单克隆抗体已广泛用于临床治疗、诊断及基础研究，但其存在着诸多劣势，如超大的分子量，低组织渗透性，稳定性差，生产成本高，使用剂量大及潜在的免疫原性等。为了克服这些问题，人们仅使用免疫球蛋白分子中的一部分(Fab或scFv等)^[1]作为药物，或选择某些蛋白质作为框架，这些框架蛋白质被称为母核蛋白，这些蛋白一般为功能蛋白，如调节蛋白(与白蛋白，免疫球蛋白Fc段，DNA或糖相结合)，蛋白酶抑制剂(phytocystatin，stefinA)，或酶(tRNA合成酶，酪氨酸激酶)。这些母核蛋白中有12个为人源蛋白，其他的来自古菌或细菌，昆虫，植物，动物或人工蛋白。人工蛋白是通过计算机从头设计或通过多蛋白序列计算建立的，具有相似性，低分子量，多数具有40和100个氨基酸残基，其中有10~20个可随机突变的氨基酸残基。通过随机突变蛋白质结合面上的氨基酸，建立可供筛选的蛋白质库^[2]。再通过体外噬菌体，细胞，核糖体或酵母等展示技术^[3]，筛选了对特定靶标蛋白具有高亲和力的蛋白质。因为这类蛋白的结合区域并不是基于免疫球蛋白质分子设计的，因此被称为非免疫球蛋白配体药物(Non-immunoglobulin scaffolds)。它们不但具有对靶标分子的高亲和力和高特异性的特点，同时还具有其他优势，如体积小，组织渗透性强；可作为显像剂使用，使得药物的半衰期延长并易于血液清除；折叠迅速，高化学，水解和热的稳定性^[4]；低免疫源性；缺少半胱氨酸；可以通过廉价化学合成或基因重组手段进行生产；工程化可以实现双特异或多特异性的非免蛋白配体的药物设计。现在，非免蛋白配体药物应用于癌症，风湿性关节炎，炎症性肠病等的治疗，应用与检测领域中，可以代替单克隆抗体作为亲和试剂使用。

据统计，在研的102个非免蛋白配体药物，靶向于139种不同蛋白，可以归类于20种类型。按其来源，靶点分为有机分子、病毒、细菌、动物和人类蛋白质。迄今为止，蛋白是非免蛋白配体药物靶向的最常见的一类生物分子；其他靶点还有碳水化合物和核酸等。病毒靶点主要包括外壳或外壳蛋白，而细菌靶点包括转运蛋白及耐药相关蛋白^[5]。人的靶点主要包括，细胞因子，受体，酶，蛋白质，激素，生长因子，信号传导蛋白，调节蛋白，免疫球蛋白等。大部分的非免蛋白配体药物的亲和力在1~100 nm范围内，通过筛选亲和力可以达到pm级。

其应用领域包括了治疗，诊断以及基础研究。如，拮抗细胞因子(如IL-17，IL-6，TNF-α)的非免蛋白配体药物，主要用于炎症性疾病的治疗；拮抗细胞受体(如HER2，HER3，VEGFR)的非免蛋白配体药物，主要用于癌症的治疗。这其中最常见的靶点是肿瘤坏死因子(TNFα)，共有8个不同的非免蛋白配体药物是针对这一靶点。这一点和生物医药市场的情景是吻合的，最畅销生物制药产品前三名都是抗肿瘤坏死因子的生物药物。在研的三个不同的非免蛋白配体药物靶向于常见的靶点有表面受体EGFR，HER2和ED-B。

非免蛋白配体药物一般来源于具有一定的内源亲和力的蛋白质，由单一结构域或重复多肽结构域组成。它们较抗体分子量小(由100个左右的氨基酸残基组成，分子量约为11 kDa)，并且更稳定。这与利用细胞进行表达的抗体相比，他们可以利用细菌进行表达。非免蛋白配体药物也可以通过固相肽合成产生，并通过游离半胱氨酸或氨基同配基进行定点结合。非免蛋白配体药物的分子量小，具备更好的组织渗透性，也可以从生物体内更快消除。诊断分子成像技术需要快速分布和消除成像分子，例如，单光子发射计算机断层扫描或正电子发射断层扫描，对于治疗的应用，具有快速分布和消除的药物可以减少药物在组织中的高积累。半衰期的延长可以通过将药物同聚乙二醇，Fc，白蛋白等结合而实现。

使用单克隆抗体难以实现多价和多特异性，但非免蛋白配体药物却可以做到。如，双特异性的Adnectins，anticalins 和 DARPins。除了组装多个非免蛋白配体药物，非免蛋白配体药物还可以和融合抗体，如fynomer和抗HER-2抗体融合的FynomAb非免蛋白配体药物。通过突变非免蛋白配体药物的随机区域，可以实现其多特异性的目的，同时不增大分子量。ABD非白蛋白结合区域的多元化，赋予了ABD同HER-3及白蛋白结合的多特异性。非免蛋白配体药物可以与效应分子结合以增强分子活性。结合了铜绿假单胞菌外毒素的EpCAM(上皮细胞粘附分子)特异DARPin可以引起肿瘤溶解。非免蛋白配体药物还可以直接参与药物递呈体系，如纳米粒子或脂质体^[6]。HER-2-特异的Affibody具有生物纳米胶囊表面(中空纳米颗粒)，热敏脂质体(Affisomes)可以靶向HER2表达的癌细胞。

所有的治疗用蛋白，包括非免蛋白配体药物和抗体都具有潜在的免疫原性，从而可能引发过敏反应或中和反应。对于慢性病的治疗，这个问题尤显突出。使用人源的非免蛋白配体药物，可以减少免疫原性的风险；但仍需临床试验的验证。

最近开发的非免蛋白配体药物多用于医学治疗和诊断。他们直接针对疾病相关的蛋白分子，主要是一些信号通路分子，表面受体或可溶性受体等。

用于癌症治疗的非免蛋白配体药物主要干扰信号通路和靶向癌细胞表面过表达的靶点，如酪氨酸激酶(TK)。酪氨酸激酶激活转录因子或其他蛋白，继而进入细胞核，并改变细胞的转录模式。例如，表皮生长因子受体ErbB家族 [受体HER1(ErbB1 或 EGFR)，HER2(ErbB2/neu)，HER3(ErbB3)和HER4(ErbB4)]，VEGFR，血小板衍生生长因子受体(PDGFR)，肝细胞生长因子(HGF)受体(HGFR，也称MET)，和胰岛素样生长因子I型受体(IGF-IR)。酪氨酸激酶的过度激活导致细胞的不受控的生长，血管生成和转移。受体TK信号也可以被非免蛋白配体药物直接拮抗受体或配体抑制，这建立了一种以单克隆抗体为基础的癌症疗法新策略。一些抑制受体TK信号的非免蛋白配体药物已经进入临床试验。VEGFR-2的配体 VEGF-A，是PEG化的Anticalin，Angiocal的靶点，在单次给药3周后仍可以检测到药物活性，I期临床试验结果显示，其不具有免疫原性；PEG化的DARPin,Abiciparpegol(MP0112),在进行一种与年龄相关的黄斑变性(AMD)治疗的II期临床试验。双特异性DARPin(MP0250)同时抑制VEGF 和 HGF，处于实体瘤的I期临床试验^[7]。拮抗VEGFR-2的Adnectin CT-322在治疗复发性胶质母细胞瘤的临床试验中获得成功。

诱导细胞凋亡是消除癌细胞的另一种策略。通过其他通路，它可以被同源三聚体蛋白TRAIL(肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体)所诱导，一个TNF家族成员结合体死亡受体DR4或DR5 TRAIL-R1和TRAIL-R2 ，激活半胱天冬酶。开发了针对这两个TRAIL受体的非免蛋白配体药物。癌细胞表面的特定分子也可以作为靶点，用于细胞毒性化合物的递呈或体内成像。ED-B是癌胚纤维连接蛋白一种亚型的结构区域，在几乎所有的成年组织中是不存的，除非血管新生过程被重新激活；非免蛋白配体药物Anticalin，就是特异地靶向ED-B。

慢性炎症在很多疾病中发挥着关键作用，如，炎症性肠病(IBD)，类风湿关节炎，银屑病，阿尔茨海默氏病以及一些肺部疾病。

鸡传染性法氏囊病，牛皮癣，类风湿关节炎和多发性硬化，和IL-23与T辅助细胞(Th)-17的IL-23受体介导的信号增强有关。IL-23是由p40(于IL-12共有结构)和p19(IL-23特有结构)组成的异源二聚体。P19特异的Adnectin和Alphabody，可以增加对IL-23的特异性并降低IL-12相关的副作用。拮抗IL-23通路的补充方法是结合IL-23受体，这是通过与白蛋白结合域(ABD)结合实现的。IL-23信号的转导，进一步导致包括IL-17A在内的炎症因子的分泌。非免蛋白配体药物fynomer 2C1可以抑制人IL-17A，其IC50为2. 2 nM，并同人抗TNF抗体融合得到的双特异性FynomAb COVA322可用于银屑病的治疗。IL-6调节宿主防御的免疫反应，如果上调，其可以还参与了炎症和肿瘤的发生过程。Avimer C326抑制IL-6，其IC50为0. 8 pM ，正在进行治疗克罗恩氏病(Crohn’s disease)的临床I期试验。实验证实，Repebody可以抑制IL-6，并对小鼠的非小细胞肺癌具有很强的抑制作用。Affibody可以抑制展示在乳酸乳球菌的表面细胞炎症因子TNF-α，并能结合清除体外模拟胃液条件下的TNF-α，这可能对炎症性肠病有利。

细胞因子受体也可以作为靶点。IL-4的受体IL-4Rα在过敏和哮喘病中起着关键作用。Anticalin PRS-060可以特异性地结合IL-4Rα，亲和力低于皮摩尔，是通过噬菌体展示技术筛选得到的。研究显示，肺部给药后，Anticalin比单克隆抗体的吸收高10倍，因此其具有更高的疗效和安全性。

炎症不但可以由细胞因子激发，还可以由许多其他蛋白失调而激发。哮喘和其他肺部疾病与慢性中性粒细胞炎症有关，这可以导致颗粒蛋白的释放，如人中性白细胞弹性硬蛋白酶(human neutrophil elastase ，HNE)。其生理抑制剂的遗传性降低导致肺组织广泛破坏。DX-890是HNE的抑制剂，亲和力为皮摩尔级，它是由含有蛋白酶抑制剂BPTI(bovine pancreatic trypsin inhibitor，牛胰蛋白酶抑制剂)的Kunitz库中筛选到的。DX-890可以降低中性粒细胞跨上皮细胞迁移和囊性纤维化的气道上皮细胞的炎症，处于II期临床试验阶段。在阿尔茨海默病中，炎症是由淀粉样蛋白Aβ前体蛋白，淀粉样纤维化蛋白(APP)合并所致脑沉积引起的。体外实验证实，拮抗Aβ的Affibody具有纳摩尔亲和力，可以防止Aβ的聚集。

遗传性血管性水肿是一种遗传性血液疾病，可以引起人体和内部脏器的肿胀。这是由于补体抑制剂的缺乏引起的，例如，C1酯酶抑制剂。APP结构域的Kunitz抑制剂，称为APPI(结构类似于之前提到的BPTI)，用噬菌体展示技术筛选的激肽释放酶抑制剂DX88其亲和力为15 pM。DX88(ecallantide)仍然是唯一批准用于临床的非免蛋白配体药物。

慢性贫血(Anemia of chronic disease，ACD)主要表现为红细胞或血红蛋白不足和慢性贫血引发的慢性炎症。IL-6大量刺激铁调素hepcidin的增加，Anticalin PRS-080是铁调素hepcidin的拮抗剂，可以用于ACD的治疗。

转化酶枯草杆菌蛋白酶前体kexin-9(PCSK9)控制着肝脏低密度脂蛋白(LDL)和胆固醇的代谢，因此是治疗心血管疾病，降低低密度脂蛋白的重要靶点。Adnectin特异地结合PCSK9，具有亚纳摩尔的亲和力，是高胆固醇血症患者降低低密度脂蛋白的潜在治疗药物。

研究疾病相关的生物分子不但对疾病的治疗具有重要意义，对于临床诊断也同样重要。一些非免蛋白配体药物被同时用于疾病的治疗和诊断，这些在前面的叙述中曾提及。适当的体内诊断方法可以对疾病标志物进行定性、定量和定位，这其中包括造影剂成像和抗原定位。在体外诊断方法中，需要尽可能地减少背景化合物的干扰，并且需要同其他的检测方法配合使用。这包括酶联免疫吸附试验(ELISA)，生物传感器，芯片以及抗体检测的常规方法等。

利用非免蛋白配体药物的活体成像SPECT T(single-photon emission computed tomography，单光子发射计算机断层扫描)或PET(positron emission tomography，正电子发射断层扫描)技术，多用于检测肿瘤的定位及转移。低分子量的非免蛋白配体药物，提供了更好的组织渗透并可以更快速地从血液中清除。通过螯合剂，如三叔丁基1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)，将放射性核酸同非免蛋白配体药物连接。如非免蛋白配体药物同短半衰期的正电子核素标记的氟-18(18F)和镓-68(68Ga)，以及短半衰期的γ电子核素标记的锝-99(99mTc)和铟-111(111In)结合。Affibody分子是非免蛋白配体药物成像技术中最常用的一类。111In-ABY-002,68Ga-ABY-002,和68Ga-ABY-025 Affibody药物分子被用于乳腺癌患者的HER2分子的诊断。

靶向于EGFR的125I-标记Affibody，用于各种恶性肿瘤的显像，这种结合并不受到辐射碘的影响。还有其他的一些非免蛋白配体药物也被用于临床检测。89Zr标记的Anticalin被用于检测MET表达在肿瘤细胞膜上的MET TK。非免蛋白配体药物也可以连接荧光染料，顺磁性铁粒子或超声造影剂作为放射性核素的替代品，用于荧光扫描，磁共振(MRI)和超声成像检测。EGFR和HER2特异并标记两个不同的荧光团的Affibodies，可以同时监测一个动物中的不同肿瘤。

近红外荧光染料标记的非免蛋白配体药物，如，拮抗HER2的Affibody，用于外科的光学成像。使用顺磁性铁粒子连接的非免蛋白配体药物，可以用于CT和MRI检查。特异结合HER2，超顺磁性氧化铁(SPIO)颗粒标记的Affibody非免蛋白配体药物，可用于小鼠的肿瘤显像。特异结合HER2，脂质纳米泡(超声应用超声造影剂)标记的Affibody非免蛋白配体药物，可用于HER2过量表达的乳腺癌细胞的诊断。

非免蛋白配体药物可以代替抗体，用于体液中疾病生物标志物的分析。以抗体为基础，使用最广泛的检测是酶联免疫吸附检测(ELISA)，非免蛋白配体药物的出现可以对现有的方法进行更好的改良。使用辣根过氧化物酶连接的Affimers非免蛋白配体药物，在固体载体上的免疫活性不受到影响。一个以Affimer为基础开发的ELISA方法被用于系统性硬化症患者的8个血清纤维化标志物的检测。和荧光生物传感器融合的非免蛋白配体药物，可以在同靶标分子结合后产生可测量的光信号。含有生物传感器用于麦芽糖检测的 DARPin非免蛋白配体药物，被用于结构的基础研究。基于Affimer的 C-反应蛋白免疫分析较临床检测更敏感。

Lipocalins,Adnectins,和Affibodies非免蛋白配体药物作为捕获剂，替代抗体用于芯片检测。结合Taq DNA聚合酶和人IgA的Affibodies非免蛋白配体药物被进行随机固定化，或直接用于免疫方法的优化。多达5万种不同的Affimers非免蛋白配体药物被用于诊断和蛋白组学分析。

非免蛋白配体药物还可以用于其他基于抗体的诊断，如荧光显微镜，流式细胞仪检测，免疫组化和免疫印迹法。结合人IgG的DARPin作为报告蛋白用于细菌的流式细胞仪检测。由荧光蛋白(mCherry或EGFP)和Affibodies(结合HER2和EGFR)组成的成像探针，被用于流式细胞仪、激光共聚焦显微镜，检测细胞和组织水平中相关受体的体外染色和定量检测。结合转录因子c-Jun标记Alexa 488的Affibody非免蛋白配体药物，被用于c-Jun过表达细胞的染色。有部分被商业化的Affibody非免蛋白配体药物也用于上述检测。

在基础和应用研究领域，非免蛋白配体药物是抗体理想的替代品。非免蛋白配体药物被用于诊断方法(酶联免疫印迹，显微镜，流式细胞仪)，以及其他更专业的方法中，如，亲和层析，结构检测，细胞内检测和酶的调节等。

结构信息对于了解蛋白质和其靶标蛋白相互作用至关重要。通过降低靶蛋白的构象自由，非免蛋白配体药物可以作为复杂的或难结晶生物系统的结晶伴侣，如膜蛋白，多蛋白集结，瞬态构象和固有无序蛋白。DARPins非免蛋白配体药物常用于这一领域。例如，多药输出蛋白AcrB，是E. coli的内膜组份，AcrAB-TolC是E. coli耐药系统的主要组成部分，其复合物结构的解析则是使用了DARPin非免蛋白配体药物。乳酸乳球菌的lmrCD是哺乳动物的ATP药物转运体ABCB1的原核同源蛋白，其结构的解析则是使用了结合LmrCD 的DARPin非免蛋白配体药物。凋亡启动凋亡蛋白酶-2与DARPin抑制剂复合物晶体结构解析，揭示了活性部位构象抑制的机制。结合凋亡蛋白酶3,7,和8的DARPins非免蛋白配体药物也被用于结构研究。DARPins非免蛋白配体药物也可以用于非蛋白分子，如DNA的结构解析。人类端粒DNA形成的四链体DNA结构，可以使用四链体DNA结构特异的DARPins非免蛋白配体药物进行结构解析^[8]。

蛋白质的翻译后修饰在信号网络的信号传播中起着关键作用。它们发生在细胞内部包括磷酸化，乙酰化，甲基化，泛素化和糖基化等，一般可以通过质谱或单克隆抗体进行检测。然而，利用特异性抗体进行翻译后修饰的检测受到限制，这就给使用非免蛋白配体药物进行检测提供了机会。例如，利用结合磷酸化和非磷酸化细胞外信号调节激酶2(ERK2)的DARPins非免蛋白配体药物，以及结合丝氨酸/苏氨酸激酶hRaf-1的Affibody非免蛋白配体药物，丝氨酸/苏氨酸激酶hRaf-1对Ras GTPases具有抑制作用，其中Affibody非免蛋白配体药物可以用于研究MAP(丝裂原活化蛋白)/ ERK的信号级联。细胞内表达的非免蛋白配体药物，可作为蛋白质构象的传感器。例如，两DARPins结合ERK的区域是相似的，但是可以区分不同的构象。Adnectin可以特异结合Src激酶活性的“开放式”构象，而不影响酶活，并且可以定量标示细胞内Src活性的分布。

对于目标分子的分离，免疫亲和层析是一个功能强大的技术手段。利用噬菌体展示筛选的特异结合Fc的Repebody非免蛋白配体药物，可以用于人免疫球蛋白的亲和纯化。通过亲和力优化，Affinity非免蛋白配体药物的亲和力可以增加至0.19 mM^[9]。固定化的Repebodies非免蛋白配体药物可以耐受更宽的pH值和温度范围，可用于CHO生产的免疫球蛋白产品的纯化，并可连续使用10次而亲和力不降低。特异性结合DNA聚合酶的Affibody非免蛋白配体药物，可以用于热启动PCR产品。在室温条件下，Affibody非免蛋白配体药物和DNA聚合酶结合抑制酶活。在聚合温度下，该非免蛋白配体药物降解，聚合酶活性被激活，DNA模板开始扩增。

经过了二十多年的发展，对于靶标分子具有高特异性和高亲和力的非免蛋白配体药物得到了广泛的应用，并且不断有新型非免蛋白配体药物被报道。非免蛋白配体药物可以从上十亿的蛋白质库中筛选合适的分子。它们广泛应用于治疗，诊断，基础和应用研究领域。和抗体相比，大多数非免蛋白配体药物属于小结构域蛋白分子，不需要翻译后修饰，可以利用简单的微生物表达进行产业化生产。其分子量小，较易实现多聚化，或者同其他的非免蛋白配体药物或抗体实现融合，从而使得复合分子具有多重的特异性。和放射性元素或荧光染料结合，也扩大了非免蛋白配体药物的适用范围。此外，缺少二硫键的非免蛋白配体药物可以在缺少细胞内环境中进行表达，这为激活和抑制的生物医学方法开辟了新的道路。另一方面的进步是，非免蛋白配体药物的生物物理性能，快速的组织渗透，目标保持和血液清除，作为药代动力学适当的伙伴分子，这使其在治疗和诊断领域发挥作用。治疗和诊断领域仍是新的非免蛋白配体药物研发的驱动力。

现有十余个非免蛋白配体药物处于临床试验的不同阶段，这表明在不久的将来可能有新的非免蛋白配体药物批准上市。在这些非免蛋白配体药物中，仅有Dyax公司发布的艾卡拉肽(Ecallantide)在2009年被批准上市，2013年的销售额是6500万美元，是一种激肽释放酶抑制剂。大量的临床试验表明，非免蛋白配体药物，特别是人源的非免蛋白配体药物的免疫原性很低，易于临床监管。然而，考虑到漫长和昂贵的临床试验，研究者将他们的注意力转向其他可能的应用基础和应用研究。Affibodies非免蛋白配体药物是显微镜，流式细胞仪和免疫印迹方法中理想的抗体替代品。客户可以根据自己的需求定制和筛选。靶向研究靶点的Affimers非免蛋白配体药物，大量DARPins非免蛋白配体药物被用于细胞内调控及分子结构解析的研究。非免蛋白配体药物的使用，降低了基础研究的难度。

随着人们对非免蛋白配体药物认识的加深，基因合成及蛋白重组表达成本的下降，非免蛋白配体药物将在更广阔的领域展现其独特的优势。