2016, Vol. 36文章信息
- 沈鹏飞, 王斌, 谢子康, 郑冲, 瞿玉兴.
- SHEN Peng-fei, WANG Bin, XIE Zi-kang, ZHENG Chong, QU Yu-xing.
- 软骨寡聚基质蛋白过表达对BMP-2诱导骨髓间充质干细胞分化的影响
- Effects of Cartilage Oligomeric Matrix Protein Overexpression on BMP-2 Induced Cell Differentiation of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells
- 中国生物工程杂志, 2016, 36(10): 1-7
- CHINA BIOTECHNOLOGY, 2016, 36(10): 1-7
- http://dx.doi.org/DOI:10.13523/j.cb.20161001
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文章历史
- 收稿日期: 2016-04-05
- 修回日期: 2016-04-25
软骨组织工程给软骨损伤治疗带来希望，其中，利用基因修饰技术干预干细胞增殖和成软骨分化，从而特异性、长效地调控软骨修复，在软骨组织工程领域具有广阔的应用前景[1]。软骨寡聚基质蛋白(cartilage oligomeric matrix protein，COMP)属于凝血酶敏感蛋白家族，是软骨、韧带、肌腱等组织细胞外基质中最主要的非胶原蛋白之一，在细胞黏附、增殖、分化中扮演重要角色[2-4]。BMP-2(bone morphogenetic protein 2)可诱导多种干细胞增殖及成软骨分化，促进软骨细胞增殖与成熟；同时也可诱导骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)成骨分化，因此促进BMP-2诱导的干细胞成软骨分化、抑制其成骨分化，对于软骨修复至关重要[5-7]。本研究在体外通过脂质体转染含人COMP基因的质粒使MSCs过表达COMP，用BMP-2诱导骨髓MSCs分化，观察COMP过表达对MSCs成骨分化和成软骨分化的影响。
1 材料与方法 1.1 试剂与仪器SD大鼠骨髓间充质干细胞、干细胞完全培养基购自广州赛业生物科技，载有人COMP基因的pIRES-hrGFP-1a质粒购自上海生工公司；10%胎牛血清、DMEM培养基(Gibco)，real-time PCR试剂盒、质粒抽提试剂盒、2×Taq PCR MasterMix PCR扩增试剂(TaKaRa)，人重组BMP-2(Peprotech，美国)，COMP抗体(Abcam)，RUNX2抗体、SOX9抗体(CST公司，美国)，Ⅱ型胶原抗体、骨钙蛋白抗体(Millipore)，β-actin抗体(博士德公司，武汉)，羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗、细胞裂解液(碧云天公司)，茜素红和阿利新蓝染料(广州赛业生物科技公司)，BCA蛋白浓度检测试剂盒、预染蛋白Marker(美国ThermoFisher Scientific公司)，引物合成委托上海生工公司。
1.2 细胞转染与分组实验设计为三个组别：对照组为正常培养的骨髓间充质干细胞，空载体组为转染空载质粒的骨髓间充质干细胞，过表达组为转染过表达COMP重组质粒的骨髓间充质干细胞。
培养在干细胞完全培养基中的第五代对数期骨髓间充质干细胞，于转染前12 h种植细胞培养六孔板，使细胞汇合度在转染时达到40%~50%，脂质体转染步骤严格按照说明书进行，转染时长为6 h，转染后三组均更换含50 ng/ml BMP-2、10 % FBS的DMEM培养基继续诱导分化培养至各后续实验检测所需的时间，每隔2~3天换液。
1.3 Real-time PCR分析mRNA表达水平各组处理后收集细胞，六孔板每孔添加适量Trizol和氯仿，提取总RNA，去基因组后检测RNA纯度，纯度合格且无蛋白质污染，用MMLV逆转录酶进行逆转录。GAPDH上游引物：GAAGGTGAAGGTCGGAGTC，下游引物：GAAGATGGTGATGGGATTTC；COMP上游引物：CCCAACTCAGACCAGAAGGA，下游引物：GTCACAAGCATCTCCCACAA；SOX9上游引物：GACGTGCAAGCTGGGAAAGT，下游引物：CGGCAGGTATTGGTCAAACTC；RUNX2上游引物：GCGTCCTATCAGTTCCCAAT，下游引物：CAGCGTCAACACCATCATTC；蛋白聚糖上游引物：TGGCATTGAGGACAGCGAAG，下游引物：TCCAGTGTGTAGCGTGTGGAAATAG；Ⅰ型胶原上游引物：GACATGTTCAGCTTTGTGGACCTC，下游引物：GGGACCCTTAGGCCATTGTGTA；Ⅱ型胶原上游引物：CGCCACGGTCCTACAATGTC，下游引物：GTCACCTCTGGGTCCTTGTTCAC；X型胶原上游引物：CATGCCTGATGGCTTCATAAA，下游引物：AAGCAGACACGGGCATACCT。逆转录成cDNA后，进行定量分析，反应条件为预变性95 ℃，5 min，变性94 ℃，30 s，目的基因均退火60 ℃，30 s，(内参GAPDH退火55 ℃，30 s)，延伸72 ℃，1 min，40个循环，72 ℃，6 min。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察DNA条带，凝胶成像系统拍照保存。
1.4 Western blotting分析蛋白表达情况各组处理后收集细胞，冰上加裂解液充分裂解细胞，离心收集上清，使用BCA法测定样品蛋白浓度，分装成30 μg每小管，加上样缓冲液后高温变性，样品经SDS-PAGE电泳后电转移至PVDF膜，TBST配制的5 %脱脂奶粉常温封闭1~2 h，TBST洗膜3次后孵育一抗，COMP、RUNX2、SOX9、Ⅱ型胶原、骨钙蛋白、X型胶原一抗稀释比例均为1:1 000，β-actin稀释比例为1:2 000，一抗4 ℃摇床孵育过夜，TBST洗膜3次后孵育对应的HRP标记的羊抗小鼠或羊抗兔二抗，稀释比例为1:5 000，常温孵育2 h；TBST洗膜后暗室添加适量ECL试剂后压片、显影、定影，胶片扫描后蛋白条带用Image J软件进行灰度分析，半定量检测蛋白表达。
1.5 成骨染色培养至第21天时弃去培养基，PBS清洗细胞2遍，体积分数4 %的多聚甲醛固定30 min，用PBS清洗2遍，加人0.1 %茜素红染液，染色5 min，用PBS清洗2遍，置于倒置显微镜系统成像。
1.6 成软骨染色培养至第21天时，弃去培养基，用PBS清洗细胞2遍，体积分数4 %的多聚甲醛固定30 min，加入l ％阿利新蓝染液室温染色30 min，用PBS清洗2遍后置于倒置显微镜系统成像。
1.7 统计处理数据以均数±标准差(x±s)表示，使用SPSS 16.0分析数据，多组间比较行单因素方差分析(One Way ANOVA)，P < 0.05为差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 骨髓间充质干细胞COMP基因过表达检测细胞转染7天(168 h)后，过表达组目的基因COMP mRNA水平均显著高于对照组和空载体组(P < 0.05)，COMP蛋白表达明显多于对照组和空载体组，见图 1。
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| 图 1 骨髓间充质干细胞中COMP过表达效果验证 Figure 1 The validation of COMP overexpression effect in MSCs by RT-PCR and Western blotting Compared with control group, * P < 0.05; Compared with empty vector group, # P < 0.05 |
COMP过表达组细胞转染7天(168 h)后，成骨标记基因RUNX2、Ⅰ型胶原(Col1a1)mRNA水平均显著低于对照组和空载体组(P < 0.05)，见图 2；细胞转染后7天(168 h)，Western blot结果显示过表达组细胞成骨标记基因RUNX2、骨钙蛋白(Osteocalcin)的蛋白表达水平均明显低于对照组和空载体组(P < 0.05)，见图 3。茜素红染色反映矿化结节的生成情况，COMP过表达组细胞转染21天(504 h)，茜素红染色深度明显弱于对照组和空载体组，见图 4。以上结果说明骨髓间充质干细胞COMP基因过表达抑制其成骨分化。
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| 图 2 PCR分析COMP基因过表达对骨髓间充质干细胞成骨和成软骨标记基因表达的影响 Figure 2 The effects of COMP overexpression on osteogenesis and chondrogenesis related gene expression in MSCs by RT-PCR Compared with control group, * P < 0.05; Compared with empty vector group, # P < 0.05 |
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| 图 3 Western blot检测COMP基因过表达对骨髓间充质干细胞成骨和成软骨标记基因表达的影响 Figure 3 The effects of COMP overexpression on osteogenesis and chondrogenesis related gene protein expression in MSCs by Western blotting Compared with control group, * P < 0.05; Compared with empty vector group, # P < 0.05 |
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| 图 4 茜素红染色结果(×40) Figure 4 The results of alizarin red staining |
COMP过表达组细胞转染7天(168 h)后，成软骨标记基因SOX9、蛋白聚糖(Aggrecan)mRNA水平均显著高于对照组和空载体组(P < 0.05)，见图 2；细胞转染后7天(168 h)，Western blot结果显示过表达组细胞成软骨标记基因SOX9、Ⅱ型胶原(Col2a1)的蛋白表达均明显多于对照组和空载体组(P < 0.05)，见图 3。阿利新蓝染色反映细胞基质蛋白多糖的合成情况，COMP过表达组细胞转染21天(504 h)，阿利新蓝染色深度、密度明显强于对照组和空载体组，见图 5。结果说明骨髓间充质干细胞COMP基因过表达诱导其成软骨分化。
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| 图 5 阿利新蓝染色结果(×100) Figure 5 The results of alcian blue staining |
COMP过表达组细胞转染14天(336 h)后，基因Col10a1 mRNA水平均显著低于对照组和空载体组(P < 0.05)，Col10a1蛋白表达也明显少于对照组和空载体组，见图 6。结果提示骨髓间充质干细胞COMP基因过表达可抑制软骨细胞的成熟与肥大，维持软骨细胞表型。
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| 图 6 RT-PCR和Western blotting分析Col10a1基因表达 Figure 6 The gene expression of Col10a1 in MSCs by RT-PCR and Western blotting Compared with control group, * P < 0.05; Compared with empty vector group, # P < 0.05 |
组织移植是治疗软骨损伤的主要方法之一，它可在短期内改善临床症状，但长期疗效还不明确。软骨供给不足及对供体产生损害，且再生能力有限，这些缺点限制了软骨移植等组织移植的应用[1, 8]。应用MSCs的软骨组织工程技术治疗软骨损伤与退变是目前的研究热点，多种生长因子在MSCs分化中发挥重要作用，但作用有限且无特异性[9]。COMP为软骨特异的胞外基质蛋白，研究表明，通过基因修饰技术过表达COMP有利于维持软骨表型[10]；COMP可通过C端与BMP-2结合，抑制其成骨诱导作用，进而减少血管内皮细胞钙化[11]，这些研究提示COMP对细胞命运产生作用，且该作用可能与BMP-2有关[12-13]。BMP-2具有诱导干细胞成骨分化和成软骨分化的双重作用。目前研究较少关注BMP-2双面效应的调节，且关于COMP过表达是否会对BMP-2诱导干细胞分化的方向产生影响，也还不清楚。本研究将两者结合起来，探讨COMP过表达对BMP-2诱导MSCs分化的影响。
结果显示，COMP过表达组目的基因COMP mRNA和蛋白表达水平明显高于对照组，说明目的基因成功转染并顺利表达。RUNX2是与成骨分化相关的关键转录因子，在调节骨细胞成熟过程中发挥重要作用；BMP-2可促进RUNX2表达，后者又能上调成骨相关基因的表达，如I型胶原、骨钙蛋白等[14-15]。本研究结果还显示，过表达COMP在成骨诱导中晚期，COMP过表达组成骨基因的表达较对照组均显著下调，这可能与过表达COMP减弱BMP-2成骨诱导作用，抑制RUNX2及下游成骨相关基因表达有关。为观察成骨分化过程中矿化程度，使用茜素红对钙结节进行染色了解骨化进程，本研究中细胞转染21天后，COMP过表达组茜素红染色强度明显弱于对照组，提示COMP过表达使干细胞成骨分化进程中钙结节形成受到抑制。
SOX9是BMP-2诱导干细胞成软骨分化进程中的关键转录因子，可被BMP-2信号通路活化，促进其诱导的成软骨分化，同时抑制其诱导的成骨分化[16-17]。Ⅱ型胶原和蛋白聚糖是细胞外基质的重要成分，被认为是软骨分化的重要分子指标[18]。BMP-2诱导干细胞成软骨分化过程中，晚期阶段会出现软骨细胞的肥大、凋亡及基质钙化，破坏正常软骨细胞表型，X型胶原为晚期软骨分化标记物[19-20]。本研究结果显示，过表达COMP在诱导成软骨分化过程中，成软骨相关指标SOX9、Ⅱ型胶原及蛋白聚糖的基因表达水平显著上升。COMP本身可以活化BMP-2促进其成软骨诱导作用，上调成软骨相关基因表达；SOX9单独作用可促进蛋白聚糖基因表达，另一方面，COMP上调SOX9表达后，也进一步促进蛋白聚糖表达。阿利新蓝染色结果同样说明过表达COMP可促进细胞外基质蛋白多糖的合成。此外，本文研究指出过表达COMP可显著下调X型胶原的mRNA和蛋白表达水平，抑制诱导生成的软骨细胞成熟和肥大，维持软骨细胞表型。
综上所述，过表达骨髓间充质干细胞COMP基因可抑制BMP-2诱导MSCs成骨分化，促进BMP-2诱导MSCs成软骨分化，这可能为软骨组织工程提供一个新的方向和靶点。
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