植物一生中不可避免地受到外界环境因素的干扰。植物不能像动物一样迁徙和躲避这些环境刺激，因此为了生存，它们需要发展一系列的防卫机制来应对这些不利因素的影响。典型的响应包括增加分子伴侣蛋白(chaperones)、信号转导途径和胚胎发育后期丰富 (LEA,late embryogenesis-abundant) 蛋白的表达，渗透压调节，退化和修复系统的感应^[1]。脱水素(dehydrins，DHNs)是LEA Ⅱ亚家族蛋白，在种子发育后期大量积累，不同逆境胁迫处理，如缺水、盐、低温和ABA胁迫均能诱导其蛋白表达^[1]。

脱水素含有一个或多个独特的、高度保守的赖氨酸富集的K片段(EKKGIMDKIKEKLPG或类似的序列)，位于接近C末端的位置，与A2亲水性α-螺旋形成，以及与一些大分子结合有关^{[2, 3, 4]}。通常脱水素的序列中还包括Y和S片段。Y片段 [(V/T)DEYGNP或类似的序列]接近于蛋白的N末端，与分子伴侣的核苷酸结合位点有部分相似性。S片段包括若干个连续的色氨酸残基，是磷酸化位点^{[2, 3]}。YSK短链通常用来区分脱水素^[2]。根据不同的组合方式，脱水素分为YnSKn、YnKn、 SKn、 Kn 和 KnS五种类型^{[3, 5]}。

脱水素在细胞的不同组分，包括细胞质，细胞核，质膜，液泡膜，质体，线粒体和内质网中均有分布^[2]。紫花针茅(Stipa purpurea)DHN1蛋白属于SK3型，亚细胞定位研究显示SpDHN1定位在细胞质和细胞膜中^[5]。脱水素蛋白定位在细胞膜，可能与植物受到冷冻和脱水胁迫时对膜系统的保护功能有关^[6]。马铃薯(Solanum sogarandinum)脱水素基因DHN24在干旱和低温胁迫后定位在细胞质 ^[7]。

已有研究表明，脱水素在植物抵抗生物和非生物胁迫中具有重要的作用。过量表达紫花针茅DHN1基因提高了拟南芥对干旱的耐受能力^[5]。过量表达多毛番茄(Solanum habrochaites)脱水素基因ShDHN(SK3型冷诱导脱水素)能提高番茄抗冷、抗旱、抗盐和抵抗渗透胁迫的能力^[8]。红树(Avicennia officinalis)的脱水素基因AoDHN1的表达能被盐和干旱诱导，同时在盐和干旱处理下转入AoDHN1的大肠杆菌与对照相比生长速度更快，表明AoDHN1在抵抗这两种逆境胁迫中具有重要功能^[9]。通过克隆分析小麦的脱水素基因wzy2的启动子，发现其含有响应ABA、GA、MeJA和低温等处理的多种调控元件，qRT-PCR技术检测表明ABA、GA、MeJA和低温等处理能诱导wzy2基因的表达^[10]。三花龙胆(Gentiana triflora)脱水素基因GtDHN1和GtDHN2的表达能提高植物对干旱和冷冻的抵抗能力^[11]。此外，通过在拟南芥(Arabidopsis thaliana)脱水素ERD10 的K片段缺失研究中发现，脱水素K片段对拟南芥抑制大肠杆菌具有重要作用^[12]。随后有人在体外合成了水稻脱水素的K片段，通过体外抑菌实验，证明这一片段在抵抗革兰氏阳性细菌的重要作用^[13]。

中间锦鸡儿(Caragana intermedia)属于豆科(Fabaceae)锦鸡儿属(Caragana)蝶形花亚科 (Papilionoideae)植物，与柠条锦鸡儿、小叶锦鸡儿统称为柠条，分布于山西、陕西、宁夏及内蒙古自治区等省、区 ^[14]。柠条是典型的旱生植物，生态适应性极强。抗旱、抗寒、耐高温、耐瘠薄。同时，柠条具有防风固沙、保持水土的生态作用，还有薪炭材、饲用、制浆造板、药用等重要经济价值^{[14, 15]}。本研究在前期构建好的中间锦鸡儿干旱胁迫下抑制性削减杂交文库中筛选到了一条DHN1序列片段，在此基础上，对该基因进行全长克隆，并对获得的基因序列进行生物信息学和表达分析，对DHN1在中间锦鸡儿抵抗逆境中的功能进行探讨。

野生型拟南芥(Col 0)由本实验室保存，中间锦鸡儿种子采自内蒙古四子王旗。

大肠杆菌DH5α和根癌农杆菌GV3101为实验室保藏菌种。

克隆载体pEASY-Blunt和pMD19-T载体分别购自全式金公司和大连宝生物工程有限公司(TaKaRa)。表达载体pCanG和pCambia1302均由本实验室保存。

限制性内切酶NcoⅠ、SacⅠ、SalⅠ和SpeⅠ以及T4连接酶均购自NEB(New England Biolabs)；RACE 试剂盒、PrimeSTAR HS DNA Polymerase、DNaseⅠ(RNase free)、RNase Inhibitor 、Oligo(dT)₁₈、反转录酶M-MLV、dNTPs等购自大连宝生物工程公司(TaKaRa)；DNA Marker购自Fermentas公司；胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒均购自天根生物科技公司(TIANGEN)；潮霉素(Hygromycin)购自Sigma公司；氨苄(Ampicillin)和卡那霉素(Kanamycin)购自BBI公司(BIO BASIC INC)；PCR引物由上海生物工程有限公司合成。

中间锦鸡儿培养：将种子种脐向上种入装有营养土(蛭石与营养土按2∶1混匀)的培养钵中(1~2cm深)，培养温度22℃，光周期16h光照/8h黑暗，培养30天用于植物胁迫处理。

拟南芥培养：将酒精灭菌后的种子加入无菌水，4℃黑暗春化3天后，播种于装有蛭石的培养钵中并置于温室培养，待长出2片真叶后，移至浸透营养液的蛭石与营养土为2∶1的混合土中继续培养，培养温度22℃，光周期16h光照/8h黑暗。

选取培养钵中生长30天且长势一致的中间锦鸡儿小苗，分别进行以下处理：

将小苗轻轻地从营养土中取出并用清水清洗净(尽量避免损伤)，再进行脱水胁迫(将小苗有序地放置于滤纸进行脱水处理)、及盐胁迫(根部浸泡在200 mmol/L的NaCl溶液中)，最后用ABA处理(根部浸泡于100 μmol/L ABA水溶液中)。

将幼苗连同培养钵分别置于4℃和45℃培养箱中进行冷胁迫处理和热胁迫处理(及时补充水分)。

在处理的不同时间点，除脱水胁迫外(0、1、3、8、12和24h)，其余处理0、0.5、8、12和24h进行样品收集，每个时间点取3株小苗的地上部分，迅速放入液氮速冻并于－80℃冰箱保存。每种处理均进行3次重复实验。

总RNA提取利用Trizol试剂，详细步骤参见说明书。cDNA的合成使用M-MLV反转录酶(TaKaRa公司)，具体步骤按产品说明书进行。

利用罗氏 LightCycler 480 Real-Time PCR System，采用2^-ΔΔCT方法对CiDHN1基因表达量进行分析，以中间锦鸡儿的EF1α为内参基因。详细方法参考文献^[16]。引物序列如下：

CiEF1α：TGGGTGGGACATTCTCTGATT/GCACGGT TCACTTCTTCTTAGC

CiDHN1: GGTCATGGTCATGGTCATCGTC/TGCTT CTGTGCCCCCAGTAGTT

根据从中间锦鸡儿干旱胁迫抑制消减杂交(SSH)文库中获得CiDHN1序列片段设计3′和5′ RACE扩增引物，并进行CiDHN1 cDNA的3′和5′末端快速扩增，具体设计方法和实验步骤严格遵照3′RACE和5′RACE试剂盒(TaKaRa公司)说明书。引物序列如下：

3′RACE: CCCTGAGCCAAGTTGACCA/ ATGAGTA TGGAAATCCCCTGAG

5′RACE: GGATTTCCATACTCATCGGTC/ CATATT GGTCAACTTGGCTCA

将扩增的基因片段测序后，利用Vector NTI Advance 10. 3将测序结果与库中中间片段进行拼接获得CiDHN1全长序列。

对通过拼接获得的CiDHN1全长序列进行引物设计，以中间锦鸡儿cDNA和gDNA为模板，利用上游引物: GCgtcgacATGGCACAATATCAGCAGGGT下游引物: GCgagctcCTAGTGTTCTCCAGAAAGTTTATCC，对目的基因进行扩增，反应程序如下：98℃预变性1min；98℃变性15s，57℃退火15s，72℃延伸1min，进行 30个循环；72℃补充延伸10min。

将扩增获得的目的片段连入克隆载体pEASY-Blunt Cloning-Vector并转化大肠杆菌DH5α，转化子进行PCR鉴定后，将阳性克隆进行测序分析。

利用NCBI 的Blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)对克隆获得全长序列进行序列比对，利用ORF finder工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)和 Spidey (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/IEB/Research/Ostell/Spidey/) 分别对开放阅读框、外显子和内含子的分布情况进行分析。通过ExPASy数据库中的ProtParam软件(http://www.expasy.org/proteomics)对氨基酸序列的分子质量、理论等电点、蛋白稳定性、总亲水性等理化性质等进行推测，HNN工具 (http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_hnn.html) 对蛋白质的二级级结构进行预测。

过表达载体构建：利用限制性内切酶SacⅠ/SalⅠ将1.2.5 中的经过测序验证的目的基因片段切下，并通过T4连接酶将目的基因片段与同样经过SacⅠ/SalⅠ酶切的线性的pCanG载体(含有35S启动子)连接，由此获得重组表达载体，命名为35S∷CiDHN1。

CiDHN1与GFP融合表达载体构建：

以中间锦鸡儿cDNA为模板，利用上游引物： GCccatgGCACAATATCAGCAGGGTG，下游引物： GCactagtGTGTTCTCCAGAAAGTTTATCCTTG对目的基因进行PCR扩增，PCR产物纯化后连入到克隆载体 pEASY-Blunt Cloning-Vector。测序验证后，利用限制性内切酶NcoⅠ/SpeⅠ将经过测序验证的目的基因片段切下，并通过T4连接酶将目的基因片段与同样经过NcoⅠ/SpeⅠ酶切的线性的pCambia1302载体(含有35S启动子)连接，由此获得重组表达载体，命名为35S∷CiDHN1-GFP。

通过电转化法将重组表达载体导入到农杆菌GV3101中，采用浸花法^[17]转化野生型拟南芥，利用潮霉素和卡那霉素筛选抗性植株。

将经表面消毒的T₂代种子，播种于含有15 μg/ml潮霉素的1/2 MS固体培养基平板上，4℃放置3 d后，移至温室竖直培养，培养6 d后，取抗性苗的根置于载玻片上并滴加水包埋，盖上盖玻片封片后，利用荧光显微镜观察GFP荧光信号。

以中间锦鸡儿cDNA为模板，通过RACE技术克隆获得CiDHN1基因的cDNA 3′末端序列673bp，5′末端序列422bp(图 1)，对这段末端序列测序后利用Vector NTI 10.3 Advance与SSH文库中的中间片段拼接，最终得到CiDHN1基因拼接序列开放阅读框为891bp。

图 1 CiDHN1基因末端序列RACE扩增结果 Fig. 1 The terminal sequence of CiDHN1 by RACE amplification(a) 3′ RACE amplification of CiDHN1 M: 1kb DNA Marker; 1,2: 3′ terminal sequence of CiDHN1 (b) gDNA amplification of CiDHN1,M: 1kb DNA Marker; 1,2: 5′ terminal sequence of CiDHN1

图选项

为了进一步验证拼接序列的正确性，分别以中间锦鸡儿cDNA和基因组DNA为模板，利用PCR对 CiDHN1基因进行全长序列扩增(图 2)，测序结果显示CiDHN1基因cDNA为1140bp，gDNA全长1140bp。将序列提交到GeneBank 数据库，登录号为KT966715。

图 2 CiDHN1基因cDNA、gDNA全长片段的PCR扩增 Fig. 2 Amplification of the cDNA and gDNA fragment of CiDHN1 by PCR(a) cDNA amplification of CiDHN1 M: 1kb DNA Marker; 1,2: cDNA sequence of CiDHN1 (b) gDNA amplification of CiDHN1 M: 1kb DNA Marker; 1,2: gDNA full length sequence of CiDHN1

图选项

克隆到的CiDHN1基因cDNA全长1 140bp，包括5′UTR 132bp，3′UTR 102bp，PolyA尾巴12bp，开放阅读框891bp，起始密码子为ATG，终止密码子为TAG，编码297个氨基酸，含有5个Y片段和一个K片段(图 3)。通过ProtParam对推导的氨基酸序列预测表明，CiDHN1的理论等电点PI为6.09，分子量32.22kDa；不稳定系数－3.55，是稳定蛋白；总平均疏水指数为－1.346，推测为亲水蛋白。CiDHN1基因gDNA序列全长为1 140bp，无内含子。HNN预测显示，CiDHN1二级结构比例中α螺旋占5.39%，延伸链占3.37%，无规则卷曲占91.25%。将推导的氨基酸序列在NCBI中进行blast，结果显示，CiDHN1与山茱萸科主教红端木(Cornus sericea)的相似性最高，为39%(覆盖率为99%)。而与同属于豆科植物的鹰嘴豆(Cicer arietinum)、大豆(Glycine max)、苜蓿(Medicago sativa)比对的相似性分别为64%(覆盖率为19%)、34%(覆盖率为67%)和71%(覆盖率为10%)。

图 3 CiDHN1的cDNA序列和推导的氨基酸序列 Fig. 3 cDNA and deduced amino acids sequences of CiDHN1Red boxs indicate the conserved Y-segment of CiDHNs,black box indicate the K-segment of CiDHNs. The capital letters indicate ORF and corresponding amino acid sequences,lower case letter indicate non-coding region

图选项

选取NCBI比对结果中相似性较高的主教红端木(Cornus sericea),向日葵(Helianthus annuus),黄瓜(Cucumis sativus),中粒咖啡(Coffea canephora),拟南芥(Arabidopsis thaliana),鹰嘴豆(Cicer arietinum)、大豆(Glycine max)、苜蓿(Medicago sativa),豌豆(Pisum sativum)等10个物种的DHN蛋白，利用Mega6.06软件构建系统发育树(图 4)，邻接法(N-J)聚类结果显示，中间锦鸡儿CiDHN1与其他物种的DHN没有聚到一起，单独聚为一支，由此推测CiDHN1蛋白可能是中间锦鸡儿DHN家族新的功能未知蛋白。

图 4 CiDHN1的系统进化分析 Fig. 4 Phylogenetic analysis of CiDHN1 and other known DHNs

图选项

为了研究CiDHN1基因与逆境胁迫的关系，检测了逆境胁迫脱水、冷、热、NaCl和ABA处理下CiDHN1基因转录水平的表达情况。qRT-PCR结果表明(图 5)，脱水、冷和NaCl处理能促进CiDHN1基因的表达，随着脱水时间的增加，CiDHN1基因的表达量也增多，在脱水处理8h达到峰值，是对照的50倍；NaCl处理6h CiDHN1基因表达量达到最高，是对照的26倍；冷胁迫6h后，CiDHN1基因开始被诱导表达，并随着时间的增加，表达量增加，在24h表达量是对照的12倍。热和ABA处理后，CiDHN1基因被轻微诱导表达。

图 5 qRT-PCR检测各种胁迫下CiDHN1基因的表达 Fig. 5 The expression of CiDHN1 under different stresses examined by qRT-PCR (a)Drought treatment (b)NaCl treatment (c)Cold treatment

图选项

为了研究CiDHN1的亚细胞水平定位，我们构建了35S启动子驱动下CiDHN1与GFP报告基因融合表达载体。以中间锦鸡儿的cDNA为模板利用PCR技术扩增了CiDHN1基因的编码序列，并将目的基因连入克隆载体，测序验证正确后，通过T4连接酶将目的基因连接重组表达载体35S∷CiDHN1-GFP(图 6)。将重组表达载体导入到农杆菌后(图 7)，利用浸花法转化野生型拟南芥(Col-0)。

图 6 重组质粒35S∷CiDHN1-GFP酶切鉴定图 Fig. 6 Comfirmation of the recombinant plasmid 35S∷CiDHN1-GFP by restriction enzyme digestionM: DNA Marker; 1: Recombinant plasmid 35S∷CiDHN1-GFP; 2: 35S∷CiDHN1-GFP digested by restriction enzyme

图选项

图 7 35S∷CiDHN1GFP导入农杆菌菌落的PCR鉴定 Fig. 7 Comfirmation of the positive Agrobacterium tumefaciens clones containing the 35S∷CiDHN1-GFP by colony PCR M: DNA Marker; 1~10: Different clones

图选项

6天苗龄的T₂代转基因植物的根用于观察GFP信号，荧光显微镜观察结果显示(图 8)，35S∷GFP对照载体转基因植株的细胞质、细胞核及细胞膜上均有GFP荧光，同时在35S∷ CiDHN1-GFP转基因植株中细胞质、质膜和细胞核上均有GFP荧光，表明CiDHN1定位于细胞膜和细胞质。

图 8 CiDHN1的亚细胞定位 Fig. 8 Subcellular localization of CiDHN1

图选项

因为CiDHN1基因的表达受逆境胁迫的诱导，为了进一步研究CiDHN1基因在中间锦鸡儿耐受逆境胁迫中的功能，我们构建了35S启动子驱动下的CiDHN1重组表达载体35S∷CiDHN1(图 9)，并通过农杆菌介导的方法转化野生型拟南芥，经过转基因纯合体筛选，共获得了5个CiDHN1过量表达拟南芥转基因纯合体株系(CiDHN1-OE1，OE2，OE3，OE4和OE5)。对35S∷CiDHN1拟南芥转基因株系中CiDHN1的表达量进行检测，qRT-PCR结果显示(图 10)，CiDHN1在5个过表达株系中均有不同程度的表达，其中在CiDHN1-OE3中表达较高，CiDHN1-OE1中表达最低，说明该基因成功转入拟南芥。

图 9 重组质粒35S∷CiDHN1的酶切鉴定 Fig. 9 Confirmation of the recombinant plasmid 35S∷CiDHN1 by restriction enzyme digestionM: DNA Marker; 1: Recombinant plasmid 35S∷CiDHN1; 2: 35S∷CiDHN1 digested by restriction enzyme

图选项

图 10 过表达拟南芥转基因纯合体中CiDHN1基因的表达水平 Fig. 10 Transcripts level of CiDHN1 in transgenic Arabidopsis thaliana homozygous plants

图选项

进一步通过野生型拟南芥，OE1，OE2，OE3和OE4株系对非生物逆境胁迫的耐受能力检测发现，在200mmol/L NaCl处理下，CiDHN1过表达量最高的OE3株系表现出了对NaCl敏感的表型，与拟南芥野生型对照和其它过表达株系相比种子的萌发率降低(图 11)，并且其它3个株系与野生型相比没有明显的区别，这可能和CiDHN1基因表达量低有关。

图 11 CiDHN1-OE株系在200mmol/L NaCl 处理下的萌发率检测 Fig. 11 The germination of CiDHN1-OE lines after 200mmol/L NaCl treatmentA and B: Statistics and phenotype of CiDHN1-OE lines and wild type (Wt) under 200mmol/L NaCl treatment,respectively; C and D: Statistics and phenotype of CiDHN1-OE lines and wild type (Wt) under control condition,respectively

图选项

而在ABA和冷胁迫处理条件下，CiDHN1过表达拟南芥转基因株系与野生型拟南芥相比没有表现出明显的表型。

本研究从中间锦鸡儿干旱胁迫抑制消减杂交(SSH)文库中获得CiDHN1序列片段，在此基础上通过RACE克隆技术扩增得到5′端和3′端末端序列，并进一步克隆获得了CiDHN1基因全长序列。序列分析显示，CiDHN1包括开放阅读框891bp，5′UTR 132bp，3′UTR 102bp，PolyA尾巴12bp，起始密码子为ATG，终止密码子为TAG，编码297个氨基酸。CiDHN1属于Y₅K型脱水素，含有一个K片段，与完全保守的K片段相比，CiDHN1中K片段的第三位的K变为R，第11位的E变为D，第14位P变为S，是EKKGIMDKIKEKLPG的类似序列^{[2, 3, 4]}。NCBI序列比对结果显示，与CiDHN3相似性最高的是山茱萸科主教红端木(Cornus sericea)，相似性仅为39%(覆盖率为99%)。系统进化树分析显示CiDHN1单独聚为一支。由于CiDHN1与其它已经报道的DHNs同源性较低，由此可推测，CiDHN1可能是中间锦鸡儿CiDHNs家族一个新的功能未知基因。

荧光定量PCR结果表明，CiDHN1的表达还受干旱、冷和NaCl等胁迫处理诱导。为了进一步研究CiDHN1在植物抵抗逆境中功能，本研究对CiDHN1过表达拟南芥转基因植株进行了不同生物胁迫处理。在200mmol/L NaCl处理下，表达量最高的过表达株系CiDHN1-OE3的种子萌发率低于野生型，表明其对NaCl处理比较敏感。而根据已有的研究，多数的脱水素在抵抗盐胁迫中表现出耐受的表型，如在栽培番茄中过量表达多毛番茄ShDHN(SK3型)能提高幼苗在盐和渗透胁迫下的生长能力^[8]，在大肠杆菌中表达红树(Avicennia officinalis)脱水素基因AoDHN1提高了大肠杆菌在盐处理条件下的生长速度^[9]。 通过以上研究表明CiDHN1在中间锦鸡儿抵抗盐胁迫的过程中可能具有不同的功能。而在脱水、冷和ABA处理下，CiDHN1过表达拟南芥转基因纯合株系无论是在萌发阶段、植株幼苗和成年阶段都没有表现出明显的表型。与CiDHN1同源性相对较高的豌豆中，DHN1基因的mRNA和蛋白水平均受到干旱脱水和ABA的诱导，同时在胚胎发育后期大量积累^[18]。我们推测CiDHN1可能没有参与中间锦鸡儿应对脱水、冷和ABA处理的过程，可能参与了其它的重要生物学过程。CiDHN1是否在中间锦鸡儿抵抗其它非生物胁迫和生物胁迫中具有重要的功能，还有待于做进一步的研究证实。