控。Ebina等[30]构建敲除LTR的CRISPR-Cas9系统破坏HIV-1基因组中长末端重复序列(LTR)启动子，从而大大地降低了HIV-1在感染细胞内的表达。Hu等[31]构建HIV-1 LTR U3区域高特异性打靶的CRISPR-Cas9系统，使得感染潜伏期的T细胞中HIV-1表达失活，并且构建多个gRNA引起宿主细胞的基因毒性和脱靶编辑，从而完全切除了5′~3′LTRs的整合前病毒DNA片段。
5.2 CRISPR-Cas9与iPS技术共同用于基因治疗诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem, iPS)具有长期自我更新和多向分化潜能，对于再生医学，疾病治疗和疾病模型的研究有重要意义。随着基因编辑技术的不断发展，人工核酸酶已应用于编辑iPS基因组。Horri等[32]用CRISPR-Cas9创造了一个免疫缺陷、着丝粒不稳定、面部异常综合征(immunodeficiency，centromeric region instability，facial anomalies syndrome，ICF)诱导性多能干细胞模型。DNA甲基转移酶3B(DNA-Methyltransferase 3B，DNMT3B)基因突变引起免疫缺陷，着丝粒不稳定，面部异常综合征(ICF)。研究者将Cas9载体和定向打靶DNMT3B基因的sgRNA载体共转染iPS细胞，得到成功破坏DNMT3B等位基因的iPS细胞，这项研究结果为治疗ICF提供了新的方向。Xie等[33]利用CRISPR-Cas9修饰地中海贫血症患者细胞诱导分化成的iPS，将iPS中突变的致病基因人β珠蛋白基因(Homo sapiens hemoglobin-beta，HBB)成功修复，并将修复后的iPS细胞诱导分化成红细胞，检测此细胞得到正常的HBB细胞，解决了地中海贫血症所引起的病变。
5.3 CRISPR-Cas9在肿瘤治疗研究中的应用肿瘤是由多种基因和多条信号通路参与形成的[34]。在骨髓增殖异常综合症和急性骨髓性白血病患者中，常常发现7号染色体和7q[-7/del(7q)]缺失，并引起不良的预后。Chen等[35]利用RNAi和CRISPR-Cas9方法编辑肿瘤抑制因子混合系白血病3基因(MLL3)，发现在实验小鼠中位于7q36.1处的MLL3的基因剂量相对于野生型小鼠下降50%，极易引发骨髓增生异常综合症和急性骨髓性白血病，这项研究结果对骨髓增生异常综合症和急性骨髓性白血病治疗提供了新的思路。Zhen等[36]利用CRISPR-Cas9技术建立了针对引发宫颈癌的人乳头状瘤病毒(human papilloma virus, HPV)中特异表达的E6和E7基因的编辑系统，并将其转染进入感染HPV的宫颈癌细胞。研究表明，此编辑系统抑制癌细胞增殖，这可能成为一种新型治疗手段。
5.4 CRISPR-Cas9在杜氏肌肉营养不良症治疗中的应用杜氏肌肉营养不良症(Duchenne muscular dystrophy，DMD)是一种常见的肌肉萎缩症，患者从儿童时期开始出现肌肉萎缩，代谢紊乱，骨骼和肌肉发育畸形，同时心脏和呼吸系统受影响。DMD由Dmd基因移码突变，编码营养不良蛋白，从而危害肌纤维完整性、肌肉退化等[37]。通过敲除一个或数个外显子引起突变的转录子，产生一个对框的mRNA，虽然此mRNA缩短，但仍可翻译为具有正常功能的蛋白质。研究表明[38]，创建一个引起DMD基因外显子23删除的CRISPR-Cas9组分，再利用腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)载体将CRISPR-Cas9组分送入患病的小鼠内进行表达，DMD阅读框修复，小鼠部分肌肉功能恢复，大大缓解了DMD症状。Nelson等[39]和Long等[40]分别利用Staphylococcus aureus(SaCas9)和带有小的增强子序列的Streptococcus pyogenes(SpCas9)敲除DMD基因外显子23，使得DMD基因修复表达，提高了肌肉的力量。
6 存在问题和展望随着CRISPR-Cas9技术的广泛应用，其存在的问题也逐渐显露出来，如脱靶效应，PAM依赖性等，其中最严重的是脱靶效应。CRISPR-Cas9的脱靶效应是由于Cas9蛋白可容忍sgRNA和靶向DNA在5′端的错配，脱靶DNA切割引起的脱靶突变体和染色体易位限制了Cas9核酸酶的作用[41]。研究发现[42]，sgRNA的组成和结构可影响CRISPR-Cas9在细胞内产生脱靶效应，CRISPR-Cas9识别打靶位点和脱靶位点只有两个碱基的不同。因此，利用GUIDE-seq和Digenome-seq方法可为避免脱靶效应提供一个全面的预测[43-44]。此外，也可降低sgRNA和Cas9在细胞内的表达浓度降低脱靶效应，但同时也降低了打靶效率[45]。第二种方法是优化sgRNA的结构[46-47]。研究表明[46]，Cas9能够忍受sgRNA 5′端的错配，不能忍受sgRNA 3′端8~14bp的错配。将sgRNA 5′端的互补序列减少，由17或18个互补的核苷酸组成，这与没有减短的sgRNA打靶活性相同，但大大降低了脱靶位点引起的突变效应，同时提高了sgRNA:DNA错配的敏感性，从而降低突变效应[48]。第三种方法，改造Cas9蛋白结构。Kleinstiver等[49]改造获得的SpCas9-HF1蛋白能显著降低脱靶效率，同时保证高效的打靶效率。Cas9突变体Cas9n切口酶切割产生的单链缺口会被高保真性的碱基切除修复途径(base-excision repair，BER)修复，不会在基因组DNA上造成突变。通过两个Cas9n产生两个单链DNA断裂(single-strand break，SSB)或在不同DNA链上产生缺口以造成双链DNA断裂的策略，可有效避免脱靶突变[50]。
随着对基因编辑技术的深入研究，CRISPR系统也将不断被完善。2015年9月，张锋等又找到了一种新型的CRISPR系统--CRISPR/Cpf1[51]。Cpf1蛋白比Cas9更小，能够更容易进入细胞；Cpf1切割DNA后形成粘性末端，使得更容易插入；其剪切位置离识别位点很远，编辑位置的选择更加自由。以上这些优点可能更加适用于基因治疗，但是尚无全面可靠的数据证明CRISPR/Cpf1系统的稳定性及应用水平优于Cas9系统。综合来说，Cas9系统打靶位点多、操作简便，几乎适用于任何物种等优势，使其成为了利用基因编辑手段进行疾病预防和治疗的新策略。通过不断地完善Cas9系统，必将在疾病的基因治疗方面更好地造福人类。
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