生物碱是一类重要的天然有机化合物，其广泛的生物活性和药用价值引起了人们的浓厚兴趣。杜冷丁、阿托品等药物大家早已耳熟能详，紫杉醇在抗肿瘤治疗中也应用了多年。甾体生物碱是天然甾体的含氮衍生物，是许多药用植物的主要活性成分，根据甾体的骨架分为孕甾烷(C₂₁)生物碱、环孕甾烷(C₂₁)生物碱和胆甾烷(C₂₇)生物碱三大类。其中胆甾烷生物碱又可分为异胆甾烷类生物碱和胆甾烷类生物碱，前者主要存在于百合科藜芦属和贝母属植物中；后者主要分布于茄科茄属植物中，在百合科植物中也较为常见。甾体生物碱分布不是很广泛，但是结构类型比较多，在药用植物中多数以苷的形式存在。初步统计，至今人们仅从贝母属植物中分离出130多种甾体生物碱及其苷^[1]。目前，已经发现的甾体类生物碱的药理作用主要有降压、止咳平喘、抗肿瘤、抗菌消炎和抗血栓等^[2]。

正是由于甾体生物碱广泛的生理活性，人们对其的研究才越来越深入。研究甾体生物碱生物合成途径的具体步骤和反应机制，以及相关基因的克隆、调控和表达研究等，可为利用植物基因工程、细胞工程工业化生产该重要活性成分奠定部分基础。

Oh等^[3]从平贝母中分离纯化得到去氢贝母碱、贝母碱和贝母辛碱，研究发现这三种生物碱具有抑制血管紧张素转换酶的活性，是决定平贝母鳞茎降压作用的主要成分。藜芦属的瑟文型生物碱大多具有降压活性，如藜芦胺等^[4]。An等^[5]报道蒲圻贝母中puqienine E、puqienine B和puqienine A三种甾体生物碱能够抑制血管紧张素转换酶的活性，降低血压。

Wang等^[6]从浙贝母中分离出西贝素、西贝素-β-N-氧化物、异贝母碱和异贝母碱-β-N-氧化物4种甾体类生物碱，采用小鼠氨水引咳法和小鼠气管酚红排出量分别测定了这4种生物碱的镇咳作用和祛痰作用，结果表明这四种生物碱能够显著抑制咳嗽的频率，增加咳嗽的潜伏期。张勇慧等^[7]采用小鼠氨水引咳法和小鼠气管酚红排出量测定了湖北贝母中鄂贝甲素、湖北甲素苷、鄂贝新等7种单体生物碱的平喘和祛痰作用，结果显示鄂贝甲素和湖北甲素苷的镇咳作用最强，鄂贝甲素和鄂贝新具有显著地祛痰活性。

抗肿瘤作用是该类生物碱最引人注目的生物活性之一。Tang等^[8]对兴安藜芦中环杷明、藜芦等10种甾体生物碱进行了抗肿瘤活性研究，结果表明环杷明、藜芦和胚芽碱在NIH/3T3细胞中能显著地抑制Hedgehog通路；环杷明能较强地抑制小鼠PANC-1肿瘤细胞的生长，在5.0mg/kg、15.0mg/kg和50.0mg/kg剂量条件下，抑制率分别为40.64%、44.37%和46.77%。从藜芦属植物内分离得到的环巴胺^[9]、茄属植物中的澳洲茄胺^[10]，在抗肿瘤方面也表现出了良好的活性。Wang等^[11]研究了川贝母生物碱体内外抗增殖活性，并采用免疫组织化学染色法研究了川贝母生物碱的抗肿瘤作用机制，结果发现川贝母生物碱具有显著的抑制肿瘤血管生成作用，并且在体内表现出低毒活性，这是由于川贝母能提高半胱氨酸蛋白酶-3的表达水平，从而诱导细胞凋亡。

从百合科藜芦属植物大理藜芦中分离得到的新甾体生物碱neoverataline A、neoverataline B具有较强的抗真菌活性，对植物病原菌大豆疫霉有抑制作用^[12]。Kumar等^[13]研究发现甾体生物碱澳洲茄胺对金黄色葡萄球菌具有显著的抑制活性，高于阳性对照链霉素，而对枯草杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌的抑制活性较弱。Wang等^[14]从川贝母中分离得到西贝母碱、川贝酮、贝母碱和去氢贝母碱4种甾体类生物碱，研究发现西贝母碱和川贝酮能显著抑制耳部水肿的发展。

Song等^[15]研究发现，百合科植物藜芦中总甾体生物碱能降低截尾大鼠出血时间，在动脉和静脉血栓形成过程中具有抗血栓形成作用。吕莉等^[16]给家兔静脉注射乌苏里藜芦生物碱单体计米丁后，测定给予计米丁后20min、60min、120min 家兔全血和血浆黏度及5min血小板最大聚集率、复钙时间和凝血酶时间，结果发现计米丁能显著降低血黏度并抑制血小板聚集，由此表明该生物碱单体具有很好的抗凝活性。

目前，植物萜类生物合成途径及该途径中的关键酶是国内外研究的一大热点，研究报道较多，其生物合成途径已趋于完善。然而，药用植物甾体类生物碱的生物合成途径及合成途径中关键酶的研究报道较少，生物合成途径不够完善。异戊烯焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate，IPP)是植物萜类生物合成途径中一个重要的中间产物，在一系列酶的作用下生成萜类物质，同时还可以生成甾体类物质，这些甾体类物质经过一系列其他反应可生成甾体类生物碱。异戊烯焦磷酸是甲羟戊酸(mevalonate pathway，MVA)途径和2-C甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸(2-methyl-D-erythritol-4-phosphate，MEP)途径的共同中间体，也是交汇处，两条途径产生的异戊烯焦磷酸可以穿过质体膜互为对方所用^[17]。Sun等^[18]通过表达序列标签(EST)技术推测出甲羟戊酸途径可能参与甾体类生物碱的生物合成。作者根据萜类物质生物合成途径的启发及文献报道，推测总结了一些与甾体生物碱生物合成相关的途径。

MVA途径是存在于所有高等真核生物及一些细菌中的次生代谢途径(图 1)。在该途径中，首先由3分子的乙酰辅酶A(acetyl-coenzyme A，CoA)在乙酰辅酶A酰基转移酶(acetyl-coenzyme A acetyltrans-ferase，AACT)作用下形成乙酰乙酰辅酶A，而后在3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase，HMGS)作用下形成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)，在NADPH为供氢体条件下，3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase，HMGR)可作用于HMG-CoA不可逆地形成具有6个碳原子的中间体MVA；在ATP和二价金属离子的参与下，甲羟戊酸激酶(mevalonate kinase，MK)和磷酸甲羟戊酸激酶(phosphate mevalonate kinase，PMK)可将MVA磷酸化，形成焦磷酸甲羟戊酸(pyrophosphate mevalonate，MVAPP)；MVAPP在焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶(pyrophosphate mevalonate decarboxylase，MDC)的作用下，生成IPP，IPP在其他一系列相关酶的作用下，形成甾体类生物碱^{[19, 20]}。

图 1 MVA途径 Fig. 1 Mevalonate pathway

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MEP途径是植物体内另一条IPP合成途径，该途径不依赖MVA途径(图 2)。首先，在5-磷酸脱氧木酮糖合成酶(1-deoxy-D-xylulose 5-phosephate synthase，DXS)的催化作用下，3-磷酸甘油醛和丙酮酸缩合生成1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸(1-deoxy-D-xylulose 5-phosephate，DXP)。在1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(1-deoxy-D-xylulose 5-phosephate reductoisomerase，DXR)的作用下，DXP发生分子内重排和还原反应，生成MEP。随后MEP途径依次由2-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸胞苷酰转移酶(4-diphosphocytidyl-2C-methyl-D-erythritol-4-phosphate synthase，CMS)、4-5′-焦磷酸胞苷-2-C-甲基-赤藓醇激酶(4-diphosphocytidyl-2C-methyl-D- erythritol kinase，CMK)、2-C-甲基-赤藓醇-2，4-环焦磷酸合成酶(2C-methyl-D- erythritol 2，4-diphosphate synthase，MCS)、1-羟基-2-甲基-2-丁烯-4-焦磷酸合成酶(1-hydroxy-2-methyl-2-butenyl-4-diphosphate synthase，HDS)共同催化MEP生成1-羟基-2-甲基-2-丁烯-4-焦磷酸(1-hydroxy-2-methyl-2-butenyl-4-diphosphate，HMBPP)，HMBPP在1-羟基-2-甲基-2-丁烯-4-焦磷酸还原酶(1-hydroxy-2-methyl-2-butenyl-4-diphosphate reductase，HDR)催化下生成IPP和二甲烯丙基焦磷酸(dimethylallylpyrophosphate，DMAPP)^[21]。在IPP异构酶(isopentenyl pyrophosphate isomerase，IDI)的作用下，IPP和DMAPP之间可以互相转换；最后与上述途径一样，IPP在其他一系列相关酶的作用下，形成甾体类生物碱。

图 2 MEP途径 Fig. 2 2-methyl-D-erythritol-4-phosphate pathway

图选项

甾体生物碱生物合成途径中的关键酶决定了下游产物合成与积累的量，这些酶一般位于途径的分支点或产物合成的下游，催化甾体生物碱合成前体和各种中间体的形成。通过调控这些关键酶的表达活性，可以提高植物中相关甾体生物碱的产量。

在MVA合成途径中，HMG-CoA被3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶(HMGR)催化转化成甲羟戊酸，该反应是不可逆过程，因此，HMGR被认为是该途径的第一限速酶^[22]。HMGR主要定位于内质网上，是一种疏水性蛋白质，HMGR结构由4个部分组成，包括N端、跨膜区、连接区和C端区，其中C端区和跨膜区具有催化活性，并且在各种植物中高度保守，所有植物HMGR的催化区有4个保守的基元，跨膜区由2个疏水基和1个亲水基组成，亲水基位于两疏水基之间，每个疏水区大约有20个氨基酸^{[23, 24]}。

近年来，不断有新的HMGR基因从各种药用植物中被成功的克隆出来，通过生物信息学分析发现，不同药用植物HMGR的分子质量、理论等电点、酸性氨基酸和碱性氨基酸的比例、极性氨基酸的比例、疏水性氨基酸的比例基本一致，其氨基酸序列也具有很高的相似性^[25]。郑竹君等^[26]克隆出南京椴HMGR基因，并对其进行生物信息学分析，结果表明，南京椴HMGR的全长基因TmiHMGR长度为2 160bp，包含一个1 758bp的开放阅读框，该基因编码585个氨基酸残基，相对分子质量为62.9kDa，等电点为6.11。张琳等^[27]利用RT-PCR和RACE技术首次从药用植物铁皮石斛中成功克隆出HMGR基因，结果发现DoHMGR1基因cDNA全长为2 071bp，编码一条由562个氨基酸组成的多肽，分子质量为59.73kDa，等电点为6.18，DoHMGR1蛋白包含HMGR蛋白家族的4个保守结构域(63～561、147～551、268～383、124～541)和两个跨膜基序(42～64、85～107)，DoHMGR1基因与多种植物的HMGR基因相似性很高(67%～89%)。蒋春等^[28]从尾巨桉中克隆出HMGR基因，基因全长为1 995bp，包含1 560bp的开放阅读框，编码519个氨基酸。

HMGR通常由多条基因共同参与编码，其基因家族成员的差异表达，对MVA代谢/碳流的调控起重要作用。HMGR的生成除了受它底物的正向调节和终端产物的反馈调节外，还受各种激素、转录水平、mRNA稳定性、翻译和共价修饰调节等的调节^[29]。武莹等^[30]研究发现，雷公藤叶悬浮细胞经50mg/L壳聚糖诱导12h，HMGR基因表达量最高，且在该诱导条件下细胞中的内酯醇、吉碱和次碱的含量也有不同程度的提高，表明通过诱导雷公藤MVA途径中HMGR基因的表达，可促进雷公藤萜类物质的合成。朱芬^[31]采用不同浓度的茉莉酸甲酯处理灵芝菌丝，研究发现，除了10μmol/L的茉莉酸甲酯外，用其他浓度诱导时HMGR基因的表达量均有增加，且茉莉酸甲酯对菌丝诱导时间越长，菌丝三萜含量越高。

5-磷酸脱氧木酮糖合成酶(DXS)催化MEP途径的第一步反应，在DXS催化作用下，3-磷酸甘油醛和丙酮酸缩合生成1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸(DXP)，是MEP途径的第一个限速酶。金蓉等^[32]对DXS在MEP途径中的作用、DXS结构、亚细胞定位和酶活性、编码基因分离与表达特性及突变体等方面进行了较全面的阐述。

编码DXS的基因为一个多基因家族，Kim等^[33]在水稻中发现有3个DXS基因(dxs1、dxs2和dxs3)共同表达。Gong等^[34]从银杏中成功克隆出DXS基因，其含有2 154bp的开放阅读框，此酶的氨基酸序列与其他植物DXS有很高的同源性，有一个保守的转运肽、一个TPP结合位点和一个转酮醇酶模块。魏麟等^[35]从鱼腥草中成功地克隆出1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶1(DXS1)基因，其基因长为2 172bp，编码723个氨基酸，生物信息学预测DXS1蛋白不含跨膜区，不含信号肽，具有定位肽。

李尊强^[36]研究发现，DXS基因沉默表达的烟草植株在苗期出现叶色变浅、变黄，与对照植株相比DXS基因沉默表达的烟草植株叶片内总叶绿素含量减少了43.5%、类胡萝卜素含量减少了40.2%，证明DXS基因在MEP途径中对香气前体物质的形成具有重要作用。张曼^[37]研究发现，过量表达大豆GmDXS1基因，可显著提高烟草转基因植株中叶绿素、类胡萝卜素和赤霉素的含量，但降低了脱落酸的含量。

1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR)催化MEP途径的第二步反应，在DXR的催化作用下，1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸(DXP)发生分子内重排和还原反应，生成2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸(MEP)，是MEP途径上的重要限速酶，该步反应是DXP生物合成途径“碳流”的分支点，也是进行调控的有效靶点^[38]。李嵘和王喆之^[39]采用生物信息学的方法对已在GenBank上注册的拟南芥、玉米、水稻、亚麻等植物的萜类合成酶DXP的核酸及氨基酸序列进行了分析，结果表明该类酶基因的全长包括5′非翻译区、3′非翻译区和一个开放阅读框，无跨膜结构域，是一个具转运肽的亲水性蛋白质，包括两个功能DXR结合模块及两个功能NADPH结合模块，α螺旋和不规则卷曲是蛋白质二级结构最大量的结构元件，β转角和β折叠散布于整个蛋白质中，蛋白质的功能域在空间结构上折叠成“V”形，“V”形的两臂由N端与C端构成，“V”形的底部是N端臂与C端臂的结合域。不同植物DXR的相对分子质量、理论等电点、酸性氨基酸和碱性氨基酸的比例、总氨基酸带电荷的比例、极性氨基酸的比例、疏水性氨基酸的比例基本一致^[40]。

近年来，DXR基因不断被克隆出来，张玲等^[41]采用RT-PCR结合RACE法和qRT-PCR方法对枇杷DXR基因进行了克隆，结果显示，枇杷DXR基因的cDNA序列全长为1 743bp，编码473个氨基酸，蛋白质分子质量为51 299.8Da，等电点为6.52(GenBank登录号JX089590)。祝传书等^[42]利用RT-PCR和RACE技术从雷公藤中克隆出1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原酶基因(TwDXR)，结果表明，TwDXR基因全长1 674bp，其中包含1 410bp的开放阅读框，编码469个氨基酸。雒军等^[43]克隆出当归DXR编码基因部分保守区序列，结果得到一段564bp的DXR基因序列，该片段编码187个氨基酸，与GenBank中注册的海岛棉等6个物种的DXR核苷酸序列同源性和氨基酸序列同源性均在80%以上。

王润发^[44]利用pTrc-AtIPI载体构建了dzDXR大肠杆菌表达载体pTrc-dzDXR，并将其与pAC-BETA质粒共转化大肠杆菌，结果发现，含pTrc-dzDXR与pAC-BETA双质粒的菌落的颜色比含pAC-BETA和pTrc双质粒的菌落的颜色要深，为橘黄色，表明dzDXR基因的表达加强了大肠杆菌MEP途径，促进了胡萝卜素的合成与积累。

药用植物中的甾体生物碱因其广泛的生物活性，被广泛应用于工业、医药等领域，因此该类生物碱的相关研究成为天然产物的热点领域。目前，国内外对甾体生物碱的研究主要集中在有效成分含量的测定、提取分离方法研究、生理活性的评价上，对甾体生物碱的生物合成途径及合成途径中起关键作用的酶的研究报道较少，合成途径的基本框架还不明确，合成途径中缺乏足够的中间体的证实，关键酶基因的鉴定多见于几种少数植物，分离的基因数目较少，某些关键酶的作用还存在争议，等等。

未来的研究方向应该是进一步补充和完善甾体生物碱生物合成途径及其网络，加强合成途径中的关键酶及其基因的分离、克隆和表达特征分析，通过基因工程技术实现目的化合物的工业化高效生产，为甾体生物碱的开发和利用提供更加诱人的前景。