毕赤酵母(Pichia pastoris)是一类能够以甲醇为唯一碳源生长的单细胞真核生物。随着菌株和载体的不断改良，在近20年中，毕赤酵母成为了表达蛋白时常用的酵母^[1]。毕赤酵母表达系统在蛋白质表达方面具有许多特有的优势，如具有外源基因遗传稳定、细胞生长速率快、产物表达效率高、不受内毒素和噬菌体影响^[2]等优点，能够有效地转录和翻译，准确的完成糖基化、磷酸化、二硫键形成等翻译后加工修饰，更客观的表达天然蛋白质的结构和功能^[3]。该系统成为目前研究最多、应用最为广泛的真核表达系统 ^{[4, 5]}。近年来，毕赤酵母被美国FDA认定为GRAS(generally recognized as safe)微生物，为其在食品和医药上的应用铺平了道路^[6]。例如，在药物和制药领域成功表达了融合蛋白M-IL-2(⁸⁸Arg、¹²⁵Aia)、S-腺苷基甲硫氨酸(SAM)、人体干扰素α2b、白细胞介素-II、C型溶菌酶Lyzl6等^{[7, 8, 9, 10, 11]}，在食品酶制剂领域中成功表达了果糖酶^[12]等，在饲料领域成功表达了植酸酶、木聚糖酶、β葡聚糖酶^[13]等，其中有些产品早已实现商品化和产业化。近几年毕赤酵母也被广泛应用到禽抗菌肽的表达研究^[14]。因此，毕赤酵母表达系统在生物工程领域的重要价值得到了充分的发挥。

毕赤酵母表达系统是一种新型外源表达体系，近年来，随着Invitrogen公司研究开发的毕赤酵母表达试剂盒^[15]、表达操作手册及发酵手册等一系列毕赤酵母表达工具的推广和应用，毕赤酵母表达系统持续受到国内外学者的重视，迄今为止，已有1 000多种外源蛋白在该系统中成功表达并且涉及众多行业 ^[16]。

毕赤酵母染色体中存在乙醇氧化酶(alcohol oxidase，AOX)，分别为AOX1和AOX2，其中AOX1受甲醇的严格调控和诱导，在甲醇代谢中起主要作用，有利于外源基因的表达。AOX是甲醇代谢途径的关键酶，可达到可溶性蛋白的30%。

毕赤酵母常用的菌株来源于对野生型石油酵母细胞Y-11430的突变改造。其中常用的毕赤酵母宿主菌基因型有GS115、X33、GS190、KM71、SMDLL65等。为了方便重组菌的筛选，其中有一些被改造为组氨酸脱氢酶(histidinol dehydrogenase,His4) 基因的突变型菌株，如GS115、KM71等。大多数毕赤酵母菌株都是针对His4进行突变，形成营养缺陷型菌株，由此可以有效降低外源蛋白的降解。

毕赤酵母有自我复制型载体和整合型载体，因前者极不稳定，故多采用整合型载体。毕赤酵母的整合型载体根据能否分泌异源蛋白可分为胞内表达载体(如pPIC3、pPSC3k、pAO815等)和胞外表达载体(如pPIC9、pPIC9K、pGAPZa等)，根据表达方式不同可分为诱导型表达载体(pPIC9K)和组成型表达载体(pGAPaA)^[17]。

按照菌株的基因型，将毕赤酵母分为三种表型:甲醇利用快型(Mut⁺)、甲醇利用慢型(Mut^s)、甲醇不利用型(Mut^－)。Mut⁺菌株含有AOX1基因，能够快速利用甲醇作为碳源和能源，以野生型速率生长；Mut^s菌株虽然不含AOX1基因，但含有AOX2基因，能够缓慢利用甲醇；Mut^_菌株中的AOX1基因和AOX2基因同时缺失，因此不能在甲醇型培养基中生长^[18]。

高密度发酵又称为高细胞密度发酵，是指在一定的培养条件和体系下，使菌体的密度比普通发酵时有显著性的提高，从而可以获得更多或更高效目标产物的发酵技术。高密度发酵已成为生物技术中进行中试生产的主要发酵工艺，其工艺稳定，发酵周期可缩短50%，菌体产量和产物表达量是非高密度发酵的10~50倍，蛋白质活性提高2~3倍^[19]，从侧面降低了生产成本的同时也提高了生产效率。除此之外还可以减少对环境的污染、能源的消耗及设备的投资，极大地提高了表达产品在市场上的竞争力^[20]。

毕赤酵母是好氧型微生物，适合扩大培养，一般认为培养密度为20~200g/L即为高密度发酵^[21]。毕赤酵母的高密度发酵方式通常采用分批发酵方式，首先先用碳源使细胞密度累积到一定的生物量，然后再用甲醇进行诱导^[22]。发酵过程可以分为三个阶段，即甘油分批发酵阶段、甘油补料分批发酵阶段及甲醇补料诱导表达阶段^[23]。在发酵过程中，各阶段发酵条件的优化及参数的有效控制对目的蛋白的高效表达起着至关重要的作用。

毕赤酵母表达系统对不同外源蛋白的表达水平相差很大，最高可达22g/L，而最低只有 lmg/L，相差达到20 000倍^[24]。外源蛋白表达的差异性一方面是由于外源基因本身的特性，另一方面则取决于发酵条件。

提高偏好密码子的使用频率是提高外源蛋白表达量的有效方法之一。当外源基因中存在稀有密码子时就会严重影响其在宿主中的表达^[25]。例如，Xu等^[26]在毕赤酵母表达系统中表达脂肪酶时，将脂肪酶基因17个不常用的丝氨酸密码子改成了常用的密码子TCT，结果成功表达了较强的水解活性。

此外，外源基因碱基A+T的含量也是影响外源蛋白表达的一个主要因素。研究显示，A+T含量达到30%~50%时，最适合外源基因的表达。例如，Jia等^[27]在毕赤酵母表达系统中表达嗜热木聚糖时，通过降低A+T的含量使外源基因表达提高了2.8倍。

在毕赤酵母高密度发酵的过程中，发酵条件是影响毕赤酵母蛋白表达量的主要因素，其中包括培养基的组成、温度、pH、溶氧量、补料流加策略等。

培养基为酵母细胞生长提供营养物质，特别是在高密度发酵的条件下，培养基的组成直接影响酵母细胞的生长、外源基因的表达及工程菌的遗传稳定性。在毕赤酵母高密度发酵过程中，酵母菌不仅需要有机化合物作为碳源和能量，还需要无机氮源或有机氮源、矿物盐和微量元素等。在毕赤酵母生长期，甘油是较为常用的碳源，也有以葡萄糖为底物的，但由于葡萄糖对外源蛋白表达有一定的抑制作用，因此所用不多^[2]。在培养毕赤酵母菌时，目前大多还是采用Invitrogen公司提供的培养基配方，如BMG/BMM、BMGY/BMMY、MGY/MMY、BSM等，但是在实际发酵过程中仍存在一些问题，近期研究发现，使用BSM培养基会导致毕赤酵母菌达到对数生长期所需时间较长^[28]，除此之外，BSM培养基还具有组分不平衡、沉淀、离子强度等^[23]缺点，使菌体生物量较低,不利于目的蛋白的表达，并且PTM1微量元素的成分较复杂，主要以盐类为主，营养单一且价格相对较高，尤其在高温灭菌培养基时不能加入，否则易生成沉淀，给发酵带来不便。因此，徐爱才等^[29]用低浓度酵母粉来代替BSM中的PTM1，再利用响应面法得到培养基最佳浓度为0.03%硫酸钙、0.6%酵母提取物、7.7%磷酸缓冲液(pH6.0)，在此培养基条件下，甜蛋白Monellin的生物量增加了0.5倍，蛋白质表达量提高了近60%。

近年来，氮源优化已经成为研究热点，大多学者多采用恒定或变梯度氨离子浓度法来进行优化。例如，Zhang等^[8]在诱导表达S-腺苷基甲硫氨酸(SAM)时，维持 NH⁺₄ 浓度在8.1g/L条件下时，外源蛋白的表达量可达到最高，同时发酵时间也缩短了43h。因此优化发酵培养基中的组分在满足细胞旺盛生长的同时还能够实现目的产物的高效表达。

温度是影响毕赤酵母菌生长和调控细胞代谢的重要因素。温度较高有利于菌体的高密度生长，低温则能够提高目的蛋白的表达量。在菌体生长阶段和诱导阶段应采用不同的培养温度，这样既有利于提高酵母菌的生长，又能够提高重组产物的表达量，还可以缩短培养周期，生长阶段最适温度为30℃，诱导阶段的温度稍低，一般为20~28℃。据文献报道，低温发酵有利于新生肽的正确折叠、提高目的蛋白的稳定性、有利于分泌产物在培养基中的累积^[30]，同时还能够减少菌体的死亡并且保护目的蛋白不被降解^[31]。Jin等^[32]利用低温高密度发酵外源干扰素-α，20℃时的表达量是30℃时表达产量的1.6倍，可达到5g/L。

在毕赤酵母发酵过程中，菌体代谢会产生大量的乙酸、乳酸等，由于这些产物的不断累积，会引起发酵机制pH的改变。pH的变化会导致菌体内H⁺或OH^－的浓度改变，对菌体的生长、目的蛋白的表达和活性等都有非常显著的影响。毕赤酵母细胞能够适应比较宽泛的pH环境，可以在pH 2.0~7.5生长。不同的蛋白质适应的pH范围不同，而且不同的重组蛋白对不同的蛋白酶的耐受性也有差异，选择适当的pH能够在促进细胞生长的同时避免蛋白酶的活性降低，还可以防止目的蛋白的降解^[33]。据报道，许多国内外学者利用响应面分析法、正交设计等对pH的条件进行条件优化,从而确定生长期和诱导期的最佳pH^{[34, 35]}。在工业生产中一般多采用在线补加氨水的方法来调节培养基中的pH，氨水可以作为发酵过程中的氮源，使菌体快速生长，最终让目的产物表达完全^[36]。此外，培养基中通过加入考马酸、EDTA、YP等成分控制pH还可以提高分泌蛋白的稳定性^[37]。

毕赤酵母是好氧微生物，它的生长代谢都需要氧气的参与，溶氧量(dissolved oxygen content，DO)是酵母细胞生长过程中最重要的检测指标之一，它直接影响着酵母细胞的生长和代谢。在高密度发酵的过程中，保证氧气的足够供给是提高外源蛋白表达量的重要因素。DO逐渐下降表明菌体正在消耗培养基中的碳源，DO陡然上升表明碳源耗尽，菌体缺乏营养物质，需要及时补加碳源。当氧气不足时，菌体的生长就会受到抑制，当DO过高时，发酵液中高浓度的氧自由基就会使菌体中毒死亡。发酵过程中DO一般控制在30%左右，而在诱导表达阶段DO一般维持在20%左右^[38]。通常通过增大搅拌转速、增大通气量及增大罐压来满足菌体对氧的需求，还可以通过调整补料策略来控制溶氧，有时甚至直接通入纯氧来增加溶氧量。除此之外，邓毛程等^[39]在高密度发酵谷氨酸时通过优化搅拌形式来提高溶氧水平。

甲醇作为发酵过程中的碳源和诱导剂，它的补加策略、用量及诱导时间都直接影响菌体的生长与外源蛋白的表达。一般认为，甲醇的最终浓度为培养基总体积的0.5%~1%^[40]，并且对诱导时间也有一定的要求，根据载体的特点及外源蛋白的特性来选择最佳的诱导时间。国内外近年来的研究显示，甲醇的流加策略主要有在线和离线甲醇监控仪器来控制甲醇的流加、溶氧控制甲醇的流加、恒定甲醇浓度流加、指数流加方式控制甲醇的流加、碳源混合流加等。

(1)在线和离线甲醇监控仪器来控制甲醇的流加。离线检测包括气象色谱法、高效液相色谱法等，由于其检测的滞后性无法准确的控制甲醇的流加速率，从而导致外源蛋白表达不完全或菌体中毒死亡。

在线检测法通常是针对甲醇挥发性的检测，常用的检测方法是通过分析发酵过程中所排出的尾气，同时结合甲醇在气液两相中的平衡系数得出发酵液中甲醇的浓度^[41]。Surribas等^[42]发明了一种自动化连续诊断分析方法作为在线控制甲醇浓度的方法，该方法比尾气检测系统更加实用。火焰离子检测器属于多用检测器，既可以离线检测发酵培养液中甲醇的浓度，还可以在线监测发酵液中甲醇浓度的变化^[43]。华东理工大学生物反应器国家重点实验室研制开发了甲醇传感器,通过在线检测甲醇浓度来控制甲醇的流加，由于传感器灵敏度高,响应时间短,因此能有效地控制甲醇的流加速率,使甲醇的浓度维持恒定,弥补了上述方法的不足,是目前最好的一种检测甲醇浓度的方法，但是由于该设备较贵,暂时还不能得到普遍使用^[44]。

(2)溶氧控制甲醇流加。溶氧控制甲醇流加速率是目前最常见的方法，利用溶氧电极作为反馈指标，根据DO值可自动调节甲醇的流加速率。首先使DO维持在预先设定值，通常为15%~20%，通过DO的变化对甲醇的流加速率进行调整,这样不但能提高甲醇的利用效率还可以避免甲醇浓度过高而造成的毒害作用。然而在毕赤酵母发酵过程中，用溶氧来控制甲醇的流加并不是一种有效的方法，实验表明，当甲醇的浓度达到抑制菌体生长时，DO上升，从而形成一种假象，这时甲醇的流加速率会随着DO的上升而逐渐增大，因此甲醇的浓度也会增大，这样会严重的抑制菌体生长，造成中毒现象^[23]。

(3)指数流加方式控制甲醇的流加。指数流加方式是指通过物料守恒方程来调整补料的流加速率，用来维持一定的比生长速率。此方法不需要任何参数，只需要简单的细胞生长模型，蛋白质的生产直接或间接与细胞的生长相关联，所以维持一定的比生长速率有利于强化过程并且能够促进对生长偶联型外源蛋白生产的系统研究。指数流加控制属于开环控制，其操作过程是非线性的，主要通过渐进拟合的方式进行操作 ^[45]，所以其过程中很难实现稳定性和鲁棒性，开始诱导时如果条件发生改变可能会导致甲醇的积累，所以最初的比生长速率设定值低于最大比生长速率，这也降低了生产能力^[46]。

(4)恒定甲醇浓度流加。恒定甲醇浓度补料流加是通过在线甲醇检测装置来控制的，在诱导过程中实时对发酵液中甲醇的浓度进行监测，反馈给外部关联装置而控制甲醇的流加速率，从而维持发酵液中甲醇的浓度恒定。现在市场上销售的甲醇电极就是检测装置之一，但由于其数据漂移及响应滞后的缺点，并未被广泛使用^[47]。

(5)碳源混合流加。在毕赤酵母的发酵过程中，甲醇不仅是诱导剂还充当了碳源，大部分甲醇用来维系细胞的正常生长，却无法实现外源蛋白的高效表达，如果加入另外一种碳源，不仅可以减轻甲醇的负荷，还可以减少底物的消耗，避免高耗氧、高产热的现象。因此，目前许多研究者多采用双碳源交替流加的方式来刺激外源蛋白的高效表达，利用混合碳源诱导既能够提高供应给细胞的能量又可以加快毕赤酵母细胞的生长速率^[48]。近年来的研究表明，在毕赤酵母高密度发酵时，多采用山梨醇和甲醇混合流加的策略，由于山梨醇对AOX转录的抑制作用比较弱，并且还能够减缓目的蛋白的胞外降解及降低毒副产物的积累^[49]。山梨醇和甲醇混合流加的策略不但可以增加细胞密度、缩短诱导时间，还能够提高外源蛋白的表达量，山梨醇目前已经逐渐成为毕赤酵母发酵过程中常用的辅助碳源。Zhu等^[50]在高密度发酵β-甘露聚糖酶时采用山梨醇和甲醇混合流加的策略进行诱导，实现的β-甘露聚糖酶最高产量为6 336U/ml。

毕赤酵母表达系统已经发展成为目前较为完善的外源基因表达系统，利用其便于进行高密度培养、表达产量高且产品易于纯化的优点，已有上千种外源蛋白获得了成功的表达。尽管毕赤酵母高密度发酵被认为是极具发展前景的，但同样具有局限性。笔者课题组在研究毕赤酵母工程菌高密度发酵过程中发现，在毕赤酵母诱导表达阶段，有效控制甲醇浓度是至关重要的，仅通过OD来判断甲醇浓度是不可靠的，开发有效快捷的检测甲醇浓度方法是毕赤酵母高密度发酵的难点问题。除此之外，因为发酵时间较长，外源蛋白在培养基中会被自身分泌的蛋白酶所降解，虽然目前已有方法降低其降解，还需寻求更完善的方法来解决其降解问题。

随着现代分析技术的进步，毕赤酵母表达系统在合成生物学、分泌工程、生物制药、发酵工程等方面势必扮演着越来越重要的角色，随着毕赤酵母表达机制和发酵过程研究的进一步深入，该系统表达外源蛋白的能力将会显著提高，从而有利于推动大规模发酵生产各种生物制剂、酶制剂等，这将会是很长时间内科研人员研究的热点。