2016, Vol. 36文章信息
- 李帅, 单洪瑜, 董晓雨, 郭长虹, 郭东林
- LI Shuai, SHAN Hong-yu, DONG Xiao-yu, GUO Chang-hong, GUO Dong-lin
- 磷酸肌醇磷脂酶C在DREB2表达调控中的作用
- The Role of Phosphoinositide Phospholipase C in Expression Regulation of DREB2
- 中国生物工程杂志, 2016, 36(4): 110-115
- China Biotechnology, 2016, 36(4): 110-115
- http://dx.doi.org/10.13523/j.cb.20160416
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文章历史
- 收稿日期: 2015-12-24
- 修回日期: 2016-01-12
非生物胁迫如低温、干旱、盐碱等对植物的生长发育有不利的影响。植物中有许多基因与抗非生物胁迫相关，例如编码抗逆相关蛋白的结构基因以及与信号传递相关的转录因子。DREB(dehydraton-responsive element-binding)是植物特有的抗非生物胁迫相关的转录因子，主要参与低温、干旱等胁迫应答[1]。植物受到胁迫时，复杂的信号转导激活DREB2转录因子，其AP2保守结构域与抗性相关基因启动子中的CRT/DRE基序(c-repeat/Drought Responsive Elements)结合，从而上调许多逆境诱导基因的表达，在整体上提高植物的抗逆性[2]。
响应于各种胁迫激活的磷酸肌醇磷脂酶C(PI-PLC)是植物磷脂信号系统的重要组分。当植物受到胁迫时，PI-PLC介导的信号途径在非生物胁迫耐受中发挥重要的作用。本文阐述了DREB2转录因子和PI-PLC的研究进展、在生物工程上的应用以及PI-PLC对DREB2的表达调控机理。
1 DREB2转录因子DREB家族分为6个亚家族( A1～ A6)，DREB2转录因子属于A2亚家族。继拟南芥之后，现已从多种植物中分离得到DREB2基因。研究发现DREB2基因能够响应胁迫的诱导，能够提高植物的耐脱水性、耐热性和耐盐性、抗旱性等胁迫抗性。
1.1 DREB2转录因子的结构DREB2转录因子的N-末端是富含碱性氨基酸的核定位信号区，含有一段高度保守的CMIV-1基序，中间是由58个氨基酸残基组成的一个保守的AP2结构域，其中位于14位的缬氨酸和19位的谷氨酸在其与顺式元件的结合中起重要作用(图 1)[3]，C-末端是酸性转录激活区。
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| 图 1 DREB蛋白AP2/EREBP结构域的氨基酸序列比对 Fig. 1 Amino acid sequence alignment of conserved AP2/EREBP domain of DREB proteins |
1998年，Liu等[3]根据已确立的DRE元件，利用酵母单杂交的方法，从低温处理的拟南芥cDNA文库中分离得到了DREB2A、DREB2B。Sakuma等[4]经序列同源性比较后，从拟南芥中克隆了6个DREB2同源基因，命名为DREB2C-DREB2H，并进行了功能的研究 。
随着第一个DREB2被发现，目前已从多种植物中分离得到DREB2。例如，2003年，Dubouzet等[5]得到了水稻OsDREB2，2007年，Qin等[6]报道了玉米ZmDREB2A基因。除此之外，2009年，Chen等[7]从胡杨中分离出PeDREB2基因。2010年，Parinita等[8]报道了来自于御谷的强转录因子PgDREB2A。2011年，Bihani等[9]从海蓬子中分离得到SbDREB2A。2013年，Zhao等[10]和Mizoi等[11]分别获得海棠苹果的MsDREB2C基因和大豆GmDREB2A。2014年，Kudo等[12]从蔬菜莴苣中分离出LsDREB2A，2014年，Ayan等[13]得到豇豆VuDREB2A，同年，Li等[14]获得准格尔无叶豆EsDREB2B。
根据氨基酸序列差异，DREB2同源基因进一步划分为3个亚型[15]。大部分参与非生物胁迫应答的DREB2属于亚型1，包括拟南芥AtDREB2A、AtDREB2B和水稻OsDREB2A、OsDREB2B；亚型2包括AtDREB2D、AtDREB2G和OsDREB2C；亚型3仅含AtDREB2F和OsDREB2E。亚型2和亚型3不响应或轻度响应胁迫的诱导。
1.2.2 DREB2基因对非生物胁迫的响应DREB2基因主要参与干旱、高盐和高温胁迫应答，也响应低温和脱落酸(abscisic acid,ABA)，且不同的DREB2基因在植物的不同位置对非生物胁迫的诱导反应不一样，例如在拟南芥的8个DREB2基因中，AtDREB2A和AtDREB2B受干旱、氯化钠或热的诱导高表达，而对低温或ABA的响应较小。AtDREB2C、AtDREB2D和AtDREB2F在叶中受热和高盐的诱导微量表达。AtDREB2E在根中受ABA的诱导微量表达[16]。水稻中仅OsDREB2A和OsDREB2B响应非生物胁迫的诱导[17]。玉米ZmDREB2A、大豆GmDREB2A[18]和海蓬子SbDREB2A[19]受高温胁迫的诱导。
1.2.3 DREB2的功能研究拟南芥过表达DREB2A基因，其胁迫耐受性没有增强，用拟南芥原生质体进行分析显示，DREB2A的AP2/ERF DNA结构域旁有负调节结构域(NRD)，去除NRD使DREB2A转变成组成型活性形式(DREB2A CA)。拟南芥过表达DREB2A CA基因表现出耐旱性和耐热性的提高[20]。有研究者等[7]证实在拟南芥中过表达OsDREB2类基因时，只有OsDREB2B能激活靶基因的表达。拟南芥过表达大豆ZmDREB2A和胡杨PeDREB2，分别提高了耐脱水性、耐热性和耐盐性、抗旱性。莴苣LsDREB2A以及豇豆VuDREB2A分别提高了转基因拟南芥的耐盐性和抗旱性，GmDREB2A在拟南芥中的异源表达增强其高温的耐受性。海棠苹果MsDREB2C在拟南芥中过表达增加了其根和叶的生长以及脯氨酸水平，并且减少了水分的流失以及气孔的开度。
1.2.4 DREB2的应用前景随着越来越多的DREB2成功获得，DREB2功能上的研究也取得了很多有意义的进展，由于其能提高植物的非生物胁迫耐受性，已广泛地应用于生物工程领域。2008年，Fuminori等[21]将DREB2的同系物Wdreb2转入烟草中，提高了烟草的抗冻性和渗透胁迫的耐受性。准格尔无叶豆的EsDREB2B在烟草中异源表达可提高其非生物胁迫耐受性。PgDREB2A提高了烟草的耐盐性和耐渗透性。将海蓬子SbDREB2A转入水稻，提高了其产量以及抗旱能力。由此可见，不同来源的DREB2基因转入不同的植物中，能提高不同植物 的胁迫耐受性。上述分离获得的DREB2基因可以作为抗非生物胁迫的候选基因，在生物技术领域发挥重要的功能。
2 PI-PLC磷脂既是植物细胞膜的重要组成成分又在信号转导中起作用。根据降解磷酯键位置的不同，磷脂酶分为磷脂酶A1﹑磷脂酶A2﹑磷脂酶C和磷脂酶D[22]。其中，磷脂酶C水解甘油磷脂分子中的第3位磷酯键。植物磷脂酶C(PLC)根据水解底物的不同又分为三类：水解磷脂酰肌醇的PI-PLC、水解磷脂酰胆碱和其他磷脂的PC-PLC和水解糖基化磷脂酰肌醇锚蛋白的GPI-PLC[23]。
2.1 PI-PLC的研究进展 2.1.1 PI-PLC的调控途径PI-PLC受到外界激素、胁迫等刺激时被激活，水解磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(PIP2)，产生双信使分子肌醇1,4,5-三磷酸(IP3)[24]和二酰基甘油(DAG)[25]，其中水溶性的IP3由质膜扩散进入胞质溶胶促进释放Ca2+，在细胞中起传送和扩大信号的作用[26]。留在质膜上的DAG，被DAG激酶(DGK)磷酸化成PA[27]，来传递信号，PA作为植物中重要的第二信使，参与调节非生物胁迫[28]，通过与效应蛋白的直接互作进行细胞调控。其中PI-PLC/DGK途径既响应非生物胁迫[29]也能在未受刺激的植物中起积极作用。
植物PLC的激活与G蛋白有关，当信号分子识别并同受体结合后，激活G蛋白α亚基激活PI-PLC，由于G蛋白可刺激IP3的产生和钙离子释放，说明G蛋白对PLC有调节作用，且可能在PLC上游发挥调控作用[30]。目前已有证据表明，G蛋白α亚基可能参与PI-PLC产生IP3介导DNA合成的过程[31]。
2.1.2 PI-PLC参与生长调节研究表明植物的PI-PLC参与多种信号转导过程，在生长调节中起多方面的作用。Franklin-Tong等用PLC抑制剂新霉素证明花粉管存在着PLC活性。马力耕等[32]用PLC抑制剂U-73122发现蛇莓和百合花粉的萌发受到抑制。由此可见，PLC可能参与花粉管萌发的生理过程。
ABA是植物激素之一，调控植物的许多防御反应[33]。在植物中，PI-PLC积极参与ABA依赖性信号转导。ABA在气孔调节中引起保卫细胞的钙振荡从而影响到气孔的最终开度。Staxén等[34]发现PLC抑制剂U-73122也抑制ABA引起的钙振荡及气孔关闭，证实PLC参与ABA调节气孔的过程。
2.1.3 PI-PLC参与胁迫反应Munnik等[35]研究表明PI-PLC参与渗透胁迫诱导的细胞信号传导过程。不同的盐和渗透胁迫诱导剂处理下可快速提高IP3水平，但U-73122可以抑制IP3水平的升高。说明渗透胁迫诱导使PI-PLC活性增强造成IP3增加，表明PI-PLC参与渗透胁迫反应。高温胁迫下，豌豆细胞膜中的PI-PLC活性增加且在40分钟时达到最大[36]。与热胁迫处理的植物中PI-PLC蛋白的积累相一致[37]。热胁迫下，拟南芥IP3快速且大量的积累[38]。冷胁迫诱导的信号转导也涉及到PI-PLC途径。冬小麦组织，拟南芥悬浮细胞[39]和油菜叶受冷胁迫时IP3快速且瞬时积累。冷胁迫使得细胞膜刚性化，使得PI-PLC依赖的钙进入细胞，从而激活PI-PLC[40]。
3 PI-PLC调控DREB2基因的表达 3.1 PI-PLC对DREB2基因的负调控脂质信号发生在非生物胁迫中，也发生在未应激的细胞中，从而参与基底信号转导。所谓的未应激细胞不是没有细胞信号发生的细胞，而是通过基底信号活性来调控其稳态的细胞[41]。
目前，一般都是采用药理学方法研究脂质信号，尤其是PI-PLC参与的基因表达的基底调节。拟南芥细胞悬浮培养是一种用于研究特定的信号机制的简化模型。PI-PLC调控拟南芥中许多DREB基因的表达，例如DREB1A、DREB1C、DREB2。但是PI-PLC对DREB1A、DREB1C的诱导要比DREB2弱[42]。
PI-PLC调控DREB2的研究是通过分析DREB2对PI-PLC抑制剂的响应来进行的。新霉素和U73122是两种常用的PI-PLC的抑制剂，被广泛地用来抑制PI-PLC。已经证明新霉素能够在体外条件下抑制PI-PLC ，由于新霉素的溶血烷基磷脂酰胆碱结构抑制磷酸胞苷酰转移酶，可能会影响膜的结构[43]，产生副作用。U73122是一种氨基甾体，典型的PI-PLC活性抑制剂，能够在植物体外抑制PI-PLC[44]。它们对PI-PLC具有类似的抑制作用且会导致DREB2基因上调表达。
Nabila等使用新霉素/U73122处理植物，发现新霉素/U73122使拟南芥中的DREB2基因上调表达，这些改变可能受PI-PLC产生的PA的调控，抑制PI-PLC产生的PA会促进AtDREB2s与CRT/DRE的结合，使AtDREB2基因上调表达。RT-PCR分析了拟南芥所有DREB2基因对抑制剂的响应，除了DREB2D的表达不受调控且没有检测到DREB2F和DREB2G的转录水平外，其他所有的DREB2基因都被依地福新或U73122诱导。说明DREB2的表达受到PI-PLC途径产生的PA的抑制[6]。Perera等也证实PI-PLC负调控DREB2的表达，且PI-PLC产生的脂质和可溶性介质都参与负调控DREB2的表达。除此之外，PA也可以由PI-PLD分解PC而直接产生[45]。
3.2 PI-PLC对DREB2基因表达的正调控DREB2的表达调控不仅发生在基底条件下也发生在胁迫响应中。胁迫会造成Ca2+内流且细胞内IP3水平增加。IP3可以促使植物细胞内的Ca2+库释放Ca2+，使得细胞内Ca2+浓度上升，细胞内部发生一系列磷酸化级联反应，从而激活转录因子的表达。DREB2转录因子被激活后，其上的AP2结构域与下游功能基因启动子上的CRT/DRE顺式作用元件相结合，从而激活其表达，提高植物的抗逆性。基底PI-PLC抑制DREB2的表达，但活化的PI-PLC激发DREB2的表达，这两个过程主要的差别是PI-PLC底物和产物的含量不同。当胁迫激活PI-PLC，磷酸肌醇含量降低，PA含量增加[46]，会影响PA与靶肽的相互作用。在基底条件下，PA与高亲和性的靶基因作用。胁迫条件下，高浓度的PA与较低亲和性的靶基因相互作用，这些靶基因与高亲和性的靶基因不同，可能会产生相反的作用，正调控DREB2的表达。由此可见，PI-PLC既在基底条件下也在胁迫条件下对DREB2的表达起调控作用[6]。
4 展 望DREB转录因子在信号转导中发挥重要作用，应用在生物工程上可以提高植物的非生物胁迫耐受性，磷脂酶可以调控DREB转录因子在植物中的表达，PI-PLC在基底条件下负调控DREB2的表达，但在胁迫条件下，PI-PLC可以上调DREB2的表达，从而提高植物的综合抗逆性，使植物在不同且极具变化的环境条件下，迅速做出反应适应胁迫，减少损害。但是，目前通过利用PI-PLC来调控DREB2在生物工程领域方面的应用非常少，今后应加强这方面的研究。为DREB2转录因子的利用，提高植物对胁迫环境的适应性提供基础。
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