与一般生物药物制备不同，细胞药物的制备应用具有多样性、复杂性和特殊性，现以几种不同的细胞为例，介绍细胞药物的制备过程和质量控制。

1 造血干细胞 1.1 采集

造血干细胞(hematopoietic stem cell，HSC)是发现较早、研究最多、应用最广的成体干细胞之一，体内所有血细胞都由它分化发育而来，主要存在于骨髓、外周血和脐带血中^[1]。

1.1.1 骨髓HSC采集

自体骨髓采髓前必须对患者进行充分的体格检查及全身主要脏器功能的实验室及物理检查。采髓前也必须进行与麻醉危险相关的检查。由于采血过程中会有明显的失血，所以最好在术前准备好自身血，每周采血1～2次，每次200～400ml。采髓前备的异体血要定型、交叉配血、照射15～25Gy，以防止发生输血相关性GVHD。

同基因及同种异基因骨髓采集。年轻供者明显地优势在于干细胞丰富，可降低GVHD的发生率。亲属供者无年龄限制，无关供者规定18～55岁。采集前应充分了解供者病史，必须的检查：HLA-A、B、DR，混合淋巴细胞培养符合临床要求，ABO和Rh血型、感染性疾病的血清学检查等。采集前应对供者采集800～1200ml自身外周血以备术中用。采集量控制在10～20ml/kg体重为宜，最低白细胞数量2×10⁸/kg，一般要采集3×10⁸/kg ^[2-3]。

采集过程。整个采集过程应保持无菌，经皮采集骨髓，选择髂后时，穿刺点仅6～8个；而选择整个髂后上棘时则穿刺达到200～300个，但此时在每个穿刺点抽吸量应低于10ml，以最大限度地防止血液稀释骨髓。采集后骨髓需经200～300μm滤网滤过。采集的体积因受者的体重而有所不同，但是一般以供者体重计算为10～15ml/kg。有核细胞数的最低剂量以受者体重计算为2×10⁸/kg。采集的骨髓含有小粒与脂肪，直接输注有引起栓塞的危险。经过采集过程中过滤除去小粒后，将骨髓离心或放于4℃让脂肪凝集后挤出脂肪。

将盛有供体样本的采集瓶/袋装封好，粘贴样本采集信息标签，放入专用运输箱(4～8℃)中，由专人采用便捷的运输方式送到细胞分离室。收到样本时，首先要检查采集瓶或袋是否有渗漏和异常，检查样本采集信息标签，履行交接程序。干细胞制备完毕后，封装好装有细胞的收集瓶或袋，粘贴细胞信息标签，放专用运输箱(4～8℃)中，由专人以便捷的运输方式送到移植室。

1.1.2 外周血HSC采集

正常外周血中CD34⁺细胞占外周血单个核细胞的0.01%～0.1%，相当于骨髓的1%～10%，为了获得足够的CD34⁺细胞，同时减少HSC采集的次数，必须对HSC进行动员后采集，同时应用保存技术可对HSC进行冻存，以备后续的治疗需要。

(1)HSC动员。目前外周血HSC动员的方案有三种，即大剂量化疗、单用造血生长因子和前两者联合。异体供者单用造血生长因子动员，肿瘤患者则采用大剂量化疗加造血生长因子。常用的动员剂按动员机制不同可分为化疗药物、造血生长因子、聚阴离子化合物、受体拮抗剂和信号转导抑制剂(如AMD3100)、趋化因子及其类似物(如Groβ)。有研究发现“化疗联合G-SCF、IL-11”的效果最好。这可能是由于IL-11具有促进刺激骨髓造血的作用且靶点与G-CSF不同，可能产生协同作用，此外IL-11还具有治疗化疗后血小板降低的作用。

(2)HSC采集设备。目前常用的血细胞分离机有CS-3000Plus(Fenwal公司)、BCT Spectra(Terumo BCT公司)、Vivacell(DIDECO公司)和AS104(Fresenius公司)。这些机器的共同原理，将动员后的被采集者血液抽取，经过抗凝，泵入旋转的离心槽内，根据细胞的大小、密度，血液被分离成各种基本成分，在离心槽内形成不同的层次，收集富集单个核的细胞层，其余成分回输给患者。

(3)采集时机。经动员后外周血干细胞高浓度持续的时间很短，要判断达到峰值的时间，采集时机需要考虑：①外周血CD34⁺细胞：认为循环中CD34⁺细胞的百分比 < 0.1%时很难动员到足够的CFU-GM( > 1×10⁵/kg)，应避免采集。②白细胞：白细胞计数与CD34⁺细胞呈显著正相关，所以白细胞可以作为确定采集干细胞时机的指标之一。在化疗后造血恢复早期白细胞开始上升时，CD34⁺细胞水平亦开始上升。对于单采的时机尚有争议，但多以白细胞 > 5.0×10⁹/L为标准。③单个核细胞：也与CD34⁺细胞呈正相关，CD34⁺细胞与单个核细胞同步增加，所以单个核细胞也可以用于估计CD34⁺细胞水平。单个核细胞>1.5×10⁹/L是采集外周血干细胞的理想时机。④网织红细胞高荧光率HFR：可以预测干细胞采集时机，HFR恢复时间与CD34⁺恢复时间同步或更早。在多数病例里，HFR增加伴随CFU-GM的峰值出现。HFR日相对增长量可用来确定采集干细胞的时机。

(4)采集过程。外周血干细胞采集方法与成分血的单采术类似，即用血细胞分离机分离采集外周血的单个核细胞成分。①采集前应选择血管弹性好、损伤小的四肢大血管。一般情况下行大静脉穿刺即可，外周静脉穿刺困难时需行中心静脉置管。②预先运转CS～3000Plus血细胞分离机，体外血量为200ml左右。对于小儿，若体外血量超过全身血量的10%～15%，可能出现低血容量综合征，在采集前予以100～200ml红细胞悬液以充盈分离管路。③处理血量与采集效率密切相关，采集过程至少要处理2倍的循环血量。容量白细胞单采是指采集时的循环血量大于3倍的体循环量或者不小于15L，它是近年来提高干细胞产率、减少采集次数的重要手段。对于多数供者，单采两次就可获得4×10⁶/kg。④对于成人，血流速率为50～70ml/min，儿童的血流流速减慢。⑤ACD/全血的比率，成人的比率控制在1:(9～11)，儿童保持在1:13～1:11，以防止枸橼酸钠中毒。⑥采集效率，由于CD34⁺相对百分数量受到外周血白细胞总数的影响，常常难以准确的估计外周中HSC的准确数量。因此应用Pro-COUNT方法进行CD34⁺细胞绝对计数能够可靠预示自体外周干细胞的采集效果。

(5)采集的质量指标及治疗阈值。目前多主张CD34⁺细胞数作为采集时的质量指标，也有用处于DNA合成期的单个核细胞(mononuclear cell, MNC)数作为外周血干细胞的质量指标，它比用CD34⁺细胞更快捷、更稳定。多数学者认为的移植阈值：CD34⁺细胞 > 2×10⁶/kg、CFU-GM > 2×10⁵/kg、MNC > (2~4)×10⁸/kg(自体 > 2×10⁸/kg，异体 > 4×10⁸/kg)。近年来，认为CD34⁺细胞≥5×10⁶/kg为理想剂量，移植后可使细胞和血小板迅速恢复。

1.1.3 脐带HSC采集

人类胎盘/脐带血含有丰富的HSC。脐血与骨髓相比具有以下优点：来源丰富，HLA配型不完全相符也可利用，采集方法简便安全，使用过程安全可靠，感染率和输血反应发生率低。但是脐血HSC对物理、化学变化比较敏感，洗涤分离或运用传统方法去除红细胞的方法均会导致HSC的严重丢失。

脐血采集的对象。①产妇方面小于35岁，分娩过程顺利；妊娠36～42周，发育、营养正常；无恶性肿瘤及各种遗传性疾病；经化验检查无乙型肝炎、丙型肝炎、梅毒、艾滋病等传染性疾病；妊娠期内无严重合并症；父母无家族遗传性疾病史；无性病史。②胎儿方面体重超过2 500g；无畸形。有下列情况者脐血不宜采用：产妇有输血史；孕期少于37周或多于42周，胎盘剥离超过12h，胎膜早破超过24h；羊水检测发现染色体异常；产妇有感染、发热；胎儿呼吸窘迫；羊水内有胎粪。

脐血采集的方式。①Broxmeyer法(自然滴流法)：在胎儿娩出后至胎盘未娩出前，利用胎盘的收缩力使脐带/胎盘血自然滴入采血瓶。②Tumer法(动脉灌注静脉采血法)：在胎盘娩出后，从脐动脉灌注生理盐水和抗凝剂，然后从脐静脉采血。③杉本法(静脉采血法或血袋采血法)：直接从脐静脉穿刺采血。

1.2 分离纯化

与骨髓和外周血来源相比，脐带血含有更高质量的原始造血干细胞，有更强的增殖潜能及相关的生命周期，以及更长的端粒，因此，脐带血来源的人造血干细胞更适合移植治疗。

人脐血造血干细胞分离培养的过程：①脐血准备：夹住脐带，尽可能靠近胎儿处剪断。用75%乙醇的棉球消毒脐带近胎儿端，用50ml注射器针头插入消毒后的脐带近胎儿端，缓慢的将脐血从脐静脉抽出。轻轻转动注射器，使脐血和抗凝剂充分混合，脐血应保存于室温。②分离造血干细胞：将脐血与PBS按1:1比例稀释，将15ml Ficoll-Hypague加入50ml离心管中，将30m lPBS稀释的脐血缓慢地加到Ficoll-Hypague液面上明显可见一层细胞，即为单个核细胞层。用吸管吸出单个核细胞层转移到另一个离心管中，加入PBS，室温下1 000r/min离心10min。倒掉上清液，用PBSA重悬细胞，室温下1 000r/min离心10min。用培养造血干细胞的IMDM完全培养基重悬细胞。每10⁸个MNCs用终体积为300μl的缓冲液重悬，每10⁸个MNCs悬液加入100μl FcR阻断剂，抑制CD34微珠非特异性结合或通过Fc受体介导与非靶细胞结合。每10⁸个MNCs悬液加入100μl CD34微珠进行细胞标记，充分混匀后在6～12℃冰箱放置30min。③分离过程：加PBS洗涤，室温200g离心10min，加适量的缓冲液重悬细胞。根据MNCs的细胞总数选择合适的分离柱类型，将柱子放入MACs(吸附单克隆抗体-磁珠分离系统)分离仪的磁场中，加入缓冲液润洗柱子。用30μm的尼龙滤网过滤细胞，去除细胞团。将细胞悬液加入柱子，用缓冲液将未结合的细胞洗去。将柱子从分离仪中移出，置于合适的管中，将柱子加满缓冲液。用柱子内塞加压，将结合的细胞冲洗出来。加PBS将CD34⁺细胞洗一遍，室温200g离心10min。用培养造血干细胞的IMDM完全培养基重悬细胞。④扩增培养：用添加细胞因子的培养基重悬细胞，按2×104个/ml的细胞浓度将CD34⁺细胞接种到T25培养瓶中。每周两次半量换液。

1.3 保存

冷冻保存是造血干细胞安全、可靠、长久的保存方法，主要包括降温、储存、融化、回输等。

(1)程控、液氮冷冻保存。程控降温、液氯保存干细胞已采用多年，是目前国内外最常用的长期保存干细胞的方法。将样品放入程控降温机中，按设定好的降温速率控速降温。对造血干细胞而言，合适的降温速率为1～2℃/min，当样品的温度降至－40℃时，改为10℃/min，到－80℃后，直接投入液氮中保存。目前大多数实验室采用液氮来储存标本。在液氮中储存标本分为两种方式：一种是利用液氟蒸气储存，温度为－194～－100℃；另一种是储存于液氮－196℃中。应用最多的是DMSO联合HES。Lecchi等用10%二甲基亚砜和4% HES作为保护剂，采用二步降温法进行程序降温保存外周血干细胞：以1℃/min的速率从4℃降温至－45℃，然后以5℃/min的速率从－45℃降温至－110℃，转入液氮中保存，复苏后细胞存活率为81. 4%～94.8%，CFU-GM回收率为66.1%。程控降温、液氮保存的降温速率由计算机精密控制，保证了细胞在冻存过程中不会因为降温速率波动而引起细胞不稳定，降低了降温对细胞的损伤。这种方法适合于干细胞的长期保存。但是该方法有程控设备价格高、液氨消耗大、制冷时间长等不足之处。

(2)－80℃冰箱深低温冻存。大多采用－80℃或－70℃冰箱作为非程控降温冷冻保存的制冷源及保存场所，样品的降温速率控制在l～3℃/min，降温平台期控制在4min以内。目前－80℃冰箱深低温冻存干细胞有很多优点：不需要程序降温仪，省时省力，易于操作。但是这种方法保存的细胞容易受温度的影响。

冷冻保存干细胞浓度可用到4×10⁸/ml。融化是冷冻过程的反过程，多主张采用快速融化，缩短细胞融化肿胀过程，同时还可避免再结晶及重新形成冰块。常采用台盼蓝拒染检测、体外半同体集落培养及单克隆抗体检测等来测定造血干细胞冷冻保存效果

2 间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSC) 2.1 采集

2.1.1 骨髓采集

抽取骨髓在手术室进行，患者术前需做一系列血液检查(HBV、HCV、HIV等)，并签署知情同意书。患者取侧卧位，以2%利多卡因局部麻醉，穿刺部位为髂后上棘，成功进入骨髓腔后以20ml注射器预装2ml肝素生理盐水(12 500IU+500mlNS)抽取骨髓，首次抽取以10ml为宜(需防止骨髓凝结)，之后每次可抽取达20ml，一侧抽取总量为50ml，双侧髂后上棘均可按需抽取。无菌纱布压迫一会，观察半小时，如无不适可送病房。术后1～2天患者如感到穿刺部位的轻微疼痛，可应用止痛药以便缓解症状。

2.1.2 脐带采集

脐带取自足月剖宫产健康孕妇。采集前产妇需做乙型肝炎抗体、丙型肝炎病毒抗体、梅毒螺旋体抗体、艾滋病病毒抗体、谷丙转氨酶、支原体等检测，全部合格后方可采集。留取过程中手术室、产房内严格消毒，所用物品均为一次性无菌材料。胎儿娩出后，常规结扎处理好脐带，先结扎脐带的断端，在距断端20～40cm处用0.5%碘伏棉球消毒后剪断，轻轻挤净脐血管内血液，无菌丝线结扎，用生理盐水把脐带冲洗干净，将无菌采集的脐带在净化台内充分洗涤，冲去脐静脉及动脉内的残余血并剔除血管。采集的脐带放置在特制的保存液容器中密封保存。在容器外贴上标签。

2.1.3 外周血采集

外周血MSC的采集方法与成分血的单采术类似，即用血细胞分离机分离采集外周血的MNC组分。最常用的细胞分离机是FewnalCS-3000(或CS-3000Plus)。多采用分离淋巴细胞的程序分离。一般情况下行大静脉穿刺即可，外周静脉穿刺困难(尤其是小儿)时需中心静脉穿刺。采集成人时的血流速率为50～60m1/min，每次分离4～6循环(3～4h)，分离血液的总容积为9L，依据情况连续或隔日采集。对儿童采集时的血流速率和分离的总容积依年龄和体重而定，采集时间、过程和采集指标均可参照外周血HSC采集。

2.2 分离纯化与扩增

组织工程对MSC的数量要求巨大，人体骨髓内的MSC难以满足需要，在体外条件下进行分离纯化和扩增是进行临床应用的基本条件。

2.2.1 人骨髓MSC

(1)分离。密度梯度离心法：①在无菌条件下采集骨髓标本抗凝后，加入等量PBS洗涤，1 000r/min离心5min，弃上清液。②加入PBS 4ml制悬，缓慢加入等量Ficoll分离液(1.077g/ml)，2 000r/min离心20min。③收集白膜层的单个核细胞，用PBS洗涤，1 000r/min离心5min，共2次，弃上清液，重新悬于含10% FBS的DMEM/F12培养液中。④按10⁵～10⁶细胞/ml的密度接种于25cm²塑料培养瓶中，置于37℃、5%CO₂、饱和湿度的孵育箱内培养。

贴壁法：①全骨髓培养法：将骨髓1 500r/min离心5min，弃上清液，PBS洗涤2次，以10% FBS的DMEM/F12培养液重悬细胞，细胞计数后以10⁵～10⁶/ml的密度接种于25cm²塑料培养瓶中，置于37℃、5%CO₂、饱和湿度的孵育箱内培养。②羟乙基淀粉沉淀法：将骨髓与6%的羟乙基淀粉按照4:1的比例混匀，室温下静置1h，有核细胞浮于上清液中，取上清液于一离心管中，400g离心10min，弃上清液，将沉于管底的细胞团以培养液洗涤两次，细胞计数后接种，其他条件同上。

(2)纯化。贴壁法：以体外贴壁培养法去除悬浮生长的白细胞，利用反复传代贴壁法去除成纤维细胞、巨噬细胞、内皮细胞等。

免疫磁珠法：将MNCs与鼠抗人NGFR单克隆抗体在4℃条件下反应15min，PBS洗涤2次后与羊抗鼠IgG免疫磁珠4℃反应15min，然后将MNCs放置入细胞分离系统的细胞分离柱内。无免疫磁珠标记的MNCs(NCFR部分)流出分离柱，而免疫磁珠标记的MNCs(NGFR⁺部分)由于磁场作用滞留于分离柱中。移走磁场后，冲洗分离柱即得到NCFR⁺细胞。获得的细胞经台盼蓝染色法计数后，使用PE标记NCFR抗体标记细胞后，应用流式细胞仪检测NCFR⁺细胞的纯度。

(3)扩增。原代培养接种4天后换液，去掉非贴壁细胞，以后每3天以L-DMEM完全培养液换液1次，大约培养10天，用2.5g/L胰蛋白酶消化，按1:3的比例再次接种传代。待细胞密度达到70%～80%时进行传代培养：弃去培养液，加入0.25%的胰酶液5ml，37℃消化5min；加入IMDM细胞培养液5ml终止消化；将其移至15ml离心管中离心，2 000r/min，3min；弃去上清液，沉淀中加入IMDM细胞培养液10ml，吹打均匀，按1:3传代进行培养。传代培养过程中隔日换液，直至贴壁细胞铺满整个培养瓶的底面，再重复以上操作。

2.2.2 脐带来源MSC

分离方法主要有组织块贴壁法、胶原酶消化法等。

组织块贴壁法：①将脐带从手术台上取下，无菌条件下浸入培养液中，4℃保存。②脐带从保存液取出后，剪断双侧结扎部分，去除脐带血管内淤血，将脐带浸入含抗生素的Hanks’Balanced Salt Solution(HBSS)中，用D-PBS反复冲洗脐带和脐静脉内腔3次，剔除血管，将脐带剪碎至1mm³大小组织块。③将组织块后放入试剂瓶，加入0.1%的消化液，置于37°C恒温震荡仪内持续消化4～10h，100目筛网过滤，离心收集细胞。④加入HBSS液冲洗细胞3次，用DMEM/F12培养基溶液重悬细胞，调整细胞密度4.8×10³～1×10⁴/cm²，接种于6孔板内，37℃，体积分数为5% CO₂孵箱内培养，24h后换液，以后每隔3天换液一次，待细胞80%融合时，传代培养，即时使用或冷冻保存备用。

胶原酶消化法：①开始同组织块贴壁法。②脐带剪碎至1mm³大小组织块后转移至lg/L胶原酶Ⅳ中，37℃持续搅拌消化30min，随即用lg/L胰酶37℃持续搅拌消化30min。③细胞筛过滤，滤液离心，PBS洗2次。以10×10⁶/cm²的密度接种于含DMEM/F12培养液的T-25塑料培养瓶中。④3~4天后更换培养液，去掉未贴壁细胞。以后每3天换液1次，至细胞融合后继续传代。

2.3 鉴定

MSC鉴定主要包括生物学鉴定、表面标志物鉴定及其他一些鉴定方法^[4-6]。

生物学鉴定：①贴壁生长；②增殖活性高：干细胞具有较强的自我更新的能力，理论上可以无限制传代，原代培养的MSC一般可传代10代以上，由于体外培养条件限制和分化因素影响，随着培养代数的增加，细胞出现形态变得扁平、细胞内颗粒增多等老化表现；③分化潜能：加入成骨诱导培养基2～3天后，细胞开始从长梭形缩短为多角形，胞体积增大，诱导14天后碱性磷酸酶阳性细胞大幅度增加，茜素红-S染色阳性，表现出成骨细胞的特点；成脂诱导后细胞胞质内开始出现细小脂滴，细胞排列无序，显微镜下可观察到高折光性的脂滴，油红O染色显示脂肪细胞内大量的大颗粒状脂滴。

表面标志物鉴定：不同实验室分别尝试应用各种不同的表面标记来鉴定MSC，主要采用流式细胞仪或免疫细胞化学等方法，以流式细胞仪举例鉴定步骤。①收集细胞：取培养细胞(通常为细胞纯度较高、活力较好的P₃~P₅代细胞)，吸弃培养基，以胰酶消化，离心收集细胞，PBS洗涤3次。②抗体孵育：分别加入荧光标记的表面标记抗体，4℃孵育30min。③流式分析：PBS洗去未标记抗体，1%多聚甲醛固定15min，应用流式细胞仪检测细胞表面抗原情况。流式细胞术以其高灵敏、高速率、多参数测量、获取形态学信息等方面的优势在血液学、微生物学、分子生物学等领域中也得到广泛的应用。应用这一技术，不仅可以用于原代细胞或较低代次细胞的表型分析，还可以应用到细胞传代后的表型稳定性研究中。采用流式细胞术分析表明脐带MSC、CD73、CD90、CD10⁵呈阳性，阳性率不低于95%；CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR呈阴性，不高于2%。通过分析从脐带分离出来的原代P₀到P₃细胞表型，可发现表达阴性标志的细胞越来越少，而阳性标志的细胞越来越多。细胞经过三次传代培养，MSC得到富集纯化。

其他鉴定包括通过染色体分析MSC遗传学改变、裸鼠试验验证致瘤性等。染色体核型分析结果显示，MSC在体外长期培养的条件下，细胞染色体核型无易位、倒位、缺失或复制、融合等异常变化。裸鼠皮下致肿瘤试验：细胞接种6周后，取半数动物进行剖检，实验组和对照组均未发生结节或肿瘤形成。另外，半数动物继续观察至第12周，进行病理检查，剖检接种部位，同时观察各淋巴结和各器官，实验组和对照组仍未见结节或肿瘤形成。

2.4 保存

MSC进行冷冻储存、复融、低温运输的方法^[7-8]：①将处于对数生长期、细胞生长状态处于融合阶段的MSC进行消化、中和、洗涤、收集细胞，计数，计算细胞活力，细菌学检测，免疫学检测。②冻存液配制。在含20%FBS的培养基中加入DMSO，DMSO的终浓度为10%。向收集的细胞中缓慢加入冷冻储存液，并使冷冻储存液与细胞充分混匀形成冷冻储存细胞悬液。将冷冻储存细胞悬液转移入冻存管中，在冻存管上做好标记和记录信息。细胞冻存降温需逐步缓慢进行，将冻存管置于装有异丙醇的冻存盒中，先放于4℃冰箱2h，然后取出后置于－30℃冰箱2h，－80℃低温冰箱2h，然后放于液氮罐中保存。③复融时在细胞复融实验室中进行，将恒温水浴箱温度调节至37～41℃，从液氮中取出冻存管，立即投入恒温水浴箱中轻轻晃动，直至冻存管中的固体变为液体状态，此为细胞悬液。④将细胞悬液移至含有生理盐水的离心管中，使用生理盐水再冲洗冻存管内部，冲洗液均移入盛装细胞悬液的离心管中，将细胞悬液离心，弃上清夜；再次重复上述过程，弃上清夜，留下细胞沉淀。⑤向细胞沉淀内加入细胞保存液并分装为临床应用的间充质干细胞制剂，制成制剂前需检查细胞活率及细菌、内毒素、支原体，将细胞浓度调节至1×10⁵～1×10⁷/ml，移入无菌管或转运袋中，使用2～8℃恒温保温箱在时间小于等于12h内运输至使用单位，进行应用。

不同实验条件下MSC冻存条件可能不同，研究者可自行探讨适合的MSC条件。

3 肝细胞 3.1 肝细胞分离

分离肝细胞的方法包括机械分离法、EDTA螯合法，TPB螯合法和酶解法^[9]。机械分离法获得的肝细胞因活性不高而渐被弃用。目前较常用的是改良的EDTA联合胶原酶原位灌注法。在其基础上加以改进，又出现了由下腔静脉灌流的灌注法和更为复杂的五步酶解法，减少了肝细胞在分离过程中的损伤。灌流可以使消化液与肝组织更加充分地接触, 不仅提高了分离效率, 还使分离所得肝细胞的活力和数量大大提高。

3.2 肝细胞培养

肝细胞培养方法有许多，有单层细胞培养、三明治培养法、肝细胞球状体立体三维培养和微囊系统体外培养等^[10]。

3.3 肝细胞储存

相比于细胞治疗中所应用的各种干细胞，肝细胞对冷冻耐受较差，冷冻后黏附分子表达易出现缺失，而黏附分子在外渗和植入宿主肝脏中起着重要作用，直接影响细胞治疗效果，冷冻后的肝细胞活力也会下降。

不同的物种肝细胞冻存浓度不一样。目前很多学者趋向于冻存大鼠肝细胞的最适DMSO浓度为16%，冻存其他动物肝实质细胞的最适DMSO浓度为14%，而人类肝细胞为10%～12%。高浓度的DMSO对细胞有损害。

4 DC-CIK细胞

DC与CIK共培养因具有显著的协同抗肿瘤效应而逐渐成为肿瘤过继性细胞免疫治疗的首推方案，不仅在体外实验得到了证实，而且临床试验也证实了其强大抗肿瘤效应^[11-12]。

4.1 分离纯化

制备DC-CIK的单个核细胞的来源，用自体外周血采集单个核细胞。患者的抗凝外周血40ml用PBS以1:1的比例稀释后沿离心管壁缓慢加到淋巴细胞分离液(Ficol-Hypaque液)上，1 000r/min离心20min。取白膜层细胞，用D-Hanks液洗涤2次。用pH 7.0的RPMI-1640培养液洗涤1次，制成细胞悬液。置于24孔细胞培养板中在5%CO₂、37℃孵箱中培养2h，倾出培养液，再用RPMI-1640培养液洗2次，除去非黏附细胞。取黏附细胞，用RPMI-1640轻洗，用Percoll液密度梯度离心。取35%～50%界面层细胞。用D-Hanks液洗涤2次，用RPMI-1640液洗涤1次，备用。用抗体包被塑料表面分离法(Panning法)进一步纯化DC：将人Ig (10mg/ml)加入克隆板孔中(1ml/孔，30min)，然后倾出人Ig，用冷PBS液洗2次，将备用的细胞悬液加入克隆板孔中(4℃，1h)，轻轻吹打，收集非黏附细胞。加入含GM-CSF100μg/ml、IL-4 10μg/ml培养液，持续培养。

4.2 肿瘤抗原制备

手术切除的肿瘤标本，无菌条件下将癌旁非肿瘤组织去除干净，浸于PBS溶液中，然后用手术刀将组织块切碎，浸于包含0.5mg/mlⅣ型胶原酶和75U/mlⅠ型DNA酶的消化液中，37℃孵育30min，收集细胞；细胞经过液氮和37℃温箱反复冻融5个循环，收集细胞裂解物并通过过滤，－80℃保存备用。

4.3 细胞培养和鉴定

根据生长情况每2～3天进行一次半量换液；在培养的第5天，加入肿瘤抗原裂解物50μg/ml, 刺激抗原特异性的DC细胞产生；在培养的第6天加入IL-1β、IL-6和TNFα等细胞因子，刺激DC细胞成熟，在第7天收获DC细胞，其数量应达到1×10⁶个以上，台盼蓝染色检测细胞活力应在80%以上，流式细胞检测DC细胞免疫表型CD11c、HLA-ABC、HLA-DR、CD40、CD80、CD83和CD86等的表达，成熟的DC高表达这些表面标记。

收集的PBMC重悬于无血清培养基中，置于37℃，5%CO₂条件下孵育2h，收集非贴壁细胞，加入1 000U/ml的IFN-γ培养，24h后加入50ng/ml的CD3单克隆抗体和500U/ml的rhIL-2，刺激CIK细胞的生长和增殖；根据生长情况每2~3天进行一次扩瓶传代培养；在第7天，收获CIK细胞，其数量应达到1×10⁹个以上，台盼蓝染色检测细胞活力应在80%以上，用流式细胞仪检测细胞免疫表型HLA-DR、CD3、CD4、CD8、CD45和CD56等的表达。

4.4 DC-CIK细胞制备

收集培养第7天的DC细胞及CIK细胞按1:10比例共培养，继续培养7天；在培养结束前取样进行无菌试验检测，确认检测结果阴性后在第14天收集细胞，其数量应达到1×10¹⁰个以上，台盼蓝染色检测细胞活力应在80%以上，同时采用流式细胞仪检测细胞免疫表型的表达。在患者使用前取，培养液用丫啶橙染色或革兰染色追加一次污染检测，此外对每一批细胞终制剂均要留样检测。