中华人民共和国药典作为我国医药规则的重要组成部分，在医药卫生方面起着重要的标准和导向作用。从1953年第一版中华人民共和国药典出版到现在，已经经过了六十多年。2015版中华人民共和国药典已在2015年12月1号正式发布，这是自中华人民共和国药典发布以后的第十版药典，其发布显著促进了我国医药事业的发展^[1]。新版中华人民共和国药典首次将以前各部药典的共性附录进行整合，将原附录改为通则，编制成为中华人民共和国药典第四部。它对各部药典之间检测方法出现的重复性问题，以及方法间出现的不协调、不统一的问题进行了解决。

抗生素是现代医疗中最重要的药物，它的大量使用已经造成了严重的环境污染和生态毒害问题^[2]，其含量和分布的测定工作对解决抗生素污染问题有着重要作用，也是目前本课题组正在进行的研究方向。本文对中华人民共和国药典记载的抗生素检测方法进行了分析总结，以期能对抗生素的含量和分布的测定工作提供技术参考，为科研人员的后续研究提供方便。表 1中总结了2015年中国药典所记载的抗生素药品的种类。

高效液相色谱法是用高压输液泵把流动相泵入装有固定相的色谱柱内，待测物由流动相带入色谱柱，因为待测物中的各组分在两相中的分配系数不同，从而对待测物的各组分进行分离，然后进入检测器进行检测，最后由计算机处理色谱信号的一种物质分离方法^[3]。经过长时间的发展，高效液相色谱法现在已经成为医药、化工、农学、法学等领域重要的物质检测方法，具有高灵敏度、高速度、应用范围广等众多优点。高效液相色谱法的使用流程如图 1所示。

图 1 高效液相色谱法流程 Fig. 1 The flow chart of high performance liquid chromatography (HPLC)

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在2015版中华人民共和国药典中，共有275种抗生素类抗生素药品采用高效液相色谱法测定含量。约占抗生素药品总数量的75.8%，并且绝大多数色谱柱是用十八烷基硅烷键合硅胶作为填充剂，根据抗生素药品的种类不同来选择流动相和紫外吸收波长，检测器大部分都是UV检测器，按外标法以峰面积来计算抗生素药品的含量。高效液相色谱法已经成为抗生素类抗生素药品抗生素含量测定方法的主流。采用高效液相色谱法测定含量的抗生素类抗生素药品主要有以下几类。

这一大类一共有137种抗生素药品，其中有51种抗生素原料和86种抗生素制剂。是现代医疗中使用最广泛的一类抗生素。在这137种抗生素药品中有133种抗生素药品是用高效液相色谱法来测定含量的。这133种抗生素药品主要有：头孢丙烯、头孢他啶、头孢尼西钠、头孢地尼、头孢地嗪钠、头孢西丁钠、头孢曲松钠、头孢米诺钠、头孢克肟、头孢克洛、头孢呋辛钠、头孢呋辛酯、头孢孟多酯钠、头孢拉定、头孢泊肟酯、头孢哌酮、头孢哌酮钠、头孢美唑钠、头孢唑肟钠、头孢唑林钠、头孢氨苄、头孢羟氨苄、头孢替唑钠、头孢硫脒、头孢噻吩钠、头孢噻肟钠、托西酸舒他西林、苄星青霉素、阿洛西林钠、阿莫西林、阿莫西林那、阿洛西林钠、青霉素V钾、青霉素钠、青霉素钾、苯唑西林钠、拉氧头孢钠、法罗培南钠、哌拉西林、哌拉西林钠、氟氯西林钠、美罗培南、盐酸头孢甲肟、盐酸头孢他美酯、盐酸头孢吡肟、氨曲南、氨苄西林、氨苄西林钠、氯唑西林钠、普鲁卡因霉素以及它们的制剂等。在这一类抗生素中，阿莫西林是比较常用的β-内酰胺类抗生素。结构式如图 2，对阿莫西林进行含量检测时采用十八烷基硅烷键合硅胶作为填充剂的分析柱，以0.05mol/L的磷酸二氢钾溶液(用2mol/L氢氧化钠溶液调节pH为5.0)-乙腈(97.5∶2.5)为流动相，检测波长为254nm，采用外标法定量。含量测定用标准图谱如图 3所示。

图 2 阿莫西林结构图 Fig. 2 The structure of amoxicillin

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图 3 阿莫西林含量测定色谱图[4] Fig. 3 The Chromatogram of quantification Amoxicillin A:Amoxicillin

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这一大类一共有41种抗生素药品，其中有15种抗生素原料和26种抗生素制剂。这一大类中共有17种抗生素药品用高效液相色谱法来测定含量。在这17种抗生素药品中，有盐酸大观霉素、硫酸卡那霉素、硫酸异帕米星、硫酸依替米星以及其制剂可以用HPLC-ELSD来检测含量。其中硫酸依替米星采用HPLC-UV或者HPLC-ELSD进行含量检测均可。ELSD是蒸发光散射检测器，可以用来检测没有紫外吸收的有机物质，应用很广泛。和普通的紫外吸收检测器UV相比，ELSD可以检测未知的物质，而且基线稳定性比较好。颜彦等^[4]在2007年就用HPLC-ELSD测定了注射用硫酸异帕米星的含量。这17种抗生素剩下的阿卡米星、硫酸西索米星及其制剂可以用HPLC-UV进行含量检测。其中，盐酸大观霉素比较常见，结构式如图 4。对其进行含量检测有两部分，首先采用十八烷基硅烷键合硅胶作为填充剂的分析柱、ELSD检测器、以0.lmol/L三氟醋酸溶液为流动相。用大观霉素标准品作为对照品，以对照品溶液浓度的对数值与其峰面积的对数值做回归曲线，对待测品用回归曲线计算大观霉素的含量^[5]。其次，用同样的方法测定待测品中(4R)-双氢大观霉素(相对保留时间约为1.6)的含量，两部分的含量加起来才是盐酸大观霉素的含量。含量测定色谱图如图 5所示。

图 4 盐酸大观霉素结构图 Fig. 4 The structure of spectinomycin hydrochloride

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图 5 盐酸大观霉素含量测定色谱图[7] Fig. 5 The Chromatogram of quantification Spectinomycin hydrochloride A：Spectinomycin hydrochloride

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这一大类一共有46种抗生素药品，其中有13种抗生素原料和33种抗生素制剂。这一类中用高效液相色谱法进行含量检测的药品比较少，一共有16种，约占总数的35%。大环内酯类抗生素是一类具有大环内酯的抗生素，大多数是弱碱性亲脂化合物，是大环内酯基团以苷键与糖的衍生物结合成的大分子抗生素。2008年刘晔等^[6]就用HPLC的方法进行了猪肝中大环内酯类抗生素残留的测定。这16种抗生素药品为地红霉素、克拉霉素、阿奇霉素、罗红霉素以及它们的制剂。以罗红霉素为例，其结构式如图 6。对罗红霉素进行含量检测时以磷酸二氢铵-乙腈(65∶35)作为流动相，以十八烷基硅烷键结合硅胶作为分析柱填充物，检测波长为210nm，外标法计算峰面积。含量测定色谱图如图 7所示。

图 6 罗红霉素结构图 Fig. 6 The structure of roxithromycin

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图 7 罗红霉素含量测定色谱图[9] Fig. 7 The Chromatogram of roxithromycin quantification A：Roxithromycin

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喹诺酮类是一类全合成的抗菌药物，具有抗菌谱广、药物动力学特征好、作用机制独特、高效低毒等特点^[10]。自1962年问世以来，现在已经发展到了第四代喹诺酮药物。在2015版中华人民共和国药典中共记载了46种喹诺酮类药物，其中原料有12种，制剂有34种。在这46种药物中有43种采用高效液相色谱法来测定含量。这43种药物包括左氧氟沙星、甲磺酸培氟沙星、司帕沙星、乳酸环丙沙星、依诺沙星、氟罗沙星、盐酸左氧氟沙星、盐酸环丙沙星、盐酸洛美沙星、氧氟沙星、诺氟沙星以及它们的制剂。以左氧氟沙星为例，其结构如图 8，对其分析采用十八烷基硅烷键结合硅胶为填充物的分析柱，醋酸铵高氯酸钠溶液(取醋酸铵4.0g和高氯酸7.0g，溶于1300ml无菌水中，用磷酸调节其pH为2.2)-乙腈(85∶15)为流动相，检测波长为294nm，外标法定量，含量测定色谱图如图 9所示。

图 8 左氧氟沙星结构图 Fig. 8 The structure of levofloxacin

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图 9 左氧氟沙星含量测定色谱图[11] Fig. 9 The Chromatogram of levofloxacin quantification A: Levofloxacin

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四环素类抗生素在酸碱条件下均不稳定，因为它含有酚羟基和烯醇型羟基，显弱酸性；同时分子结构中含有二甲胺基，显弱碱性，所以容易形成盐。而且其结构均含有并四苯基本骨架。在2015版中华人民共和国药典中共有18种四环素类药品，全部采用HPLC方法来测定含量。这18种药品有盐酸土霉素、盐酸四环素、盐酸多西环素、盐酸米诺环素、盐酸金霉素、盐酸美他环素以及它们的制剂。以盐酸四环素为例，其结构如图 10。对盐酸四环素进行定量时分析柱以十八烷基硅烷键结合硅胶填充，流动相为醋酸铵溶液-乙腈(83∶17)，检测波长为280nm，外标法定量。进样前，样品需要用稀盐酸溶液进行稀释。

图 10 盐酸四环素结构图 Fig. 10 The structure of tetracycline hydrochloride

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抗肿瘤类抗生素是由微生物代谢产生的具有抗肿瘤活性的抗生素。在2015版中华人民共和国药典中共记载了12种抗生素药物，其中有10种采用HPLC法进行含量检测。这10种抗生素药品有丝裂霉素、盐酸平阳霉素、盐酸多柔比星、盐酸表柔比星、盐酸柔红霉素以及它们的制剂。以丝裂霉素为例，其结构如图 11。对丝裂霉素进行定量时分析柱用十八烷基硅烷键结合硅胶为填充剂，以0.077%醋酸铵溶液-甲醇(70∶30)为流动相，检测波长为365nm，外标法定量。因为抗肿瘤类抗生素注射用试剂含量比较小，所以分别测10瓶含量取平均值，来控制含量的均匀度。

图 11 丝裂霉素结构图 Fig. 11 The structure of mitomycin

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这一类抗生素药品比较少。一共有6种，包括3种原料和3种制剂。其中只有盐酸去甲万古霉素及其制剂采用HPLC法进行含量检测。盐酸去甲万古霉素结构比较复杂，如图 12所示。对其进行定量时分析柱以十八烷基硅烷键结合硅胶为填充剂，以三乙胺缓冲液-乙腈-四氢呋喃(96∶3∶1)为流动相A ;以三乙胺缓冲液-乙腈-四氢呋喃(70∶29∶1)为流动相B，按照表 2进行梯度洗脱，外标法定量。

图 12 盐酸去甲万古霉素结构图 Fig. 12 The structure of norvancomycin hydrochloride

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这一类抗生素一共有15种，4种原料，11种制剂。其中有9种采用高效液相色谱法来进行含量检测。这9种药品为甲砜霉素、氯霉素及其制剂。以氯霉素为例，氯霉素的结构如图 13。对其进行定量时采用以十八烷基硅烷键结合硅胶填充的分析柱，0.01mol/L庚烷磺酸钠缓冲溶液-甲醇(68∶32)为流动相；检测波长为277nm，外标法定量。

图 13 氯霉素结构图 Fig. 13 The structure of chloramphenicol

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这一大类包括利福霉素类、林可霉素类以及磷霉素类等。一共有36种药品，11种原料，24种制剂。这36种药品中有23种采用高效液相色谱法来进行含量测定。包含克林霉素磷酸酯、利福昔明、美洛西林钠、盐酸克林霉素、盐酸林可霉素以及它们的制剂等。以利福昔明为例，其结构如图 14所示。对其进行定量时采用以锌基硅烷键结合硅胶为填充物，以甲醇-乙腈-缓冲液[0. 075mol/L磷酸二氢钾溶液-0. 5mol/L 枸橼酸溶液(55∶10)](513∶95∶392)为流动相，检测波长为240nm，外标法定量。

图 14 利福昔明结构图 Fig. 14 The structure of rifaximin

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抗真菌类抗生素药品种类很少。2015版药典中只记载了6种药品，包括3种原料和3种制剂。其中有4种采用HPLC进行含量的检测。包括灰黄霉素、两性霉素B以及它们的制剂等。以两性霉素B为例，其结构如图 15。对其进行定量时使用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-磷酸溶液(370∶630)为流动相;检测波长为383nm。待测品用N,N-二甲基甲酰胺溶解。

图 15 两性霉素B结构图 Fig. 15 The structure of amphotericin B

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中华人民共和国药典记载高效液相色谱法对抗生素含量的检测是一种很基础和权威的方法，具有非常高的可信性。很多研究者在药典记载方法的基础上作了进一步的研究，开创了许多新的方法，大大提高了效率。例如2011年，龚星军等^[12]就用高效液相色谱法同时测定了三种头孢类抗生素的含量。同一年陶辉等^[13]用SPE-HPLC同时测定了污水中四种头孢类抗生素的含量。SPE是固相微萃取的简称，是对高效液相色谱法前处理的发展。2015年冯雷等^[14]用液质联用分析方法对禽畜肉中氯霉素残留进行分析。高效液相色谱串联质谱法具有很高的精度，可以检测出环境中残留的微量抗生素。同样的例子还有很多。高效液相色谱以及它的发展方法现在已经成为物质含量检测的主流方法，并得到了广泛应用。

抗生素的微生物检定法曾经是抗生素含量检测的主流方法，但是因为它具有步骤复杂、精度差、影响因素多等弊端被逐渐替代。然而，抗生素的微生物测定法也有其优点，例如它可以准确地反映抗生素的生物活性。所以该方法依旧是抗生素含量检测中不可或缺的一种方法。对于一些种类的抗生素药品，特别是由生物发酵产生的多组分抗生素，主要采用抗生素的微生物检定法来测定其含量。在2015版中华人民共和国药典中用抗生素的微生物检定法进行含量检测的抗生素药品共有75种。

2015版中华人民共和国药典第四部对抗生素微生物检定法作出了定义。抗生素的微生物检定法是一种根据量反应平行线原理设计，通过检测抗生素对微生物的抑制作用，计算抗生素活性(效价)的方法 ^[15]。

抗生素微生物检定法包括两种方法，管碟法和浊度法。

管碟法是利用抗生素的扩散作用，比较标准品和待测品抑菌圈的大小从而确定供测品效价的方法，流程如图 16所示。这种方法是比较经典的抗生素含量测定方法。本方法适合大批量测定，但是步骤比较繁琐，需要操作技术极其熟练。另外早在1998年苏润昌等^[16]就对影响抗生素微生物检测的因素进行了分析。琼脂浓度、钢管大小、菌的浓度、培养温度以及操作者的熟练程度、测量时的误差等都可以影响抑菌圈的大小从而影响实验结果，这些问题使得使用该种方法定量结果不准确。在用抗生素的微生物检测法进行含量测定的75种抗生素药品中共有20种明确表明采用管碟法进行含量检测。这20种抗生素药品包括大环内酯类的琥乙红霉素、硬脂酸红霉素，肽类的盐酸万古霉素，氨基糖苷类的硫酸核糖霉素，β-内酰胺类的磺苄西林钠，抗真菌类的硫酸粘菌素以及它们的制剂和属于抗生素类的复方新霉素软膏以及替考拉宁和注射用替考拉宁。

图 16 微生物管碟法流程 Fig. 16 The flow chart of cylinder plate method

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浊度法是利用抗生素对细菌生长的抑制作用，通过检测标准品和待测品细菌的浊度值，来比较抗生素对细菌的抑制作用，从而测定待测品效价的一种方法(图 17)。在2005年的中华人民共和国药典中第一次提出了浊度法这个概念，当时仅仅是用来检测庆大霉素及其制剂的效价^[17]；2010年中华人民共和国药典(第二部)中则是针对氨基糖苷类抗生素盐酸大观霉素及其制剂指定采用浊度法来检测抗生素的含量^[18]。在2015版中华人民共和国药典中，没有专门指定用浊度法来测定含量的抗生素物质。但是浊度法可以作为管碟法的补充方法，在药典中记载的75种采用微生物检测法的抗生素药物中有56种并没有指定是采用管碟法还是浊度法。这两种方法中可以任选一种。这56种抗生素药品大致包括大环内酯类的乙酰螺旋霉素、吉他霉素、交沙霉素、红霉素、麦白霉素、依托红霉素、乳糖酸红霉素以及它们的制剂，氨基糖苷类的妥布霉素、硫酸小诺霉素、硫酸巴龙霉素、硫酸庆大霉素、硫酸奈替米星、硫酸链霉素、硫酸新霉素以及它们的制剂，多肽类抗生素的硫酸多粘菌素B及其制剂，抗生素类的丙酸交沙霉素、磷霉素钙、磷霉素钠和磷霉素氨丁三醇以及它们的制剂等。

图 17 微生物浊度法流程 Fig. 17 The flow chart of nephelometry

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紫外-可见分光光度法是利用不同的抗生素药品在190~800nm波长范围内的吸光度不同来定量测定的方法。当光穿过被测物质溶液时，物质对光的吸收程度会随光的波长不同而变化。用于定量的时候，在最大吸收波长处测量一定浓度样品溶液的吸光度，并与一定浓度的对照溶液的吸光度进行比较或者采用吸光系数法求算出样品溶液的浓度^[15]。在2015版中华人民共和国药典中共有8种抗生素药品采用紫外-可见分光光度法进行含量的测定。包括放线菌素D和注射用放线菌素D，酰胺醇类抗生素的琥珀氯霉素以及棕榈氯霉素以及它们的制剂。

由于抗生素药品的多组分和不确定性使化学反应无法定量完成，抗生素共有物质可能干扰主要反应，因此大多数抗生素不适用于滴定分析。在2015版中华人民共和国药典中只有5种抗生素药品采用滴定法来测定含量。这5种药品为喹诺酮类的吡哌酸及其制剂和β-内酰胺类的羧苄西林钠及其制剂。

2015版中华人民共和国药典比以前版本的药典在编排上更加合理，把以前药典各部的附录统一编排为药典第四部，使查询更加容易。在所记载的四种抗生素检测方法中，高效液相色谱法是最常用的方法，得到了大量实验的证明；抗生素的微生物检测法是最经典的检测方法，现在虽然使用较少但是也占有很重要的位置；紫外-可见分光光度法和滴定法具有局限性，适用性有限，所以采用这两种方法进行含量检测的抗生素药品最少。但是这四种抗生素含量的测定方法各有利弊，要根据不同的情况来进行选择。2015版中华人民共和国药典发布以后，会对我国的医药事业起到很大的促进作用。同时，这些检测方法也是进行环境中抗生素含量检测的基础方法，对环境保护也能起到积极的作用。