SND1(staphylococcal nuclease domain containing 1)蛋白，又称p100蛋白，Tudor-SN (tudor staphylococcal nuclease)，首次作为EBNA2 (Epstein-Barr virus nuclear protein 2，EB病毒细胞核抗原2)的转录调控激活因子被发现^[1]。细胞水平与分子水平的研究发现，SND1蛋白广泛表达于人^[1]、牛^[2]、小鼠^[3]、大鼠^[4]及拟南芥^[5]等物种中，可参与基因转录、剪接体加工、细胞增殖、细胞应激、RNA干扰、病毒感染等多种重要的细胞生物学事件^{[6, 7, 8, 9]}，还与哮喘、过敏、结肠癌、肺癌、肾癌、乳腺癌等多种人类疾病相关，肿瘤组织中SND1表达均有不同程度上升^{[10, 11, 12, 13, 14, 15, 16]}。小鼠SND1基因定位于染色体6A3.3，本实验针对小鼠SND1基因构建基因过表达小鼠模型，为深入研究该基因生物学功能提供体内研究模型。

野生型C57BL/6小鼠购自军事医学科学院。

小鼠SND1基因转录本(BC007126.1)购自复能基因公司。限制性内切酶BglⅡ，SalⅠ，BamHⅠ，XhoⅠ，NheⅠ，EcoRI，T4 DNA连接酶购自Thermo Scientific公司，2×Taq PCR Master Mix 试剂盒购于TaKaRa公司，trans1-T1感受态细胞、Trans2K Plus DNA Marker 购自全式金生物技术公司，质粒提取试剂盒购自BIOMIGA公司，PCR产物纯化试剂盒购于QIAGEN公司，胶回收试剂盒购于QIAGEN公司，蛋白酶K购于TaKaRa公司，Trizol 购于Invitrogen公司，逆转试剂盒购于Thermo Scientific公司，FastStar Universal SYAR Green Master(Rox)购于Roche Diagnostics公司。电泳槽、电泳仪购自Bio-Rad公司，StepOnePlus Real-Time PCR 系统购于Applied Biosystems公司。

对SND1基因转录本进行酶切位点分析,以EcoRI为分界点将ORF分为SND1-A和SND1-B两个片段。重组SND1过表达质粒设计原则为：(1)质粒中带有3×FLAG标签；(2)含有驱动SND1在哺乳动物载体的高水平表达的组合启动子CAG；(3)引入隔离子(Insulator)以减少插入位点对转基因表达的影响。

SND1-A片段获得：以小鼠SND1基因转录本为模板，上游引物F: 5′-AATAAT AGATCT ATGGCCTCCTCC GCGCAGA-3′ ,下游引物R：5′-AATAAT GTCGAC GCG GCCGC CTCGAG AAA GAATTCAGCTTCACAACAATGG-3′ 。PCR法扩增SND1-A片段。设计引物时在上游加入BglⅡ酶切位点，下游依次加入XhoⅠ、NotⅠ和SalⅠ酶切位点，PCR条件为95℃ 5 min，95℃ 30 s，58℃ 30s，72℃ 60 s，30个循环，72℃ 10min。PCR产物胶回收，纯化试剂盒纯化线性SND1基因A片段。SND1-B片段的获得：以小鼠SND1基因转录本为模板，上游引物F: 5′ CCA GCT CCA CAC ATGGCCTCCT-3′ ,下游引物R：5′-TTAGCGACTGTAGCCAAACTCA-3′，PCR法扩增SND1-B片段。其中设计引物时在上游含有内源性酶切位点，下游加入SalⅠ酶切位点。PCR条件为95℃ 5 min，95℃ 30 s，58℃ 30s，72℃ 60 s，30个循环，72℃ 10min。PCR产物胶回收，纯化线性SND1基因B片段。

(1)SND1-A片段双酶切处理：SND1基因A片段进行BglⅡ和SalⅠ双酶切处理,体系为：1μg DNA片段，1μl BglⅡ，1μl SalⅠ，2μl Buffer，超纯水至20μl。(2)3×FLAG标签的线性载体：以BamHI和XhoⅠ酶切pcDNA3.1 3×FLAG RheB质粒，获含3×FLAG标签的线性载体。体系：1μg 质粒，1μl BamHI，1μl XhoⅠ，2μl Buffer，超纯水至20μl。(3)SND1基因A片段与3×FLAG标签的线性载体连接。体系：载体与片段比例为1∶3，T4连接酶16℃过夜连接，次日转化、鉴定、测序、纯化，构建pcDNA3.1 3×FLAG SND1-A载体。因BamHⅡ与BglⅡ、XhoⅠ与SalⅠ均系同尾酶。所以人工修改了pcDNA3.1 3×FLAG上的酶切顺序，并且破坏BamHI和SalⅠ酶切位点，以便后面的载体构建。

(1)载体线性化：以酶切pCAG-MS2载体，切胶回收。体系：1μg pCAG-MS2载体，1μl NheⅠ，1μl FastAP，2μl 10×Fast Digest Buffer，超纯水至20μl，37摄氏度60min。(2)获得线性化片段：以内切酶XhoⅠ酶切pcDNA3.1 3×FLAG SND1-A载体获得带有3×FLAG 的SND1-A基因片段，切胶回收。体系：1μg 质粒，1μl XhoⅠ，2μl Buffer，超纯水至20μl(3)T4连接酶连接16℃过夜连接，次日转化、鉴定、测序、纯化，构建pCAG 3×FLAG SND1-A载体。(4)pCAG 3×FLAG SND1-A质粒线性化：以EcoRI和XhoⅠ酶切pCAG 3×FLAG SND1-A质粒，切胶回收。体系为：1μg 质粒，1μl EcoRI，1μl XhoⅠ，2μl Buffer，超纯水至20μl，37℃，60min。(5)SND1-B片段的线性化：EcoRI和SalⅠ双酶切处理，电泳分离、纯化线性SND1-B基因片段。体系：1μg DNA片段，1μl EcoRI，1μl SalⅠ，2μl Buffer，超纯水至20μl，37℃，60min。(6)T4连接酶连接：线性pCAG 3×FLAG SND1-A载体与线性SND1-B基因片段T4连接酶连接16℃过夜连接，并转化、鉴定、测序、纯化，构建pCAG 3×FLAG SND1载体。

(1)pInsulator empty载体的线性化：以SalⅠ酶切pInsulator empty载体，电泳分离切胶回收。体系：1μg质粒，1μl SalⅠ，2μl Buffer，超纯水至20μl。(2)pCAG 3×FLAG SND1载体线性化：以BamHI酶切 pCAG 3×FLAG SND1载体，获得带有3×FLAG和CAG元件的SND1基因片段。体系：1μg质粒，1μl SalⅠ，2μl Buffer，超纯水至20μl。(3)T4连接酶连接。体系：载体与片段比例为1∶3，T4连接酶16℃过夜连接，次日转化、鉴定、测序、纯化，构建pInsulator CAG 3×FLAG SND1载体。针对pInsulator CAG 3×FLAG SND1转基因载体设计引物，进行测序分析，鉴定是否存在点突变。根据图谱以I Ceu Ⅰ酶切此转基因载体，进行琼脂糖电泳鉴定。

取3周龄C57BL6母鼠置于明暗交替环境中饲养左右超排卵供体母鼠，5天后腹腔注射孕马血清 10 IU(0.1ml)，48h后注射hCG与单笼饲养的6周以上公鼠C57按1∶1比例合笼。同时取6周龄外阴潮红的发情期母鼠作为受体鼠，受体鼠与经结扎的公鼠合笼。次日清晨检查供体鼠与受体鼠是否有阴道栓，取可见阴道栓小鼠进行实验，断颈处死供体鼠，取出输卵管，置于M2培养液中，于解剖显微镜将形态完整，透明带清晰，原核清晰可见的受精卵分离，将外源线性 pInsulator CAG 3×FLAG SND1转基因载体注入小鼠受精卵雄性原核中，再将注射后存活的卵植入受体鼠输卵管中，移植后做好标记，每天观察出生幼鼠存活情况。

幼仔出生15天左右进行编号剪脚趾，样本加含蛋白酶K的裂解液进行裂解，次日抽提小鼠基因组DNA，并以此为模板进行PCR扩增鉴定。采用引物F：5′ GCAACGTGCTGGTTATTGT G；R：CTGGGTTGTTGGCTCTCAT。PCR条件为94℃ 5 min，94℃ 30 s，55℃ 30s，72℃ 60 s，30个循环，72℃ 10min，产物4℃保存，PCR产物大小为594bp。

取12周SND1过表达小鼠与WT小鼠各3只，开腹取肝脏，加1ml Trizol与7颗研磨珠，于组织匀浆器中匀浆3 min，离心取上清，Trizol法提取组织RNA，5μg 体系逆转为cDNA，采用引物F: CATTGCTGACAGGATGCAGAAGG R:TGCTGGAA GGTGGACAGTGAGGSND1 扩增Actb为内参，采用 F: TGTGCCACTGTCACCATTGGAG；R: CAGCTCATCGTAG TGTGAAGACC扩增SND1，以SYBR Green 20μl体系进行RT-PCR实验，-△△Ct法分析结果。

SND1基因转录本酶切位点分析(图 1)表明，小鼠SND1基因ORF片段较长且含有EcoRI和NheⅠ酶切位点，故根据后续载体特点，以EcoRI为分界点将ORF分为SND1-A和SND1-B两个片段。设计引物为SND1-A加入酶切位点(图 2)，PCR扩增并获得纯化线性SND1基因A片段，经双酶切处理与酶切线性后再与含3×FLAG标签的线性载体相连(图 3)，获得pcDNA3.1 3×FLAG SND1-A载体(图 4)。该载体进行双酶切获得纯化线性带有3×FLAG 的SND1-A基因片段，将其与、纯化线性pCAG-MS2载体相连获得pCAG 3×FLAG SND1-A载体(图 5)。经引物设计扩增的含SalⅠ酶切位点SND1-B片段与pCAG 3×FLAG SND1-A载体经双酶切分别获得纯化线性片段，经T4连接酶连接以后最终获得pCAG 3×FLAG SND1载体(图 6)。将带有3×FLAG和CAG元件的SND1基因片段与双酶切后的pInsulator empty载体(图 7)相连，并转化、鉴定、测序、纯化，最终获得pInsulator CAG 3×FLAG SND1载体(图 8)。

图 1 小鼠SND1基因ORF重要酶切位点 Fig. 1 Important restriction enzyme cutting site in mice SND1 ORF

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图 2 小鼠SND1基因A片段引物设计 Fig. 2 Primer design of the mice SND1 A gene segment

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图 3 pcDNA3.1 3×FLAG RheB质粒酶切及与SND1-A片段连接图谱 Fig. 3 The schematic diagram of pcDNA3.1 3×FLAG RheB vector and link with SND1 A gene segment

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图 4 pcDNA3.1 3×FLAG SND1-A质粒图谱 Fig. 4 The schematic diagram of pcDNA3.1 3×FLAG SND1-A vector

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图 5 pCAG 3×FLAG SND1-A质粒图谱 Fig. 5 The schematic diagram of of pCAG 3×FLAG SND1-A vector

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图 6 pCAG 3×FLAG SND1质粒图谱 Fig. 6 The schematic diagram of of pCAG 3×FLAG SND1 vector

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图 7 pInsulator empty载体图谱 Fig. 7 The schematic diagram of pInsulator empty vector

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图 8 pInsulator CAG 3×FLAG SND1质粒 Fig. 8 Map of pInsulator CAG 3×FLAG SND1 transgenic vector

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对重组质粒pInsulator CAG 3×FLAG SND1转基因载体进行序列分析，根据图谱以I CeuI酶切此转基因载体，然后进行琼脂糖电泳鉴定(图 9A)，可观察到M，N两条线性条带。针对M条带进行胶回收纯化处理，电泳鉴定在7 861bp左右得到较单一条带(图 9B)，与预期条带相符。

图 9 pInsulator CAG 3×FLAG SND1质粒的I Ceu I酶切鉴定及线性转基因载体纯化 Fig. 9 Cut by I CEU-I and purified by agarose gel before injection(a) I CEU-I cut(b) After purified

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对90只小鼠进行剪趾提取基因组DNA，PCR鉴定结果显示(图 10)：#2、#30、#39、#40、#43、#46、#56、#61、#64、#66、#73为阳性鼠。(备注：43#死亡)

图 10 SND1转基因小鼠首次剪趾PCR鉴定 Fig. 10 Result of the first identification of SND1 transgenic mice by PCR

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对于首次鉴定呈阳性的小鼠进行剪尾、抽取小鼠基因组DNA，并以其为模板，进行PCR鉴定，方法同上。鉴定结果(图 11)显示：#2、#30、#39、#46、#56、#61、#64、#66、#73为阳性鼠。

图 11 SND1转基因小鼠二次剪尾PCR鉴定 Fig. 11 Result of the second identification of SND1 transgenic mice by PCRPositive mice：2#、30#、39#、46#、56#、61#、64#、66#、73#. +: pInsulator CAG 3×flag SND1 plasmid as positive control；+/G: pInsulator CAG 3×flag snd1: B6 genomic DNA as 1∶10000；G: B6 genomic DNA as negative control；- H2O as blank control

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经PCR鉴定的小鼠提取肝脏组织mRNA，经逆转与RT-PCR实验验证SND1表达情况。鉴定结果(图 12)显示SND1转基因小鼠,其肝脏组织SND1表达量相对于野生型小鼠上升100倍以上，至此，SND1转基因小鼠模型构建成功。

图 12 SND1转基因小鼠RT-PCR鉴定 Fig. 12 Result of the first identification of SND1 transgenic mice by PCRThe expression of SND1 in liver ,the quantitative analysis was normalized using Actb,n=3,** P＜0.05

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SND1蛋白作为一种多功能蛋白，广泛表达于动物体内，首先被证实具有转录共激活作用。早期研究发现SND1参与细胞应激、细胞周期以及细胞增殖等过程，近期研究证实该蛋白与肿瘤侵袭迁移^[17]以及脂肪细胞形成^[18]相关。文献报道SND1参与前脂肪细胞的分化，Tudor-SN全身敲除小鼠MEF细胞不可以分化为成熟脂肪细胞，提示SND1对于哺乳动物的脂肪形成过程具有影响。本研究拟通过建立SND1过表达小鼠模型，基于该模型研究SND1在动物体内的生理学作用。

本研究利用SND1基因转录本，经过对酶切位点分析后采用PCR法获得SND1片段，经过酶切及连接在SND1基因的N段追加3×FLAG标签。载体构建过程中将SND1A，B两片段采用同一个内源性EcoRI，故避免了蛋白翻译的框移突变问题。而后通过构建pCAG 3×FLAG SND1质粒将CAG元件引入质粒中，将人工构建的组合启动子与载体相连，使其可以驱动SND1基因在哺乳动物载体高水平表达。最终使用隔离子来减少插入位点对转基因表达的影响，构建pInsulator CAG 3×FLAG SND1质粒。PCR及测序对质粒进行鉴定表明质粒构建成功。通过显微注射将纯化和线性化后的质粒注入受精卵，经胚胎移植最终构建SND1转基因小鼠。通过两次取组织PCR鉴定最终证实成功构建SND1过表达动物模型，小鼠顺利成活，无明显畸形及早衰现象。

研究表明，在细胞模型中SND1过表达将引起脂肪细胞的分化增加，而SND1不足的情况将导致脂肪分化减少。SND1蛋白能够结合到 PPARγ 靶基因的 PPRE 区，作为转录共激活因子激活下游基因的转录^[18]。因此，构建SND1转基因小鼠模型，可以在体内环境下探讨SND1蛋白的作用及其机制，可以进一步通过引入小鼠高脂饮食探讨SND1在脂肪组织形成中的作用，为探讨脂肪细胞形成、脂肪组织代谢提供研究材料。