猪圆环病毒2型(PCV2)是断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的重要病原体，它的存在和流行给世界养猪业造成了巨大损失^{[1, 2, 3]}。PCV2属于圆环病毒科圆环病毒属，为无囊膜单股环状DNA病毒，是目前发现的最小的动物病毒。PCV2基因组全长为1 767 bp或1 768 bp，含有11个开放阅读框(ORF)^{[4, 5]}，其中ORF1编码Rep和Rep′蛋白，ORF2编码衣壳(Cap)蛋白。Cap蛋白具有病毒的主要抗原表位，是PCV2基因工程疫苗的重要靶抗原^[6]。

大肠杆菌表达系统已经广泛应用于外源基因的表达^[7]，但该系统表达Cap基因效力不高，并且多以包涵体形式表达。Trundova等^[8]通过删除核定位序列(NLS)提高了该基因在大肠杆菌中的表达效率，有报道^{[9, 10]}指出采用添加融合谷胱甘肽-S-转移酶或麦芽糖结合蛋白基因序列也达到了类似效果。Bucarey等^[11]将ORF2基因密码子改造为酿酒酵母偏爱的密码子，获得的Cap蛋白不仅产量提高，而且还能够自我组装形成病毒样颗粒。

细胞穿膜肽(cell-penetrating peptides，CPPs)是一类能携带大分子物质进入细胞的短肽，其穿膜效果较好且不会产生细胞膜永久性损伤，毒性也较低。MPG是CPPs中的一种，1997年首次由Morris等^[12]人工设计并合成的细胞穿膜肽，含27个氨基酸。其序列是G-A-L-F-L-G-F-L-G-A-A-G-S-T-M-G-A-W-S-Q-P-K-K-K-R-K-V，其中1~17个氨基酸残基来自人免疫缺陷病毒(HIV) gp41蛋白的融合蛋白结构域，W-S-Q-P为连接结构，21~27个氨基酸残基来自于SV40 T抗原的NLS区域。其碱基序列为GGTGCTCTGTTCCTGGGCTTCCTGGGTGCAGCGGGTTCCACGATGGGTGCCTGGTCGCAGCCGAAAAAGAAACGCAAAGTT。可有效提高包括质粒DNA、寡核苷酸、短干扰RNA(siRNA)、多肽核苷酸(PNA)、蛋白和多肽在内的生物分子的细胞间转移^{[13, 14, 15]}。朱琳等^[16]将 MPG的NLS 区域中一个氨基酸进行突变，命名为MPG^△NLS，并设计了促黄体激素释放激素(LHRH )和 MPG^△NLS的融合多肽，有利于其携带的 siRNA定位于细胞质中大量释放。

本研究将ORF2基因密码子改造为大肠杆菌偏爱的密码子作为目的基因，或将MPG与ORF2基因5′端序列融合，利用大肠杆菌表达系统获得可溶性表达，并证明其具有较好免疫保护作用，为PCV2亚单位疫苗研制奠定了基础。

pET28a载体、大肠杆菌DH5α、大肠杆菌BL21(DE3)均由本实验室保存；PCV2 SH株由本实验室分离鉴定并保存；PCV2单克隆抗体3E5由本实验室制备；限制性内切酶、T4 DNA 连接酶购自诺唯赞生物公司；异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)购于大连宝生物工程有限公司；羊抗小鼠IgG-HRP购自武汉博士德生物工程公司；佐剂ISA206、ISA15A和GEL01由法国SEPPIC公司生产提供；其他常规试剂均为国产或进口分析纯。

根据PCV2 SH毒株(GenBank: AY686763.1)的序列，采用在线的生物分析软件Codon Adaptation Tool(http://www.jcat.de/)，将Cap基因密码子优化为大肠杆菌偏爱的密码子，同时编码氨基酸不变，优化后的基因由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，构建成重组质粒p-mCap。密码子优化前后的碱基序列如图 1所示。根据mCap基因序列，运用Primer Premier 5.0软件设计引物(表 1)。

图 1 ORF2密码子优化前后序列比对 Fig. 1 Alignment of optimized sequence and the original sequence

图选项

采用PCR方法扩增目的基因片段mCap和MPG-Cap△10。PCR反应体系25 μl，含p-mCap模板1 μl，上、下游引物各1 μl，PCR Mix Buffer 12.5 μl。扩增目的mCap时，以p-mCap为模板，PCR反应条件为：94℃ 5 min； 94℃ 30 s； 54℃ 30 s； 72℃ 45 s； 35个循环；72℃ 10 min。MPG-Cap△10融合蛋白基因构建方法是：分三次PCR方法将MPG基因融合至Cap基因N端，最终获得含有全长MPG的Cap序列。三次PCR采用的引物依次为F1和R，F2和R，F3和R，第一次PCR以PCV2 DNA为模板，之后每一次PCR扩增产物经切胶纯化后作为下一次PCR的模板。PCR反应条件为：94℃ 5 min； 94℃ 30 s； 57℃ 30 s； 72℃ 45 s； 35个循环；72℃ 10 min。

PCR产物于1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，克隆至表达载体pET28a的BamH I和Xho I位点，获得的重组质粒经酶切鉴定后送金斯瑞生物科技有限公司测序。将所构建成功的重组质粒分别命名为pET28a-mCap和pET28a-MrCap。

将鉴定正确的重组质粒pET28a-mCap、pET28a-MrCap分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)，待菌液OD₆₀₀达到0.8~1.0左右时，加入终浓度为1.0 mmol/L的IPTG，前者37℃继续振摇培养6 h，后者28℃振摇培养过夜(优化获得的表达条件)。离心收集菌体，PBS溶解后，超声裂解至菌液澄清，离心收集上清。采用饱和硫酸铵方法纯化。并进行SDS-PAGE和Western blot分析，其中一抗采用PCV2单克隆抗体3E5，二抗为HRP标记的山羊抗小鼠IgG。

分别将饱和硫酸铵方法纯化后的28a-mCap和MrCap重组蛋白分别作为抗原，按照一定的体积比例配制不同的疫苗：(1)ISA206佐剂：抗原=1∶1；(2)GEL01佐剂：抗原=3∶10；(3)ISA15A佐剂：抗原=3∶10。终浓度均为0.5 mg/ml，共6种待测候选疫苗，即28a-mCap+ISA206、28a-mCap+15A、28a-mCap+GEL、MrCap+ISA206、MrCap+15A和MrCap+GEL。

取70只6~8周龄雌性清洁级ICR小鼠(购自上海实验动物中心)，随机分为7组，每组10只。其中第1~6组分别免疫上述制备的6种疫苗，背部皮下多点注射0.2 ml/只，第7组为空白对照，注射等量PBS。首次免疫后21 d每组取5只小鼠尾尖采血，测定其ELISA抗体水平；并进行二次免疫，每只皮下注射各疫苗0.2 ml，二免后21 d小鼠眼球采血，测量ELISA抗体和中和抗体水平，并无菌取脾分离脾淋巴细胞进行淋巴细胞转化试验。同时将每组剩余的5只小鼠腹腔接种PCV2-SH株病毒液(10^5.0 TCID₅₀/ml)0.5 ml。攻毒后21 d，将每组的5只小鼠眼球采血，分离血清，同时无菌摘取小鼠脾脏，用荧光定量PCR方法测定 PCV2含量。

按参考文献^[17]的方法测定各组免疫鼠血清的抗体水平。检测孔与阴性对照孔OD₄₅₀值比率大于或等于2.1的最高稀释度的倒数为该血清的抗体效价。

将不同稀释度的已灭活血清与200 TCID₅₀/0.1ml PCV2等体积混合，37℃温箱作用1 h。接种含PK-15细胞单层的96孔板中，100 μl/孔，每个稀释度设置3个重复，同时设置阴性血清对照、病毒PCV2阳性对照和正常细胞空白对照。37℃ 5% CO₂温箱培养3 d后用间接免疫荧光法(IFA)测定血清中和效价，以能够减少50%荧光的血清最大稀释度作为待检血清的中和效价。

无菌取小鼠脾脏，分离淋巴细胞，将细胞浓度调整为5×10⁶ /ml，铺96孔细胞板，100 μl/孔，每只动物12孔，分别为以PCV2病毒作为刺激抗原的试验组，以ConA作为刺激抗原的阳性对照组(终浓度为10 μg/ml)，和不处理细胞组，每组设4个重复；37℃温箱培养66 h，每孔加入20 μl MTT(浓度为5 mg/ml)，37℃温箱继续培养6 h；弃掉96孔中的营养液，加入DMSO(100 μl/孔)，振荡融解紫色结晶，测定OD₅₇₀的值，计算刺激指数(SI=刺激孔的OD值/未刺激孔的OD值)。

取0.2 g脾脏，使用Viral DNA Kit(OMEGA公司)提取病毒DNA，具体操作按照说明书进行。实时PCR引物参照冯志新等^[18]的方法，序列如下，F:5′-CCAGGAGGGCGTTCTGACT-3′，R:5′-CGTTACCGCTGGAGAAGGAA-3′，TaqMan-probe: 5′FAM-AATGGCATCTTCAACACCCGCCTC -TARAM 3′。反应体系为25 μl：DNA 1 μl，10×TaqMan Universal PCR Master Mix 2.5 μl，引物 F/R 浓度均为400 nmol/L，探针浓度为100 nmol/L。置ABI7300荧光定量 PCR 仪上进行，反应条件为：50℃ 2 min；95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min；40 个循环。同时设定不加 DNA的阴性对照。首先以包含PCV2基因组的质粒pT-SH作为模板，10倍比稀释后用于PCR，制作标准曲线。然后以提取的样品DNA进行PCR，得到对应的Ct值后，根据标准曲线方程计算出样品中的PCV2核酸拷贝数。

应用 GraphPad PRISM(V5.02，www.graphpad.com)软件，对数据统计分析，比较各组差异，P＜0.05 表示差异显著。(*表示P＜0.05)

构建重组质粒pET28a-mCap和pET28a-MrCap，目的基因测序结果正确。将构建的重组质粒转入BL21(DE3)中，通过IPTG诱导表达后，经SDS-PAGE分析，表达的重组蛋白以包涵体和上清两种形式存在，并且在上清中含量较高。采用硫酸铵方法对重组菌的裂解物上清进行纯化，结果显示两种重组蛋白纯度均有一定提高。Western blot结果显示，两种重组蛋白均可以和PCV2单克隆抗体反应，有清晰的特异性条带出现，表现出良好的抗原反应性(图 2)。

图 2 表达的重组蛋白SDS-PAGE及Western blot分析 Fig. 2 Analyses of the recombinant protein by SDS-PAGE and Western blot M:Protein Marker；1:BL21/pET28a-mCap without induction；2~3:Lysate of BL21/pET28a-mCap induced,inclusion body and supernatant,respectively；4:Purified BL21-pET28a-mCap；5:BL21/ pET28a-MrCap without induction；6~7:Lysate of BL21/ pET28a-MrCap induced,inclusion body and supernatant,respectively；8:Purified MrCap；9:Lysate of BL21/pET28a induced

图选项

取首次免疫后21 d和42 d小鼠血清进行PCV2间接ELISA抗体检测，结果见图 3，首次免疫后21 d，各免疫组均可产生不同程度的ELISA抗体，且以MrCap+GEL组抗体效价最高，显著高于28a-mCap+15A组和MrCap+15A组(P＜0.05)，抗体效价为1∶1 200。加强免疫后各免疫组抗体水平持续升高，其中以含GEL的免疫组抗体效价最高，15A组较低。阴性对照组未检测到 PCV2 特异性抗体。

图 3 免疫后小鼠ELISA抗体效价 Fig. 3 The ELISA antibody titers in vaccinated mice * P＜0.05

图选项

加强免疫后21 d的血清中和抗体效价如图 4所示，与对照组相比，各免疫组均可产生特异性中和抗体，其中GEL组抗体效价较高，在1∶20~1∶30之间，但与其他组差异不显著(P>0.05)。

图 4 二次免疫后小鼠中和抗体效价 Fig. 4 The anti-PCV2 neutralization antibody titers in vaccinated mice

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淋巴细胞转化试验的结果见图 5，与阴性对照组相比，各试验组小鼠均可以检测到较为明显的淋巴细胞增殖反应，其中MrCap+15A组较高，各组之间差异不显著(P>0.05)。

图 5 小鼠免疫后淋巴细胞增殖反应 Fig. 5 Lymphocyte proliferative responses in vaccinated mice

图选项

攻毒后21 d检测小鼠脾脏中的 PCV2核酸含量，结果见图 6，除两种重组蛋白与15A混合疫苗组外，其他各免疫组PCV2 含量都显著低于非免疫对照组(P＜0.05)，表明两种重组蛋白与佐剂GEL和206制成的疫苗可诱导产生良好的免疫保护效力。

图 6 定量 PCR 检测脾脏PCV2含量 Fig. 6 Detection of virus titers in mice spleen by Quantitative Real-time PCR * P＜0.05

图选项

疫苗免疫是PMWS的主要防控措施。近年来，国内外研究的PCV2疫苗包括弱毒疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗、活载体疫苗和DNA疫苗等，其中，亚单位疫苗具有不含病毒核酸，能够避免病原扩散和有利于制备基因工程重组疫苗等优点。目前，基于杆状病毒表达Cap蛋白的亚单位疫苗注册上市^[19]，因为该蛋白可实现蛋白的体外表达及正确折叠，并能自我组装形成VLP，具有较好的免疫效果，但杆状病毒表达系统成本比较昂贵。

大肠杆菌表达系统具有操作简单，表达周期较短，成本低廉等优点，但Cap蛋白 N端含有较多的碱性氨基酸和大肠杆菌稀有密码子，很大程度上限制了其在大肠杆菌中的表达。每种生物对同义密码子的选择都有自己的偏好性。ORF2 NLS中所含丰富的精氨酸，在转运过程中需要大量编码此氨基酸的tRNA，从而限制了Cap蛋白的合成速度，甚至导致蛋白合成的早期终止。研究者们通过对ORF2基因序列进行密码子优化^[11]，截短NLS^[8]，插入融合标签^{[9, 10]}等方法，可以实现Cap蛋白的高效、可溶性表达。本研究采用将ORF2基因密码子改造为大肠杆菌偏爱的密码子、或将MPG与Cap蛋白序列融合，构建大肠杆菌重组表达质粒，均成功诱导表达出可溶性且抗原性良好的Cap蛋白，且前者表达量略高于后者，说明密码子的偏好性是影响大肠杆菌表达Cap蛋白的重要因素。

免疫佐剂是影响亚单位疫苗免疫效果的重要因素之一。本研究将纯化后的两种重组蛋白分别与3种商品化佐剂混合，配制6种疫苗，进行小鼠免疫试验，结果显示，各免疫组均能产生特异性的ELISA抗体和中和抗体，其中以GEL01为佐剂的两免疫组抗体水平最高，说明该佐剂比其他两种佐剂能更好地诱发机体的体液免疫应答，但同种佐剂不同抗原之间并无明显差异。攻毒后21 d检测脾脏中的PCV2含量，结果显示，除ISA15A组外，其他各免疫组脾脏中 PCV2含量都显著低于非免疫对照组，表明两种重组蛋白与佐剂GEL01和ISA206制成的疫苗可诱导产生一定程度的免疫保护效力。上述三种佐剂均为商品化佐剂，对不同蛋白免疫佐剂效果存在差异，本研究目的主要是为了获得免疫原性高的可溶性重组Cap蛋白，小鼠实验时没有设定重组蛋白对照组，但并不影响本研究的结果和意义。

综上所述，我们分别采用将Cap基因密码子优化方法和MPG-Cap基因融合的方法，成功构建了大肠杆菌表达质粒，获得了可溶性且抗原性良好的Cap蛋白，为PCV2亚单位疫苗研制奠定了重要基础。