中国生物工程杂志  2016, Vol. 36 Issue (5): 81-88 |
芋螺毒素(conotoxins，CTxs)是海洋肉食性软体动物芋螺(Conus)分泌的一类活性多肽，它们具有分子质量小、序列超变异、富含二硫键和作用靶点广泛等特点。CTxs能特异地作用于体内各种电压门控离子通道(Na、K、Ca)、配体门控离子通道(乙酰胆碱受体、5-羟色胺受体等)[1-3]。全世界有超过500种芋螺且每种芋螺中包含1 000多种CTxs，不同种类之间只有大约5%的CTxs重叠[4]，然而目前只有不到0.1%的CTxs得到研究。由于芋螺毒素分子质量小、选择专一性强，因此成为神经科学和药物学研究的重要探针，引起了人们的广泛注意[5]。
CTxs按照其信号肽序列和半胱氨酸(cysteine，Cys)模式的不同，可以将其分为若干超家族：O-、M-、A-、S-、T-、P-、 I-[6]。按照CTxs的药理学活性，可将这些超家族进一步分类，如A-超家族可分为α-、 αA-、 κA- 和ρ-conotoxins；M-超家族可分为μ-、ψ-conotoxins；O-超家族可分为ω-、μO、δ-和 κ-conotoxins；T-超家族可分为τ-和χ-conotoxins；等等。MrIA是2000年，由来自美国Utah大学的McIntosh等[7]和新加坡国立大学的Balaji等[8]分别从大理石芋螺(Conus marmoreus)获得的一种新型T超家族芋螺毒素。MrIA属于χ-conotoxins，能特异地抑制去甲肾上腺素转移体(noradrenaline transporter，NET)，NET是治疗神经性疾病，如抑郁、焦虑、强迫症等重要靶点[9]。在大鼠急性炎症神经痛模型上，MrIA也表现出了良好的镇痛效果[7,10]。MrIA的类似物Pyroglutamate1-MrIA (Xen2174)已经进入临床Ⅰ期[11]。
由于近几年环境破坏加剧，造成芋螺资源匮乏，而化学合成毒素成本高，毒性大等因素，限制了芋螺毒素的研究。本研究按照E.coli偏爱密码子设计mria基因，将基因串联后与表达载体pET-31b(+)连接，构建了高效表达MrIA融合蛋白的重组体，在BLR(DE3)pLysS菌株中进行了诱导表达并对表达条件进行了优化。表达后的融合蛋白经过切割、纯化，可以大量获得rMrIA，并对rMrIA的镇痛活性进行了验证。该方法为MrIA的获得提供了新的方法，也为其他小分子CTxs的表达提供了经验。
1 材料与方法 1.1 材 料 1.1.1 质粒与菌株表达载体pET-31b(+)，E.coli DH5α，E.coli BLR(DE3)pLysS菌株为本实验室保存。包含乙酰胆碱受体(nAChRs)亚基基因的质粒获赠于美国犹他大学。mria基因引物合成和测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
1.1.2 试剂和仪器限制性内切核酸酶Alw NⅠ购自美国NEB公司。DNA片段纯化试剂盒、小量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、T4 DNA连接酶、碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，CIAP)、PCR所用的dNTP和Taq酶、DNA Marker均购自TaKaRa公司；小量质粒提取试剂盒购自Omega公司；Tris、甘氨酸和聚丙烯酰胺购自美国Bio-Rad公司；C18分析柱(5μm,4.6mm×250mm)和半制备柱(10μm,22mm×250mm)购自美国Grace Vydac公司；镍亲和层析柱购自德国Macherey-Nagel公司；异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)购自美国 Sigma 公司；乙腈(ACN)、三氟乙酸(TFA)购自美国Fisher公司；其他常用生化试剂均为国产分析纯。美国Axon 900A膜片钳系统，美国Waters液相系统，美国IITC Life Science公司Model 39小鼠热板系统等。
1.1.3 实验动物SPF级昆明种小鼠，雌性，体重20~25g，购自广东省医学实验动物中心，合格证号：SCXK 2013-0002。雌性非洲爪蟾(Xenopus laevis)购自美国eNaso公司，使用时实验室饲养2周以上。
1.2 方 法 1.2.1 表达载体的构建根据mria前体基因(NCBI: GQ981407)，选取成熟肽部分，按照E.coli偏爱密码子设计引物P1、P2(表1)。两种引物(100pmol/μl)1∶1混合后，99℃变性，缓慢冷却至30℃退火。退火产物(100pmol/μl)纯化后，在T4 DNA连接酶作用下16℃自连接过夜。双链DNA小片段自连形成不同大小的DNA串联重复体，3%琼脂糖凝胶电泳检测串联片段，并对长度为42~1 000bp大小的DNA片段进行切胶回收。提取质粒载体pET-31b(+)，利用限制性内切核酸酶Alw NⅠ对载体进行酶切，将单酶切后的载体pET-31b(+)纯化，并用CIAP处理使载体末端去磷酸化。将纯化后的基因串联片段与去磷酸化后的载体片段按3∶1的比例混合，在T4 DNA连接酶作用下，16℃连接12h。连接产物转化感受态细胞DH5α，通过PCR和测序对重组体进行鉴定。目的基因可与载体上的酮类固醇异构酶(ketosteroid isomerase，KSI)基因和组氨酸标签(His6-Tag)基因形成串联体，表达产物为包含KSI和His6-Tag的融合蛋白(KSI-MrIAn-His6)。通过溴化氰(cyanogen bromide，CNBr)识别KSI、MrIAn和His6 之间的甲硫氨酸(methionine，Met)对融合蛋白进行特异性切割并纯化，可以得到表达的芋螺毒素MrIA。MrIA重组载体构建策略如图1所示。
| Primer name | Primer sequence (5′-3′) | Size (bp) |
| P1 | ACATGGATGGCACAACTTATAGCCACAGCAAACACCGTTCAT | 42 |
| P2 | AACGGTGTTTGCTGTGGCTATAAGTTGTGCCATCCATGTATG | 42 |
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| 图 1 MrIA重组载体构建策略图 Figure 1 Strategy for construction of recombinant conotoxin MrIA |
测序正确的重组体质粒转入表达菌株BLR(DE3)pLysS中，涂板后37℃恒温培养14~16h。挑取单克隆接种于含有氯霉素和氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养12h。按1∶40的体积接种到1L新鲜LB培养基中，37℃，培养2~3h，当OD值到达0.6~0.8时，加入终浓度为1mmol/L的诱导剂IPTG，37℃诱导表达3~6h，12% 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测目的蛋白的表达情况。4℃、5 000×g离心收集菌体。将菌体沉淀溶于40ml 1×Binding Buffer (40mmol/L Tris-HCl pH7.9,500mmol/L NaCl)，4℃超声，8 000×g离心20min。离心后弃上清液得到包涵体沉淀，用含8mol/L尿素的1×Binding Buffer (40mmol/L Tris-HCl pH 7.9,500mmol/L NaCl,8mol/L urea)溶解沉淀。12% SDS-PAGE检测上清液和包涵体沉淀中蛋白质的组成情况。将包涵体溶液用0.22μm滤膜过滤后，用镍亲和层析柱进行纯化。10倍柱体积的含8mol/L尿素的1×Binding Buffer平衡后上样，然后用1×Elution Buffer (10mmol/L imidazole,40mmol/L Tris-HCl pH 7.9,500mmol/L NaCl,8mol/L urea) 洗去镍柱中非特异结合的杂蛋白质，分别收集洗脱蛋白质。最后用2~3个柱体积的1×Elution Buffer (250mmol/L imidazole，40mmol/L Tris-HCl pH 7.9,500mmol/L NaCl,8mol/L urea)特异性洗脱目的蛋白，收集洗脱液进行SDS-PAGE检测。
1.2.3 蛋白质的切割、纯化和鉴定将纯化后包含目的蛋白的溶液室温对ddH2O透析过夜，截留分子质量大于10kDa的蛋白质样品。透析后蛋白质样品冻干，加入CNBr裂解，室温避光，充入N2保护下进行切割。反应12h后，将样品溶液旋转蒸发，用10ml 40% CH3CN/60% H2O/0.1% TFA溶液溶解切割反应产物，0.22μm滤膜过滤后，反向高压液相层析(RP-HPLC)对切割产物进行分析纯化(溶剂A为 0.075% TFA水溶液,溶剂 B为0.05% TFA、90% ACN,梯度洗脱条件:5%~40%B 20min)。纯化得到的切割后产物rMrIA用电喷雾电离质谱(electrospray ionization-mass spectrometer，ESI-MS)鉴定其分子质量。
1.2.4 生物活性检测将纯化冻干后的表达芋螺毒素rMrIA用生理盐水溶解，浓度为1nmol/μl。选取体重(20±2)g 雌性小鼠，室温，将小鼠放在温度为(55±0.5)℃的恒温金属板上，以小鼠足底接触金属板开始计时，至其出现舔后足或跳跃的时间为其痛阈指标[12]。未给药实验小鼠的痛阈作为基础痛阈，取基础痛阈为5~40s的小鼠作为实验鼠。将符合条件的小鼠随机分为3组，每组10只。组1：生理盐水(Saline)组，侧脑室注射10μl,阴性对照组；组2：吗啡(Morphine)组，腹腔注射100μl，注射剂量每只小鼠250nmol，作为阳性对照组；组3：rMrIA组，侧脑室注射10μl。记录小鼠在给药后30min、60min、90min、120min、150min痛阈值。对数据结果采用双因素方差分析，考察小鼠给药前后痛阈值的变化。
1.2.5 电生理靶点鉴定检测rMrIA是否作用于nAChRs。将包含nAChRs亚基基因的质粒体外转录获得相应的cRNA。将cRNA按种类混合后注入非洲爪蟾卵母细胞内。17℃，含抗ND96(96mmol/L NaCl、2.0mmol/L KCl、1.0mmol/L MgCl2·6H2O、1.8mmol/L CaCl2·2H2O、5mmol/L HEPES，pH 7.5)生理液中培养3~5天，利用Axon 900A膜片钳系统检测受体的表达情况。将浓度为10μmol/L的rMrIA加入细胞槽中，考察rMrIA与nAChRs各个亚型之间的相互作用。电压钳实验条件：钳制电压－70mV，灌流速率2ml/min，电极电阻0.5~2MΩ，蛙卵在1min的记录时间内，给予2s的乙酰胆碱(ACh)刺激。
2 结 果 2.1 基因片段的串联和载体的构建根据E.coli密码子的偏好性在生工生物工程(上海)股份有限公司合成了5′端磷酸化的mria基因引物。退火后双链DNA大小为42bp[图2(a)]且具有3′-GTA-5′黏性末端，在T4 DNA连接酶作用下可自连形成长度为42~1 000bp的DNA片段[图2(a)]。纯化后DNA串联片段，与AlwNⅠ酶切线性化的载体pET-31b(+)连接并转化至E.coli感受态细胞DH5α，提取重组质粒，选用插入位点上下游两段特异性引物KSI引物(5′-GCAAGGTGGTGAGCATCC-3′)和T7末端引物(5′-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3′)进行PCR鉴定。PCR结果显示，扩增出长度为100~200bp的4条带[图2(b)]，表明插入了不同大小的基因片段。重组质粒测序结果显示，第2、3、4泳道对应的重组质粒中分别有1个、2个、3个基因串联片段插入到了表达载体pET-31b(+)中，且插入序列与mria基因序列完全一致，表明重组表达载体构建成功。将重组载体分别命名为pET-31b(+)-MrIA、pET-31b(+)-MrIA2、pET-31b(+)-MrIA3。
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| 图 2 琼脂糖凝胶电泳检测串联小片段和PCR扩增产物 Figure 2 Agarose gel electrophoresis analysis of the MrIA gene tandem repeats and PCR products (a) 3% agarose gel electrophoresis analysis the gene and gene tandem repeats M: DNA marker DL2000; 1: The annealed products molecular weight 42bp; 2: Gene tandem repeats molecular weight range from 51 to 1 000bp (b) 2% agarose gel electrophoresis analysis PCR products M: DNA marker DL2000; 1: pET-31b(+) PCR product; 2: pET-31b(+)-MrIA PCR product; 3: pET-31b(+)-MrIA2 PCR product; 4: pET-31b(+)-MrIA3 PCR product |
提取重组载体质粒，转入表达菌株BLR(DE3)pLysS中，进行诱导表达。表达产物经SDS-PAGE分析后，表明重组蛋白主要以包涵体的形式存在，在全蛋白质中所占比例较大，分子质量大小为14~18kDa(图3)。重组蛋白C端含有6个His标签，可以通过Ni金属螯合层析得以纯化。完全溶解的包涵体溶液，0.22μm滤膜过滤后，上样至50ml的Ni亲和层析柱中，分别用含5mmol/L、10mmol/L imidazole的1×Binding Buffer洗去不与柱子结合和结合不紧密的杂质蛋白。最后用高浓度imidazole(250mmol/L)的1×Elution Buffer将目的蛋白特异性洗脱。洗脱蛋白的纯度通过12% SDS-PAGE进行鉴定(图3)。通过不同的诱导时间(3~7h)和不同的IPTG浓度(终浓度分别为0.1mmol/L、1mmol/L、10mmol/L、100mmol/L)对3个重组体的诱导表达的条件进行了优化。结果表明，扩大培养后，诱导表达6h，每种重组体中目的蛋白的表达量达到最大。另外在5个不同浓度的IPTG诱导下，诱导6h，IPTG终浓度为1mmol/L时，重组蛋白的表达量达到最大(图4)。
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| 图 3 SDS-PAGE检测重组蛋白的表达和纯化 Figure 3 Production and purification of recombinant rMrIA fusion proteins in E.coli as analyzed by 12% SDS-PAGE M: Protein marker;1:pET-31b(+) total protein after IPTG introduction;2:pET-31b(+)-MrIA after IPTG introduction; 3: pET-31b(+)-MrIA2 after IPTG introduction; 4:pET-31b(+)-MrIA3 after IPTG introduction;5:pET-31b(+) fusion protein purification by Ni Chelation Chromatography;6: pET-31b(+)-MrIA fusion protein purification by Ni Chelation Chromatography; 7:pET-31b(+)-MrIA2 fusion protein purification by Ni Chelation Chromatography;8: pET-31b(+)-MrIA3 fusion protein purification by Ni Chelation Chromatography |
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| 图 4 不同浓度IPTG诱导表达情况的差异 Figure 4 Introduction recombinant KSI-(MrIA)n-His6 with different concentration IPTG (a)KSI-His6 (b)KSI-MrIA-His6 (c)KSI-(MrIA)2-His6 (d)KSI-(MrIA)3-His6 |
1L培养基可纯化重组蛋白约0.8~1g。重组蛋白以融合蛋白的形式存在，包含KSI、CTxs rMrIA、His-Tag三个部分，KSI、His-Tag与rMrIA连接之间的Met可以被CNBr特异性的切除，从而释放可溶性的rMrIA。切割反应在室温、N2保护的避光的密闭烧瓶中进行。切割产物经RP-HPLC进行纯化。C18半制备柱收集切割产物的不同组分，用C18分析柱对收集产物进行纯化鉴定。结果表明，在214nm检测波长下，rMrIA出峰洗脱时间为12.8min，对应B液的洗脱浓度为22%[图5(a)]。收集分析柱纯化后rMrIA，进行ESI-MS鉴定，分子质量为1 523.59Da，比理论分子质量1 527.8Da少了4个H原子，表明表达的rMrIA分子内形成2对二硫键[图5(b)]。
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| 图 5 反向高效液相层析分析和质谱鉴定rMrIA Figure 5 Analytical RP-HPLC and ESI-MS analysis the recombinant protein rMrIA after CNBr cleavage products (a)The CNBr reaction mixture was extracted 40% CH3CN/60% H2O/0.1% TFA and injected onto a Vydac(5μm,4.6 mm × 250 mm) RP-HPLC column,and a linear gradient 0~40% eluate B over 20min,where B= 0.05% TFA,90% acetonitrile in H2O,A= 0.075% TFA in H2O. Peptide peaks were detected by UV absorbance at 214nm (b) ESI-MS confirmed the molecular mass of the recombinant protein rMrIA after CNBr cleavage |
MrIA是一种T超家族芋螺毒素，能特异地作用于NET。天然的MrIA在小鼠热板实验上，能有效的提高小鼠的痛域值，表现出良好的镇痛活性[7]。我们也在小鼠热板实验上验证了rMrIA的活性。结果表明，侧脑室给药10nmol，小鼠在给药后30~90min，基础痛域较生理盐水对照组有了显著的提高。由原来的10s提高了大约1倍。90min后，镇痛效果开始减弱，痛域值下降，150min后，基本恢复正常，与阴性对照组注射同等剂量的生理盐水相当。同时设置Morphine组为阳性对照组，结果显示，给药后90min前，rMrIA的镇痛效用优于Morphine；90min后，rMrIA的作用逐渐减弱，Morphine可以持续1h以上(图6)。
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| 图 6 rMrIA小鼠热板实验 Figure 6 rMrIA Effect on mice Hot-Plate Test:Effect on 55℃ hot plate latencies of conotoxin rMrIA (1nmol/μl) at 30min,60min,90min,120min,150min after intracerebroventricularly injection 10μl. All mice were divided in three groups,each group contained ten mice. GroupⅠ: Normal Saline; GroupⅡ: Morphine; GroupⅢ: rMrIA. rMrIA at 10nmol/10μl doses can significantly increased the reaction time to the thermal stimulus at 30min,90min after treatment (P< 0.05) |
由于MrIA序列与α-CTxs相似，序列短且含有4个半胱氨酸，而α-CTxs以nAChRs为靶点，因此我们利用蛙卵细胞表达的nAChRs模型对rMrIA的靶点进行了筛选。结果显示，10μmol/L浓度下，rMrIA对nAChRs各个亚型均无明显作用(图7)。对多数α-CTxs，它们的活性形式是半胱氨酸以1-3,2-4方式连接，形成globular高级结构，因此推测MrIA虽然含有4个半胱氨酸，也形成了二硫键，但是连接方式与α-CTxs不同。
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| 图 7 rMrIA对nAChRs不同亚型的检测 Figure 7 rMrIA tested different subtype of nAChRs (a)10μmol/L rMrIA for α3β4 nAChRs (b)10μmol/L rMrIA for α1β1εδnAChRs (c)10μmol/L rMrIA for α9α10 nAChRs |
MrIA是来自于大理石芋螺(Conus marmoreus)的一种T超家族的芋螺毒素。它序列较短，与α-CTxs结构相似，但是二硫键连接方式不同。通常天然的α-CTxs二硫键连接方式是1-3,2-4，天然MrIA二硫键连接方式是1-4,2-3[13]；绝大多数α-CTxs C端酰胺化，而天然肽MrIA 末端未酰胺化[13]。MrIA能特异地作用于NET，而对其他受体没有作用，包括一些单胺神经递质转运体和乙酰胆碱受体。MrIA在神经疼痛模型上表现出良好的镇痛活性，因此MrIA及其相关的一些结构类似物，如Xen2174也被用于神经性疼痛的研究，而且有望为持续性神经痛患者提供新的治疗方法[10,13-14]。由于近几年环境污染，造成芋螺资源匮乏，目前已经很难在近海采集到芋螺样品，这样大大限制了CTxs的研究。传统获得CTxs是通过固相合成的方法，但是化学合成成本高、毒性大，限制了CTxs的研究。因此，基因工程的方法为CTxs的获取和研究提供了新的途径。目前，已有一些CTxs在E.coli和酵母中成功进行了表达[15-16]，但是这些方法中表达的CTxs与天然序列存在明显差异，N端或者C端有多余的氨基酸标签，有些甚至是融合蛋白的形式，这大大影响了表达CTxs的活性。
天然肽MrIA中第12位的脯氨酸(Pro)是羟基化的，而rMrIA中的Pro未羟基化，但是丙氨酸扫描实验结果表明，MrIA与NET的作用主要依赖于Tyr7、Lys8、Leu9三个氨基酸残基，而11位His和12位羟脯氨酸与受体间的相互作用比较弱，因此通过原核生物(如E.coli)表达的rMrIA对MrIA的活性影响不大[17-18]。由于小肽分子质量小，难于纯化，因此，采用了融合表达和串联表达的策略，mria基因的串联，不仅改变了表达基因的大小，而且提高了表达的产率[19]。结果显示，3串重复体最终得到的纯化rMrIA比单串提高了约4倍。为了避免小肽降解，方便重组蛋白的纯化，分别在N端和C端引入了KSI和His-Tag，使目的蛋白以融合蛋白的形式表达，KSI促使融合蛋白以包涵体的形式存在，方便了表达蛋白的纯化[20]。6个His标签可以使目的蛋白通过Ni亲和层析得以纯化。为了保证目的蛋白的活性，最终产物可以用CNBr进行特异性化学切割，CNBr可以识别肽段之间的Met，使rMrIA从融合蛋白中释放出来，保证了表达CTx rMrIA的活性。另外，CNBr在切割融合蛋白的时候，会发生副反应，使rMrIA末端发生酯化，加入N2保护后，有效降低了副反应的发生。实验过程中对表达条件进行了优化，结果显示，对于不同大小的3个重组体，都是在诱导表达6~7h目的蛋白的表达量达到最大，其中1串和3串融合蛋白在细菌总蛋白质中的比例最大，可以达到50%。另外考察了不同浓度IPTG对表达效率的影响，结果显示，当加入IPTG浓度高于1mmol/L时，重组蛋白的表达量显著增加，但是如果IPTG浓度过高，加入100mmol/L反而导致重组蛋白表达量下降。1~10mmol/L浓度的IPTG对3种重组体的影响差别不大，针对1、2、3串重组体，1mmol/L的IPTG是最优表达浓度。
MrIA的类似物Xen2174在大鼠坐骨神经慢性压迫损伤(chronic constriction injury，CCI)表现出了良好的镇痛活性[10]。为了证明rMrIA的活性，我们选用了小鼠热板(hot plate)实验模型。该方法可以通过小鼠对热刺激出现痛反应时间的改变，评价药物的镇痛效果，较适用于中枢性镇痛药[12]。侧脑室给药10nmol，rMrIA给药后30min就表现出良好的镇痛效果，且给药150 min后，动物恢复正常。
本研究在E.coli中成功表达了重组融合芋螺毒素MrIA，并通过Ni亲和层析、化学切割、RP-HPLC，获得了纯度大于95%的芋螺毒素rMrIA。小鼠热板实验表明，纯化的rMrIA具有良好的镇痛活性。该研究为MrIA功能的研究提供了基础，也为其他CTxs的表达提供了方法。
致谢
本研究获得海南大学青年基金(qnjj1216)项目资助
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表1(Table 1)
