中国生物工程杂志  2016, Vol. 36 Issue (2): 7-15

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张旭凡, 胡发彪, 马兴元, 王天文, 王平, 王晓丽
ZHANG Xu-fan, HU Fa-biao, MA Xing-yuan, WANG Tian-wen, WANG Ping, WANG Xiao-li
由乙肝病毒核心蛋白(HBc-VLP)递载的流感通用疫苗Flu@uV设计构建、表征及初步活性研究
Design, Construction, Characterization and Preliminary Activity Research of Universal Influenza Virus Vaccine(Flu@uV) Delivered by Hepatitis B Virus Core Protein(HBc-VLP)
中国生物工程杂志, 2016, 36(2): 7-15
China Biotechnology, 2016, 36(2): 7-15
http://dx.doi.org/10.13523/j.cb.20160202

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收稿日期: 2015-11-20
修回日期: 2015-11-24
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张旭凡, 胡发彪, 马兴元, 王天文, 王平, 王晓丽. 由乙肝病毒核心蛋白(HBc-VLP)递载的流感通用疫苗Flu@uV设计构建、表征及初步活性研究[J]. 中国生物工程杂志, 2016, 36(2): 7-15.
ZHANG Xu-fan, HU Fa-biao, MA Xing-yuan, WANG Tian-wen, WANG Ping, WANG Xiao-li. Design, Construction, Characterization and Preliminary Activity Research of Universal Influenza Virus Vaccine(Flu@uV) Delivered by Hepatitis B Virus Core Protein(HBc-VLP)[J]. China Biotechnology, 2016, 36(2): 7-15.
由乙肝病毒核心蛋白(HBc-VLP)递载的流感通用疫苗Flu@uV设计构建、表征及初步活性研究
张旭凡, 胡发彪, 马兴元 , 王天文, 王平, 王晓丽    
华东理工大学 生物工程学院 生物反应器工程国家重点实验室 上海 200237
收稿日期: 2015-11-20; 修订日期: 2015-11-24;
通讯作者, 电子信箱: maxy@ecust.edu.cn
摘要: 目的:构建以HBc为载体的甲型流感病毒HA和M2e流感通用疫苗(Flu@uV),利用大肠杆菌BL21(DE3)表达系统,进行初步的蛋白表达及纯化。在此基础上,构建DNA流感通用疫苗。方法:利用全基因合成的序列为模板,成功构建HA-M2e-HBc、M2e-HBc、HBc、3M2e-HBc和3HA-3M2e-HBc基因的重组质粒,并在大肠杆菌中表达,经SDS-PAGE、Western blot和电镜检测其表达。将纯化的蛋白与弗氏佐剂共同免疫小鼠,取小鼠外周血进行流式细胞分析。通过荧光分析和Western blot初步验证DNA流感通用疫苗在人源胚胎肾细胞(HEK293T)中的表达情况。结果:成功表达纯化了HA-M2e-HBc、M2e-HBc、HBc和3M2e-HBc四种蛋白,经电镜观察到30nm左右的蛋白纳米颗粒样结构。小鼠外周血流式细胞分析显示HBc和3M2e-HBc可以增加小鼠的免疫力,而HA-M2e-HBc和M2e-HBc对小鼠免疫力的提高没有影响。通过荧光检测和Western blot检测说明DNA流感通用疫苗在真核细胞中成功表达。结论:成功构建HBc与甲型流感病毒HA和M2e的病毒样颗粒,为流感通用疫苗的研制奠定了重要基础。
关键词: 流感通用疫苗     HBc-VLP     设计构建与表征     免疫活性    
Design, Construction, Characterization and Preliminary Activity Research of Universal Influenza Virus Vaccine(Flu@uV) Delivered by Hepatitis B Virus Core Protein(HBc-VLP)
ZHANG Xu-fan, HU Fa-biao, MA Xing-yuan , WANG Tian-wen, WANG Ping, WANG Xiao-li    
School of Biotechnology and State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China
Abstract: Objective:To construct a universal influenza virus vaccines(Flu@uV), a universal influenza virus vaccine containing HA and M2e of influenza A virus was disigned and constructed. Hepatitis B virus core protein(HBc-VLP) was used as the delivery vector and adjuvant in the Flu@uV. The universal influenza antigen proteins were expressed in E. coli BL21(DE3) and purified for preliminary activity assay. Method:Using the synthesized gene sequence as a template, recombinant plasmids expressing HA-M2e-HBc, M2e-HBc, HBc, 3M2e-HBc and 3HA-3M2e-HBc were successful constructed. Their expression in E. coli was tested through SDS-PAGE, Western blot and electron microscopy. Mices were co-inoculated by purified protein with Freund's adjuvant. Flow cytometry was used to analyze peripheral blood of immunized mice. Expression of the corresponding DNA vaccine in human embryonic kidney cells(HEK293T) was preliminary validated by fluorescence analysis and Western blot. Result:Four kinds of HA-M2e-HBc, M2e-HBc, HBc and 3M2e-HBc proteins were successfully expressed and purified. Protein nanoparticles about 30 nm could be observed through electron microscope. Flow cytometry analysis of the peripheral blood showed that HBc and 3M2e-HBc increased the immunity of mice, and HA-M2e-HBc and M2e-HBc had no effect on that. DNA universal influenza virus vaccines were successfully expressed in eukaryotic cells through fluorescence detection and Western blot. Conclusions:A virus-like particles containing HBc, HA, and M2e of influenza A virus was successfully constructed, it laying a base for the development of universal influenza virus vaccine.
Key words: Universal influenza virus vaccine(Flu@uV)     HBc-VLP     Design construction and characterization     Immune activity    

流行性感冒(Influenza)简称流感，是由流感病毒引起的一种急性呼吸道传染病，传染性强，发病率高。引发流感的病毒是RNA病毒，分甲(A)乙(B)丙(C)三型[1]，甲型(A)流感病毒一般会大幅度蔓延，引起感冒大流行，并不断变异，对人体健康构成极大威胁。流感病毒A在膜上表达两个高免疫原性但极易变化的蛋白：血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)，其中H(H1-H17)、N(N1-N9)，另外病毒表面和内部还有多种抗原相关蛋白，如图 1所示，因而，流感病毒有多种亚型。疫苗接种是预防流感的最有效手段，但是由于流感病毒抗原的不断变异和难预测性，给流感疫苗的有针对性研发和防制带来很大的难度。目前的流感疫苗主要是三价灭活的病毒疫苗[2]，其生产周期长，对变种或新出现的亚型保护效果弱，需每年更新。因此，研制能够预防所有流感毒株、可诱导持久保护性免疫的通用流感疫苗成为目前最具有吸引力的流感疫苗研究方向。

图 1 流感病毒结构的蛋白组成 Fig. 1 Structure of influenza viruses
图选项

病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)一般具有天然的自我装配能力，可包裹核酸或其他小分子，可作为基因或药物的运载工具。目前主要用作基因载体，如多瘤病毒的衣壳蛋白VPl、乳头瘤状病毒衣壳蛋白L1和乙肝核心蛋白(hepatitis B virus core protein，HBc)，HBc经常被用来制备嵌合HBc-VLP，如图 2所示，有报道称HBc具有一定的树突状细胞(DC)靶向性，并能有效地促进DC成熟，同时也能活化单核细胞和巨噬细胞[3]。乙型肝炎病毒核心蛋白(hepatitis B virus core protein，HBc)在大肠杆菌中可自组装形成二十面体对称的类病毒颗粒(virus-like particle，VLP)结构[4, 5]，可以模拟天然病毒的构象，且缺少感染性核酸，安全性好。抗原表位与HBc共同作用可显著增强抗原表位的免疫活性[6]。

图 2 乙肝病毒核心蛋白(HBc-VLP) 二十面体结构 Fig. 2 Twenty surface body structure of(HBc-VLP)
图选项

本实验室构建了以HBc为载体的甲型流感病毒HA和M2e[7]流感通用疫苗(Flu@uV)，利用大肠杆菌BL21(DE3)表达系统，进行初步的蛋白表达及纯化。在Flu@uV的基础上，构建DNA流感通用疫苗。为制备流感通用疫苗奠定了基础。

1 材料与方法 1.1 材 料

pUC57-HA-M2e-HBc和pUC57-3HA-3M2e-HBc由上海睿迪生物公司进行全基因合成，pET-28a(+)、pET-24a(+)、pET-22b(+)、pcDNA3.1和pcDNA3.1-egfp购自Novagen公司，限制性内切酶NdeI、NcoI和XhoI、Premix Taq DNA 聚合酶购自大连TaKaRa公司，FITC anti-mouse CD4和APC anti-mouse CD8α购自Biolegend公司，Freund’s adjuvant购自上海AOGMA公司，HEK(human emborynic kidney)人源胚胎肾细胞购于中国科学院上海细胞库，BALB/c小白鼠购自复旦大学实验动物科学部，E.coli DH5α和E.coli BL21(DE3)由本实验室保存，其他化学试剂为分析纯。

1.2 方 法 1.2.1 抗原基因的选择与合成

通用抗原序列的选择主要是根据各流感病毒的保守抗原进行比对和优选，具体选择的序列如表 1所示。将M2e的抗原表位[8, 9]MSLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSD和HA2的抗原表位[10, 11]GLFGAIAGF以不同的串联组合方式展示在乙型肝炎病毒核心蛋白的外表面，由上海睿迪生物公司全基因合成pUC57-HA-M2e-HBc和pUC57-3HA-3M2e-HBc。

表 1 通用抗原保守序列的选择 Table 1 Selection of common antigen conserved sequence
序列总长所选序列长度保守性                                                            功能
M297aa24aa(M2e)>95%离子通道活性(病毒入侵宿主时，离子通道活性增强，离子通过通道进入病毒，使HA与M1的连键破坏)
HA2222aa9aa40%~60%构象变化 使病毒与宿主融合
NP498aa9aa>90%NP蛋白与病毒RNA基因组结合起来,在病毒与宿主细胞之间起转接器作用
表选项
1.2.2 引物设计

根据引物设计原则，分别设计HA-M2e-HBc、M2e-HBc、HBc、3M2e-HBc和3HA-3M2e-HBc上下游的引物。

1.2.3 PCR和扩增产物回收

按说明配制PCR反应体系：模板1μl，上游引物1μl，下游引物1μl，Taq DNA聚合酶25μl，ddH2O 22μl。瞬时离心后，95℃预变性8min；94℃ 30s，62℃ 30s，72℃延伸37~53s，30个循环；72℃终延伸10 min，4℃储存。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，回收目的片段。

1.2.4 目的片段和表达载体的连接

回收的目的片段与载体pET-28a(+)、pET-24a(+)、pET-22b(+)、pcDNA3.1和pcDNA3.1-egfp质粒DNA分别经限制性内切酶XhoI和NdeI或NcoI双酶切回收后，然后使用连接试剂盒进行酶切产物的连接，连接温度为16℃，连接时间为10 h。连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α，挑取经卡那霉素抗性筛选的单克隆菌落扩增培养，将培养的菌液送公司测序，将测序结果与全基因合成的序列进行比对。对测序成功的阳性克隆进行质粒的抽提，用化学法将重组质粒转入到大肠杆菌BL21感受态细胞中。

1.2.5 融合蛋白的表达与纯化

重组质粒转化E.coli BL21(DE3)后，挑取单个菌落接种于含相应抗生素的5 ml LB培养基中，37℃，200r/min培养12h；按1∶100的比例将经12h培养的菌液加入到含100ml LB培养基的锥形瓶中，37℃，200r/min培养3h，至OD600达到0.6左右为止；锥形瓶中加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L，30℃，200r/min诱导10h；诱导结束后，4℃，6 000r/min离心8min收集菌体，于－20℃保存。针对上清或包涵体表达的目的蛋白进行不同的纯化及透析，通过SDS-PAGE 电泳和Western blot检测目的蛋白。

1.2.6 目的蛋白颗粒的电镜表征

将铜网正面朝上放到滤纸上，滴加50μl待观察的蛋白溶液到铜网正中间，待蛋白溶液自然风干后，将滴加蛋白溶液的铜网一面在磷钨酸溶液中浸泡20s，之后将铜网上多余的磷钨酸溶液用滤纸吸干，样品透射电镜中观察并拍照。

1.2.7 流感通用疫苗活体实验

将HA-M2e-HBc、M2e-HBc、HBc和3M2e-HBc四种蛋白分别免疫BALB/c小鼠，初次免疫采用弗氏完全佐剂与抗原共同免疫的方式，增强免疫采用弗氏不完全佐剂与抗原共同免疫的方式。并对免疫后小鼠的体重变化进行记录并分析，观察抗原是否对小鼠体重变化有一定的影响。将经初次免疫和增强免疫的小鼠外周血样品简单处理后通过流式细胞仪分析外周血T淋巴细胞中CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的含量，及CD4+ T/CD8+ T的变化。

1.2.8 重组真核质粒转染HEK293T细胞及荧光检测

使用Lipofectamine 2000转染试剂完成质粒DNA的瞬时转染，针对HEK-293T细胞，选取质粒和Lipofectamine 2000的最佳转染比例。并利用荧光显微镜检测带有荧光蛋白基因的质粒转染细胞的情况。

1.2.9 Western blot检测

四种带有目的蛋白基因的真核表达质粒分别转染HEK293T细胞后，通过anti-HBcAg抗体Western blot检测。

2 结 果 2.1 PCR和扩增产物鉴定

经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，获得HA-M2e-HBc、M2e-HBc、HBc、3M2e-HBc和3HA-3M2e-HBc大小分别约为552 bp、532 bp、460 bp、685 bp和765 bp的目的基因片段，与预计片段大小相符(图 3)，表明获得所需的目的片段。

图 3 目的基因的PCR扩增 Fig. 3 PCR amplification of interest gene (a) PCR amplification of HA-M2e-HBc M：DL2000 Marker； 1,2：HA-M2e-HBc gene(His label in C- terminal domain)； 3,4： HA-M2e-HBc gene(His label in N- terminal domain) (b) PCR amplification of M2e-HBc M：DL2000 Marker； 1,2：M2e-HBc gene (c) PCR amplification of HBc M：DL2000 Marker； 1,2：HBc gene (d) PCR amplification of 3M2e-HBc M：DL2000 Marker； 1,2：3M2e-HBc gene (e) PCR amplification of 3HA-3M2e-HBc M：DL2000 Marker； 1,2：3HA-3M2e-HBc gene
图选项
2.2 质粒构建

基于蛋白流感通用疫苗(Flu@uV)，构建了HA-M2e-HBc，M2e-HBc，HBc，3M2e-HBc，3HA-3M2e-HBc的重组质粒(图 4)。在Flu@uV的基础上，构建了DNA通用流感疫苗，包括pcDNA3.1-egfp、pcDNA3.1-HA-M2e-HBc-egfp、pcDNA3.1-M2e-HBc-egfp、pcDNA3.1-HBc-egfp和pcDNA3.1-3M2e-HBc-egfp五种带有荧光蛋白基因的重组质粒和pcDNA3.1-HA-M2e-HBc、pcDNA3.1-M2e-HBc、pcDNA3.1- HBc和pcDNA3.1-3M2e-HBc四种不带荧光蛋白基因的重组质粒。

图 4 候选疫苗表达载体设计与构建 Fig. 4 Schematic of design and construction of candidate vaccine expression vector (a) pET-28a-HA-M2e-HBc(XhoI/ NcoI) (b) pET-28a-HA-M2e-HBc(XhoI/ NdeI) (c) pET-28a-M2e-HBc(XhoI/ NdeI) (d) pET-28a-HBc(XhoI/ NdeI) (e) pET-28a-3M2e-HBc(XhoI/ NdeI) (f) pET-28a-3HA-3M2e-HBc(XhoI/ NcoI) (g) pET-24a-3HA-3M2e-HBc(XhoI/ NdeI) (h) pET-22b-3HA-3M2e-HBc(XhoI/ NdeI)
图选项
2.3 融合蛋白的表达与纯化结果

HA-M2e-HBc、M2e-HBc、HBc、3M2e-HBc、3HA-3M2e-HBc五种重组蛋白中HA-M2e-HBc、M2e-HBc、HBc、3M2e-HBc四种蛋白都得到了有效的表达，而3HA-3M2e-HBc未能表达。M2e-HBc、HBc、3M2e-HBc和HA-M2e-HBc四种蛋白可以通过蔗糖密度梯度离心[12, 13]的方法加以纯化。从M2e-HBc、HBc、3M2e-HBc、HA-M2e-HBc的蔗糖梯度密度离心16h和4h的电泳结果(图 5)发现，35%~50%左右的蔗糖浓度范围内可以得到纯度较高的蛋白纳米颗粒。四种蛋白都能通过anti-HBcAg抗体Western blot检测出来(图 6)。其中HBc条带最亮，因其没有与其他蛋白相连接。3M2e-HBc的条带是最暗的，可能是因为其上的3M2e序列较长，影响了抗体与HBc的作用。

图 5 蔗糖密度梯度离心SDS-PAGE鉴定 Fig. 5 SDS-PAGE identification of sucrose density gradient centrifugation A,B,C,D respectively represent M2e-HBc,HBc,3M2e-HBc,HA-M2e-HBc;SDS-PAGE for sucrose density gradient centrifugation of 16h;E,F,G,H,D respectively represent M2e-HBc,HBc,3M2e-HBc,HA-M2e-HBc;SDS-PAGE for sucrose density gradient centrifugation of 4h
图选项
图 6 anti-HBcAg抗体Western blot检测四种原核表达目的蛋白 Fig. 6 anti-HBcAg antibody Western blot detection of four antigen proteins of prokaryotic expression
图选项
2.4 目的蛋白颗粒的电镜表征

HA-M2e-HBc、HBc、M2e-HBc和3M2e-HBc四种蛋白都能拍到理想的颗粒图片(图 7)。其中HBc和M2e-HBc经过蔗糖密度梯度离心后纯化出来的目的蛋白颗粒大小在30nm左右，且比较均匀。HA-M2e-HBc和3M2e-HBc分别经过包涵体纯化和镍柱纯化后拍到的目的蛋白颗粒均匀性较差。

图 7 目的蛋白颗粒的透射电镜图 Fig. 7 Transmission electron microscopy picture of protein particles (A) HA-M2e-HBc a,b,c,d：HA-M2e-HBc purified by inclusion body washing method (B) HBc a,b,c：HBc of sucrose density gradient centrifugation purification ;d：HBc of nickel column purification (C) M2e-HBc and 3M2e-HBc a: M2e-HBc of sucrose density gradient centrifugation purification; b: 3M2e-HBc of nickel column purification
图选项
2.5 Flu@uV活体实验 2.5.1 免疫后小鼠体重变化

Flu@uV免疫小鼠后，小鼠体重(图 8)没有明显变化，说明佐剂与抗原共同免疫小鼠对小鼠没有威胁。

图 8 Flu@uV免疫小鼠后体重变化 Fig. 8 Change of body weight after Flu@uV immune mice (a) Body weight changes after immuned by HA-M2e-HBc (b) Body weight changes after immuned by M2e-HBc (c) Body weight changes after immuned by HBc (d) Body weight changes after immuned by 3M2e-HBc
图选项
2.5.2 外周血流式细胞分析CD4+ T，CD8+ T含量变化

BALB/c小鼠 CD4+ T/CD8+ T的正常比值一般是2∶1左右，在T淋巴细胞中所占的比率分别为40％和20％。CD4+ T细胞和CD8+ T细胞亚群的比率不在正常的范围内将会引起许多种疾病。经HBc(40μg)、3M2e-HBc(30μg)和3M2e-HBc(40μg)三组蛋白分别免疫的小鼠外周血流式细胞分析结果(图 9)显示，小鼠外周血淋巴细胞中CD4+ T细胞的含量都远远高于CD8+ T细胞的含量。3M2e-HBc(40μg)蛋白免疫小鼠后CD4+ T/CD8+ T比值明显高于经3M2e-HBc(30μg)蛋白免疫小鼠后CD4+ T/CD8+ T的比值(表 2)。说明3M2e-HBc蛋白的免疫剂量从30μg增加到40μg可以提升小鼠的免疫力。而经HA-M2e-HBc和M2e-HBc两种蛋白分别免疫的小鼠外周血淋巴细胞中CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的含量与正常值没有明显的变化。综上所述，3M2e-HBc可以增加小鼠的免疫力，而HA-M2e-HBc和M2e-HBc对小鼠免疫力的提高没有影响。

图 9 免疫小鼠外周血流式细胞分析 Fig. 9 Flow cytometry analysis of peripheral blood of immunized mice (a) HBc(40μg)control group (b) HBc(40μg)experimental group (c) 3M2e-HBc(30μg)experimental group (d) 3M2e-HBc(40μg)experimental group
图选项
表 2 流式细胞分析得出的CD4和CD8含量 Table 2 CD4 and CD8 content of flow cytometry analysis
CD4CD8CD4+ T/CD8+T
HBc(40μg)40.5%6.18%6.55
3M2e-HBc(30μg)43.4%12.8%3.39
3M2e-HBc(40μg)46.0%7.55%6.09
表选项
2.6 含目标抗原基因质粒转染细胞表达检测结果

五种带有目的蛋白基因的真核表达质粒分别转染HEK293T细胞后都能观察到荧光(图 10)，说明经过转染的细胞都成功表达了绿色荧光蛋白。构建的质粒中目的蛋白基因先于绿色荧光蛋白基因表达，细胞能表达绿色荧光蛋白，那么绿色荧光蛋白基因前端的目的蛋白基因也能得到相应的表达。

图 10 质粒转染细胞48h后荧光检测结果 Fig. 10 Fluorescence of plasmid transfected

cells after 48h A:pcDNA3.1-egfp；B:pcDNA3.1-HA-M2e-HBc-egfp；C:pcDNA3.1-M2e-HBc-egfp；D:pcDNA3.1- HBc-egfp； E:pcDNA3.1-3M2e-HBc-egfp
图选项
2.7 质粒转染细胞后Western blot结果

四种带有目的蛋白基因的真核表达质粒分别转染HEK293T细胞后都能通过anti-HBcAg抗体Western blot(图 11)检测出来。

图 11 anti-HBcAg抗体Western blot检测四种细胞表达的目的蛋白 Fig. 11 Anti-HBcAg antibody Western blot detection of four objective proteins of cell expression
图选项
3 结论与展望

本研究基于流感病毒免疫蛋白HA和M2中的保守性抗原表位设计了蛋白基础上的Flu@uV疫苗和DNA基础上的通用流感疫苗。HA-M2e-HBc，M2e-HBc，HBc和3M2e-HBc四种蛋白都成功地得到了表达，都纯化得到了纯度较高的蛋白。HBc和3M2e-HBc两种蛋白都发挥了一定的免疫活性，此结果还需要进一步的实验证明。构建的DNA通用流感疫苗通过荧光分析和Western blot初步检测了其在HEK293T中的表达情况，但其作为DNA通用流感疫苗的活性还有待研究。

流感病毒通用抗原主要位于M2、HA以及NP蛋白的保守区域，结合纳米粒子对这些抗原进行展示，在动物模型中显示了较好的型间或亚型间交叉保护效果，预示着通用型流感疫苗的广阔应用前景。但是也应该注意到通用型疫苗的开发面临许多问题和困难。由于动物模型间保护效果存在差异，上述通用疫苗的作用机理、临床试验的安全性及有效性仍待进一步研究。研究出易于生产和广泛使用的疫苗仍然是目前通用型流感疫苗研究面临的重要问题。

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