心力衰竭是各种心血管疾病的严重和终末阶段，发病率和致死率高，是目前严重威胁人类健康的疾病之一，主要病因是高血压和冠心病^[1]。目前心力衰竭的治疗主要依靠药物，包括利尿剂、肾素-血管紧张素-醛固酮系统抑制剂、受体阻滞剂、洋地黄类等。这些治疗手段虽然明显改善了心力衰竭的预后，但总体而言，心力衰竭的致死率仍居高不下。因此，对于心力衰竭新药的研发仍是心血管领域发展的一大挑战。

最近发现心脏酶corin具有调控血压和调节心脏功能的作用^[2-3]，corin缺乏或功能障碍与子痫前期及高血压的发生密切相关^[4-7]，心衰患者血浆中corin水平显著降低，且corin水平降低程度与心衰的严重程度相关^[8-10]。提示补充外源性corin、提高机体内corin水平及活性，或许可作为治疗心衰的新方法。

Corin是一种在心脏中高表达的Ⅱ型跨膜丝氨酸蛋白酶^[11]，N端位于细胞内，有1个跨膜区，胞外区包含2个卷曲状结构(frizzled，Fz)、8个重复的低密度脂蛋白受体结构(low-density lipoprotein receptor，LDLR)、1个清道夫样受体结构(scavenger receptor，SR)及C端胰蛋白酶样蛋白酶(protease)区域，活化位点位于Arg801↓Ile802^[12](图 1)。Corin主要以酶原形式合成，需要其它蛋白酶对其活化后才具有功能。最近Chen等^[13]研究发现PCSK6为corin的活化酶，可以将表达于细胞膜上的corin活化，从而使corin具有将pro-ANP转化为ANP的功能。然而目前尚不清楚PCSK6是否能够剪切活化可溶性corin，从而使可溶性corin具有活性，用于心衰的治疗。本研究将就此展开，为可溶性corin治疗心力衰竭提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 材料

分别将corin、pro-ANP及PCSK6全长cDNA克隆pcDNA3.1系列载体(Life Technology)，构建corin及PCSK6表达质粒^{[2, 13]}。

HEK293细胞购自美国ATCC公司。

pSec/FRT/V5-His-TOPO载体、V5-antibody、HRP-V5-antibody及质粒大量提取试剂盒购于美国Life Technology公司，质粒小量提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒购于美国Axygen公司，FLAG-antibody、HRP-FLAG-antibody购于美国Sigma公司，T4 DNA连接酶、限制性内切核酸酶等购自日本TaKaRa公司，DNA和蛋白质分子质量标准Marker购于立陶宛Fermentas公司。

1.2 方法

1.2.1 可溶性corin表达载体构建

为构建可溶性corin的表达质粒，选用具有Igκ信号肽的工具质粒pSec/FRT/V5-His-TOPO为载体，利用PCR技术，以野生型corin质粒为模板，扩增corin的胞外段全长“soluble corin”(463~3 219bp，长度2 756bp)，克隆进载体pSec/FRT/V5-His-TOPO，测序验证。序列及方向正确的表达载体命名为“pSECsolCorin”。

(1)PCR扩增。根据NCBI Gene Bank公布的corin的基因序列号(NM_006587.3)，使用Vector NTI软件设计引物，引物由上海生工生物技术有限公司合成。序列分别为：Forward primer，5′-GATGCTTCTCTCCCAGGGGACCAAAG-3′; Reverse primer，5′-GTTTAGGAGAAAGGTCTGGATGTAAATCTG-3′。反应条件：95℃预变性5min，95℃变性30s，58℃退火45s，72℃延伸3min，35个循环，最后68℃延伸5min。

(2)酶连、转化。取回收产物4μl与1μl pSec/FRT/V5-His-TOPO线性载体，在1μl T4 DNA连接酶及缓冲液作用下，室温静置3h，连接载体与目的片段后，转化TOP10感受态细胞，涂布LB/Amp+抗性平板，37℃倒置培养过夜后挑取单菌落提取重组体质粒进行Xba I酶切，然后进行凝胶电泳。

1.2.2 细胞培养及转染

HEK293细胞培养于37℃、5% CO₂的条件下，含10%胎牛血清的DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium，Thermo Hyclone)高糖培养基。转染前一日，将HEK293细胞以3×10⁵细胞/孔的密度接种于六孔板，过夜培养至细胞汇合率为80%左右时，用TurboFect转染试剂(Thermo)进行转染，具体参见试剂说明书。于转染48h收集上清液备用，同时用含50mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)、150mmol/L NaCl、1%(V/V)TritonX-100和蛋白酶抑制剂cocktail(Roche)的蛋白裂解液裂解细胞，检测corin的表达。

1.2.3 PCSK6稳定表达细胞系的建立

HEK293细胞转染PCSK6表达载体，24h后胰酶消化细胞，重悬无限稀释法种于96孔板(1个细胞/孔)，培养基中加入G418(500μg/ml)，进行筛选，1月后得到HEK293-PCSK6稳定表达细胞系。

1.2.4 PCSK6对可溶性corin的活化作用

分别收集表达可溶性corin及PCSK6的细胞上清液，将可溶性corin上清液与不同体积的PCSK6上清液孵育。具体为：1ml可溶性corin上清液中分别加入0ml、0.25ml、0.5ml和1.0ml的PCSK6上清液，37℃孵育2h。取样，Western blot检测corin的活化情况。同时向剩余样品中加入0.7μl/管FLAG-antibody和30μl protein A beads，4℃免沉2h，Western blot检测PCSK6的表达。

1.2.5 可溶性corin活化pro-ANP的功能研究

将pro-ANP表达载体转染HEK293细胞，12h收集上清液。将PCSK6活化的可溶性corin上清液以体积梯度(0μl、25μl、50μl、100μl、200μl)加入pro-ANP上清液中，37℃孵箱反应0.5h后，每管加入0.7μl V5-antibody和30μl protein A beads，4℃免疫沉淀2h，Western blot检测pro-ANP的活化情况。

1.2.6 蛋白质免疫印迹实验(Western blot)

按1∶1比例在蛋白质样品中加入还原型或非还原2×loading buffer，98℃加热1 min。进行SDS-PAGE电泳，每孔加入30μg蛋白质。转膜后，脱脂奶粉室温封闭2h，HRP-V5-antibody(1∶5 000)或HRP-FLAG-antibody(1∶8 000)稀释室温孵育2h，ECL显影。

2 结果 2.1 可溶性corin表达载体的构建

为构建缺失胞内段和跨膜区的corin表达载体，即可溶性corin表达载体，以野生型corin表达载体为模板，PCR扩增corin cDNA(463~3 219bp)，得到约2.6kb的片段，克隆入表达载体pSec/FRT/V5-His-TOPO载体，提取重组质粒。依据载体及插入corin片段的序列，载体及插入片段均含有一个Xba I位点，如插入序列方向正确，可获得约1.2kb的条带。Xba I酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳结果见图 1，4号与6号质粒酶切后获得约1.2 kb的条带，与预计相符，再选取这2个质粒进行测序。测序结果显示6号质粒插入片段序列及方向完全正确，获得可溶性corin表达载体，命名为“pSECsolCorin”。由于该载体N端带有Igκ信号肽，使得缺失跨膜区的corin蛋白可以分泌到细胞外，载体的C端带有V5标签序列，便于Western blot检测重组蛋白的表达。

2.2 重组corin蛋白的表达与活化

野生型corin和可溶性corin的结构见图 2(a)，可溶性corin缺失胞内段及跨膜区，以Igκ信号肽引导。将WT corin、可溶性corin、corin裂解活化位点突变体R801A及活性位点突变体S985A分别转染HEK293细胞，裂解细胞，SDS-PAGE电泳，Western blot检测corin的表达及活化情况。结果如图 2(b)所示，可溶性corin、WT corin、R801A及S985A均能在HEK293表达。还原条件下，细胞裂解液可检测到170~200kDa的corin酶原条带及约40kDa的corin活化条带^[13]，活化位点突变的R801A及可溶性corin未见活化条带；而非还原条件下，蛋白酶结构域以二硫键与母链相连，仅能检测到酶原条带。同时还检测到细胞上清液中可溶性corin的表达，如图 2(c)所示。

2.3 PCSK6对可溶性corin的活化作用

通过建立稳定表达PCSK6的细胞系，收取PCSK6上清液，作用于可溶性corin上清液，Western blot方法检测corin蛋白的活化情况，结果见图 3。还原条件下，在未加入PCSK6时，corin可被HEK293细胞分泌的内源性PCSK6少量活化，产生活化条带corin-p，随着PCSK6的加入，可溶性corin的活化量增加，呈现剂量依赖性。证实可溶性corin可被PCSK6活化，且活化作用呈剂量依赖性。

同时免疫沉淀及Western blot检测反应体系中的PCSK6表达量(图 3下)，随着加入PCSK6上清液体积的增加PCSK6蛋白量逐渐增加。

2.4 可溶性corin活化pro-ANP的功能实验

细胞中表达的corin被PCSK6活化后才具有活化pro-ANP的功能。可溶性corin同样可以被PCSK6活化，但目前尚不知道活化后的可溶性corin是否具有活性。为此，将活化后的可溶性corin与pro-ANP上清液孵育，检测pro-ANP的活化，结果见图 4。未加入corin时，仅见到pro-ANP条带，加入corin后，便启动活化程序，检测到ANP(约13kDa)且随着corin浓度逐渐上升，pro-ANP的活化效率逐步提高。

3 讨论

Corin的生理功能是将利钠肽前体pro-ANP剪切活化为具有生物学活性的利钠肽，从而发挥降低血容量和血压、改善心功能的作用。Corin基因敲除小鼠缺少有活性的ANP，并出现高血压和心肌肥厚^{[4, 6, 14]}，表明corin具有调控血压和心脏形态的作用。而在扩张型心肌病小鼠模型中过表达corin则可改善心功能，延缓心力衰竭进展，从而延长生存时间^[15]。在中国人高血压疾病患者中发现多个corin基因突变，并证实这些突变影响corin的功能^[16-17]。前期研究发现心衰患者血浆中可溶性corin水平显著低于正常人，且降低程度与心衰严重程度相关。这些结果说明corin缺乏或功能障碍可能会导致高血压及心衰等心血管疾病的发生。

Corin-利钠肽途径在高血压及心衰发病机制中起着重要作用，而心钠素及脑钠肽已用于严重心力衰竭的临床试验及治疗，以达到缓解症状、改善血流动力及提高心功能的作用^[18-19]。这些多肽的作用机制非常独特，不同于传统的利尿剂及扩血管药物，在接受利尿剂及扩血管剂的患者中也可取得了显著的疗效^[20-21]。然而ANP和BNP的血浆半衰期都非常短(人体内分别为3min和18min)，需要持续静脉输注^[22-24]。Corin的发现为心衰的治疗提供了新思路。

由于corin是跨膜蛋白，为后期大量制备治疗用重组蛋白，本研究构建了表达缺失胞内段及跨膜区的可溶性corin，并在HEK293细胞中成功表达。但corin是以酶原形式合成的，需要其它蛋白酶地活化后才具有生物学功能。最近研究证实PCSCK6可以剪切并活化corin酶原。加入PCSK6酶抑制剂或小干扰RNA会阻断corin的活化。相反，过表达PCSK6则会增强corin的活化。在PCSK6敲除鼠中未检测到corin酶原的激活及pro-ANP活化反应，且在高盐饮食下容易诱发高血压。在高血压人群中发现了一例因PCSK6位点突变引起的corin的活性受损。在体内外证实PCSK6就是corin的活化酶^[13]。

PCSK6是一种Ca²⁺依赖的枯草杆菌酶样内切蛋白酶，属于前蛋白转化酶家族(proprotein convertases，PCs)，具有分泌属性，可以持续分泌到细胞外^[25]。PCSK6通过富含半胱氨酸的区域定位于细胞膜，并与膜相关底物结合^[26]，通过对偶合氨基酸的裂解作用使神经和肽类激素、蛋白水解酶等无活性的前体物质转化为其活性形式来发挥作用^[27-28]。PCSK6可以裂解活化细胞膜表达的corin，但目前尚不知道它是否同样也能活化可溶性corin。

为探讨PCSK6是否可以活化可溶性corin，在细胞水平开展了一系列研究。在HKE293细胞分别表达可溶性corin和PCSK6，并将PCSK6以剂量梯度加入可溶性corin中，发现PCSK6可以活化可溶性corin，且随着PCSK6剂量增加，可溶性蛋白的活化条带增强。同时也证实活化后的可溶性corin具有活化pro-ANP的生物学功能。本研究证实PCSK6能活化可溶性corin，使其具有生物学活性。此研究将为后期进一步纯化可溶性corin，并使之具有活性，最终应用于心衰的治疗打下基础。