天蚕素(cecropin)是瑞典科学家Boman等^[1]首先从天蚕蛹中提取分离得到的一类抗菌肽，具有抗细菌、抗真菌、抗病毒、抑制肿瘤细胞以及免疫调节等生物活性。目前，已被发现的天蚕素类抗菌肽有cecropin A、B、C、D、E、P以及一些类似物，如提取自燕尾蝶(Papilio xuthus)体内的papiliocin^[2]。与传统抗生素相比，天蚕素类抗菌肽具有不同的作用机制，因此不易产生耐药性，是极具潜力的抗生素代替品。然而，天蚕素类抗菌肽作为药物使用还面临很多问题。一方面，天蚕素提取分离工艺复杂，不适合大规模生产；另一方面，天蚕素的抗菌活性、选择性、毒性、稳定性以及成药性等还有待进一步改善，本文针对这些问题对天蚕素类抗菌肽分子设计研究进展做了综述。

天蚕素类抗菌肽在水溶液中以非结构化的形式存在，而在非极性环境中或有脂膜存在时其分子会有显著的构象变化，形成螺旋-铰链-螺旋的特殊结构，它与脂膜的相互作用是影响其生物活性的关键因素^[3]。大量研究发现，抗菌肽的生物活性受诸如净正电荷数^[4]、疏水性^[5]、α螺旋结构稳定性、螺旋度以及铰链结构等多种物理、化学以及空间结构等因素的影响。因此，策略性地改变这些因素将有助于找到提高抗菌活性以及降低毒性的方法。目前用于改善抗菌肽生物活性的设计方法有：氨基酸残基的替换、重复片段设计、杂合肽设计、非天然氨基酸的引入以及氨基酸残基的修饰等。

天蚕素类抗菌肽为阳离子型抗菌肽，其双亲α螺旋上的正电荷与细菌质膜上阴离子的静电吸引作用对多肽分子与细胞膜的结合起重要作用，因此，提高抗菌肽的正电荷可能会提高抗菌活性。Park等^[6]通过Lys替换和Leu替换提高净正电荷和疏水性，设计了5个CA(1-8)-MA(1-12)类似物，其中以Lys代替4、8、14、15号位置氨基酸残基和以Leu代替5、6、12、13、16、17、20号位置氨基酸残基的CA-MA类似物，其抗菌活性和抑制肿瘤活性均得到了增强，并且无溶血性。Sato等^[7]用氨基酸残基替换的方法设计了杂合肽CA(1-7)-ME(2-9)的多个类似物，结果表明，富含Lys并优化了双亲螺旋结构的类似物不仅保留了原杂合肽的抗菌活性，其溶血性大幅度降低，因此，提高了杂合肽的选择性。Chen等^[5]用氨基酸残基替换的方法引入Leu以提高疏水性或用疏水性较弱的Ala代替Leu来降低疏水性，发现在适当的范围内增强疏水性可提高抗菌能力，但超过或者低于该范围都会使抗菌活性显著降低。用圆二色光谱(CD)和反相HPLC分别检测螺旋度和自聚能力，结果显示，两亲性α螺旋非极性面的疏水性与多肽的螺旋性以及自聚能力有关，过高的疏水性使自聚能力过强，妨碍了抗菌肽穿透细菌质膜。

氨基酸残基的替换是针对某个或几个氨基酸残基的改造，而重复片段设计则是以两个或多个相同片段，依照天蚕素类抗菌肽螺旋-铰链-螺旋的特征结构进行拼接。如设计天蚕素B的几个类似物CB1、CB2和CB3，CB1和CB2有两个双亲α螺旋(CB2在CB1的Pro²⁴和Ala²⁵之间插入Gly-Pro)，CB3有两个疏水螺旋。虽然CB1和CB2的抗菌活性比天蚕素B低2~4倍，但CB1和CB2杀伤白血病癌细胞的活性比天蚕素A高2~3倍^[8]，而拥有两个疏水螺旋的CB3抗菌和抗肿瘤的活性作用都微弱^[9]，说明双亲的α螺旋结构对抗菌和抗肿瘤活性都是必要的，疏水螺旋的缺失导致抗菌活性急剧降低，而对抗肿瘤的活性影响微小，提示天蚕素抗菌肽的抗菌活性和抗肿瘤活性具有不同的作用机制。因此，对不同活性的改善应有不同的策略。Wu等^[10]将CB中三个相同片段根据螺旋-铰链-螺旋的特征结构进行拼接，获得了一种新抗菌肽CB1a(NH2-KWKVFKKIEK-KWKVFKKIEK-AGP-KWKVFKKIEK-COOH)，其抗白血病癌细胞活性得到进一步提升，具体比较为CB1a > CB1 > CB > CB3。癌细胞富含去唾液糖蛋白、磷脂酰丝氨酸、类肝素硫酸蛋白聚糖等，其细胞表面比正常细胞带有更多的负电荷，这可能是阳离子型抗菌肽对癌细胞有选择性的原因^[11]，而CB1a 和 CB1的正电荷都比CB高，提示正电荷在抗菌肽发挥抗癌作用方面具有重大作用。

与重复片段设计相比，杂合肽是将来源不同的功能片段进行拼接，以获得抗菌活性更强的新型抗菌肽。目前研究较多的设计有cecropin A与蜂毒肽(melittin，ME)的杂合以及cecropin A与蛙皮素(magainins，MA)的杂合。如Boman^[12]设计将CA的1~13号片段与ME的1~13号片段拼接，得到CA(1-13)-ME(1-13)，其抗金黄色葡萄球菌的活性比cecropin A高100倍，抗疟疾活性比cecropin B和Magainins高10倍，并且无亲代melittin的溶血性。

近年来，随着生物信息学技术的快速发展，计算机辅助设计越来越受到研究者的青睐。利用计算机可以模拟抗菌肽的空间结构，预测抗菌肽的物理、化学性质，这使得抗菌肽的设计更具有合理性，使多来源的抗菌肽片段拼接成为可能。Tian等^[13]基于双亲性阳离子多肽的构效关系，以多肽LFB15(W4,10)、HP(2-20)和cecropin A为亲代，设计了4个杂合肽，用生物信息学工具评估了它们的结构参数，根据参数筛选合成其中两个更具潜力的杂合肽LH28和LH34，结果LH28抗菌活性得到了提升(MIC50=1.56~3.13μM)，并且在有效抗菌浓度下(3.13μM)对兔红细胞无明显的溶血作用。Fox等^[14]基于α螺旋结构选择cecropin A、 LL-37 以及magainin2作为杂合肽的亲代，用计算机分析各个片段并模拟组合拼接，选出形成双亲性螺旋最好的几个杂合肽CaLL、 CaMA、LLaMA 和 MALL进行合成。对一系列细菌(炭疽杆菌Bacillus anthracis，洋葱伯克霍尔德菌Burkholderia cepacia，土拉弗朗西斯菌Francisella tularensis，假结核耶尔森菌Yersinia pseudotuberculosis)进行抗菌试验，结果这些杂合肽的抗菌活性比亲代抗菌肽都要强(其中一个亲代抗菌肽完全无效，而杂合肽用3h清除了所有细菌)。

脱氢苯丙氨酸(△Phe)可以稳定螺旋结构，Mathur^[15]分别在杂合肽CA(1-7)-ME(2-9)目的位置引入一、二和三个△Phe，合成了CA-ME△Phe1、CA-ME△Phe2和CA-ME△Phe3三个类似物。用CD和NMR测定结构显示，只引入一个△Phe不足以稳定螺旋结构，CA-ME△Phe1为伸展构象，溶血性最低；引入两个△Phe的CA-ME△Phe2具有稳定的C端螺旋结构，表现出强的抗菌活性和溶血性；但引入三个△Phe时，CA-ME△Phe3只有转角而没有螺旋，抗菌活性弱。因此，稳定的α螺旋结构对抗菌肽的抗菌活性和溶血性都很重要。

PEG修饰(聚乙二醇化)可以保持抗菌活性的同时降低毒性，提高生物相容性。N端聚乙二醇化的杂合抗菌肽CaLL对肺部病原菌的半抑制浓度(IC50)比CaLL高2~3倍，圆二色谱和荧光光谱测定表明PEG修饰不会阻碍抗菌肽与细胞膜结合时必要的构象变化^[16]。因此，PEG修饰可作为提高抗肺部感染抗菌肽生物相容性的一个方法。此外，N^ε-Lys的三甲基化也可改变抗菌活性和毒性，并且与修饰的Lys残基数目和位置有关^[17]。

天蚕素类抗菌肽由31~39个氨基酸残基组成，为便于合成，在抗菌活性不损失的前提下，缩减氨基酸残基的数目将有助于降低合成成本，同时在一定程度上降低其免疫原性。分子量可进行优化的实验依据有：(1)某些氨基酸残基的剔除不影响抗菌活性；(2)脯氨酸(Pro)形成的转折可作为天蚕素类抗菌肽具有一定灵活性的铰链结构，用以代替如Gly-Ile-Gly和Gly-Gln-Gly-Ile-Gly等具有铰链结构功能的片段^[18]；(3)被精简的抗菌肽尽管结构改变较大，但可能存在新的作用方式使其同样具有抗菌活性^[19]。

典型的例子是：1992年Andreu等^[20]对具有优于cecropin A活性的杂合肽CA(1-13)-CE(1-13)进行肽链长度的优化，设计了仅有15个氨基酸残基的杂合肽CA(1-7)-CE(2-9)，其抗菌活性和抗菌谱与cecropin A相当，分子大小优化了60%。2013年，Maccari等^[21]借助计算机工具，通过设定程序限制多肽分子大小，利用相似性评分工具选择相似性高的氨基酸进行替换，以避免新肽与原肽分子差异过大，运用定量构效关系(Quantitative structure-activity relationship，QSAR)分子描述子(molecular descriptors)编码组成多肽的相关氨基酸分子以预测多肽活性，对CM18(KWKLFKKIGAVLKVLTTG)进行了多目标的优化，筛选出一个肽链更简短并且活性保留的CM12 (WKLFLKAVKKLL)。

抗菌肽作为药物使用还需要解决多肽在动物体内不稳定的问题，如胃肠道pH的影响以及多种蛋白酶的降解。然而，蛋白酶具有专一性，这意味着不同蛋白酶只对某些肽键或带有某种基团的氨基酸所形成的肽键起作用，因此，对某些氨基酸进行替换可能避免蛋白酶的水解作用。Ji等^[22]用Trp对杂合肽cecropin A-melittin进行了4个氨基酸残基的替换，抗菌试验和稳定性试验表明，改造后的杂合肽不仅抗菌活性得到提高，对不同温度、pH以及胃肠道内多种蛋白酶具有较好的稳定性，这样就大大提高了抗菌肽的制药指数。Zhang等^[23]构建了ABP-dHC-cecropin A与β-环糊精的复合体，研究表明，该抗菌肽复合体的物理和化学性质得到改善，并且抗菌活性无明显变化。

抗菌肽在工程菌中表达时，因其对原核细胞具有高毒性，表达量往往较低。为提高抗菌肽的表达，通常先设计表达抗菌肽的前体以降低对工程菌的毒性，然后切割回收目的蛋白。如王晓波^[24]设计在杂合肽CA(1-8)-ME(1-10)基因的N端融合一段编码酸性短肽的片段作为抗菌肽的前体，同时通过含有酶切位点的接头将该杂合肽基因以同向串连的方式连接成多拷贝基因，表达并纯化后的蛋白用溴化氢切割可获得有活性的目标抗菌肽CA-ME。Zhang等^[25]构建了SUMO-ABP-dHC-cecropin A融合蛋白作为前体，待蛋白表达收集后用SUMO蛋白酶水解回收产物ABP-dHC-cecropin A，回收率高达94%。王炜等^[26]在大肠杆菌体内表达家蝇抗菌肽时，构建了融合蛋白Trx-UBI-MC(硫氧还蛋白-泛素-家蝇天蚕素)，目的是将天蚕素包裹入Trx分子内部，通过隐蔽结构来消除其细胞毒性，再利用UBI 分子增强融合蛋白在宿主菌中的稳定性，结果使蛋白的表达量得到了明显的提高。

融合蛋白的设计不仅可以用于构建抗菌肽表达的中间产物，更为设计多功能的抗菌肽提供了一个重要的途径。王会岩等^[27]构建了天蚕素与血管内皮生长因子VEGF₁₂₁的融合蛋白，旨在设计具有肿瘤血管靶向性的药物；万一等^[28]设计cecropin B与表皮生长因子融合，期望获得抗菌和促伤口愈合双功能特性的抗菌药物；卢雪梅等^[29]设计了肝靶向穿膜肽和家蝇天蚕素的融合蛋白(HTPP-MDC)，实验结果表明，HTPP-MDC在体外对HBV的复制有较强的抑制作用，并能快速透过细胞膜进入细胞内，有望用于临床治疗慢性乙型肝炎相关疾病。

自Boman等^[1]从天蚕蛹中分离提取得到天蚕素至现在，科研工作者在天蚕素类抗菌肽生物活性的提高、毒性的改善、分子量的精简以及表达量和稳定性提高等做了大量的研究，旨在将天蚕素类抗菌肽开发成新型抗菌药物。综合多种分子设计的方法已经可以获得肽链简短、活性高、毒性低的抗菌肽，在表达量低方面目前也有许多相应的对策，但作为药物使用还需要投入更大的努力，抗菌肽在动物体内的生物活性、毒性以及药代动力学性质都有待进一步研究。

由于抗菌肽抗菌谱广，使用过程中会杀死有益的菌群，破坏肠道菌群平衡，可能会导致更严重的感染，因此抗菌肽的选择性有待进一步改善。而靶向性的设计为提高抗菌肽的效率和减少抗菌肽的使用量提供了一个新的研究思路。相信在不久的将来，抗菌肽能够作为不易产生耐药性、抗菌活性高、毒性小的新型抗菌药物，以缓解传统抗生素耐药性的危机。