自1977年Abuchowski等^[1]首先应用聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)修饰药物蛋白以来，PEG修饰技术发展迅速，到目前为止已有十余种PEG修饰的蛋白质药物得到FDA的批准上市(表 1)。尽管PEG修饰增加了蛋白质的水溶性，减少肾脏对蛋白质的清除，保护蛋白质免遭酶解，优化了蛋白质的药物代谢动力学和药效学性质^[2]，但与未修饰的蛋白质相比，PEG化蛋白质具有更为复杂的结构和质量属性，再加上蛋白质来源不同且生产过程各异，给质量控制工作的开展带来极大困难。

质量控制是保障药品安全有效的手段，稍有疏忽就会带来严重的后果，Affymax与武田制药联合研制的PEG化药物peginesatide(商品名Omontys)，用于治疗成人患者因慢性肾脏疾病(CKD)接受透析产生的贫血，因质量控制中免疫原性研究的缺陷在上市后造成0.02%致死性反应，不到一年即被厂家召回^①。因此，不论是从药品研发角度还是保障用药安全角度，PEG化蛋白质药物的质量控制对企业来说至关重要。但由于被修饰蛋白质自身结构和性质的不同，质量属性间差异较大，要统一控制所有PEG化产品的重要质量属性并不现实，因此本文主要综合国内外近年来的有关文献，针对PEG化重组蛋白药物共性的质控难点和相应检测方法进行综述，以期对PEG化重组蛋白药物工艺开发和实际生产工作有所帮助。

①新闻资讯：武田制药与Affymax主动召回OMONTYS^®.中国食品药品监管,2013,5:5.

尽管PEG化重组蛋白药物大多是在比较成熟的重组蛋白上进行的二次开发，但由于PEG的多分散性和异质性，以及特殊的修饰工艺，使得修饰后的重组蛋白在结构、理化性质和生物学活性等方面均与未修饰的重组蛋白有较大差异，对修饰质量控制提出了更高的要求。修饰后蛋白质的质量控制无法简单地照搬未修饰蛋白质的质量标准，必须结合品种自身独特的结构、理化性质及生物学特性，开发适用的质控方法和标准。除了关注分子质量、纯度、生物活性等与未修饰重组蛋白药物相似的质量属性外，世界卫生组织(WHO)明确提出需要重点关注与PEG有关的质控项目，如修饰率、修饰位点、游离PEG含量等^[3]。下面就按照不同的质控项目对PEG化重组蛋白药物的质控难点及方法进行分类介绍。

PEG修饰率是指修饰后每个蛋白质分子上偶联的PEG数目与可偶联PEG数目最大值的比值，常用来衡量PEG化蛋白质的PEG修饰程度。除了受修饰位点的限制外，每个蛋白质所连接的PEG数量还会受到反应温度、pH、时间、投料比等多因素的影响，而且PEG修饰率不同，同样会影响修饰后蛋白质的生物活性及产品的均一性，对终产品的质量产生影响，修饰率是衡量修饰工艺稳定性的一个重要参数。目前已有多种修饰率的测定方法，有通过测定与PEG偶联基团数目的改变从而计算PEG化修饰率的光度法，如测定自由氨基数目改变的三硝基苯磺酸(TNBS)法及测定游离巯基数目变化的二硫代二硝基磺酸(DTNB)法，还有通过应用质谱、高效液相色谱(HPLC)等不同技术测定修饰后分子质量或含量的间接推断修饰率的方法^[4]。

间接测定PEG修饰率的方法包括TNBS法、荧光胺法及DTNB法，属普通的化学与荧光发光法，在对修饰前后的蛋白质准确定量的基础上推断出修饰后蛋白质偶联PEG的准确含量。虽然光度法的干扰因素较多，但其操作相对简单且方法较为成熟，是PEG化蛋白质药物修饰程度测定时最常用的方法^[5]。

TNBS与蛋白质表面的赖氨酸ε-氨基发生反应，该反应生成的三硝基苯(TNP)衍生物在335nm有特征吸收，通过该反应可确定蛋白质的自由氨基数目，而PEG修饰将直接减少蛋白质表面的自由氨基，因此，可以通过TNBS反应间接计算蛋白质的PEG修饰程度，该方法简单易行，但精确性较差，容易受到溶液中未反应的PEG分子的干扰^[6]。Stocks等^[7]采用荧光胺代替TNBS来测定蛋白质的平均修饰度，荧光胺与蛋白质表面未偶联PEG的赖氨酸ε-氨基反应，反应产物有特定波长的荧光吸收，过量的游离荧光胺可以通过酸水解去除，通过测定蛋白质混合物的激发荧光值来计算其平均修饰度，该方法不受未反应的PEG分子的干扰。李晶等^[8]采用该方法测定3种不同结构的PEG-rhGH的修饰度，分别为8.8%、9.8%、9.5%，与10%的理论值接近，经方法学考察发现低浓度(0.01mg/ml)的PEG对结果无干扰。

与TNBS法相对应，蛋白质表面的自由巯基数目可通过巯基与DTNB的反应进行确定。巯基基团与5,5′-二硫代-双-硝基苯甲酸(DTNB)反应，形成黄色化合物，在412nm处有特征吸收，而PEG修饰将直接减少蛋白质表面的自由巯基数目，通过DTNB反应可间接计算蛋白质的PEG修饰程度。

根据PEG化前后分子质量的不同可以间接计算PEG化蛋白质的修饰率，该方法通常需要借助质谱技术来测定修饰前后蛋白质的分子质量。电喷雾离子化质谱技术(ESI-MS)和基质辅助激光解吸电离质谱技术(MALDI-MS)的应用最为广泛，但由于ESI电离的多离子性及PEG化蛋白质的异质性使得所得图谱异常复杂，难以解析，因此在对PEG化蛋白质修饰率分析时多采用基质辅助激光解吸附飞行时间质谱(MALDI-TOF)测定蛋白质的分子质量。用修饰前后分子质量之差除以PEG的分子质量，即可得到每一个蛋白质分子上偶联的PEG数目，但MALDI-TOF脉冲式的离子化方式的图谱解析所得信息有限，无法精确定量，对于发生多点修饰的蛋白质，只能用该方法计算PEG的结合数目，而无法准确计算平均修饰率。因此，常用该方法来佐证修饰率的准确性。

除此之外，HPLC也是测定PEG修饰率的常用技术，首先通过RP-HPLC将未修饰蛋白质、修饰后蛋白质和游离PEG进行有效分离，通过PEG含量变化或未修饰蛋白质含量变化间接算出PEG修饰率。PEG含量变化需要HPLC与蒸发光检测器联用，将PEG从修饰后的蛋白质上水解下来，计算水解后PEG含量的增值，可算出偶联到蛋白质上的PEG的摩尔数，再通过水解后未修饰蛋白质的增加量求得修饰后蛋白质的摩尔数，两者之比再除以每分子蛋白质的理论修饰位点，即可得到较为准确的PEG修饰率。但是，目前该类方法尚处于理论阶段，要建立该方法还需要投入大量工作^[9]。而通过未修饰蛋白含量变化计算PEG修饰率目前已有方法建立，梁凌宇等 ^[4]采用RP-HPLC对CN10和PEG-CN10进行分离并考察了PEG修饰前后CN10蛋白的量效关系，根据外标法检测CN10蛋白的含量，将PEG化修饰前后CN10蛋白含量的差值再除以修饰前CN10蛋白的含量，即可算出CN10蛋白的PEG化修饰率，从而建立了一种简便、快速检测CN10蛋白PEG化修饰率的方法。

对于PEG修饰后的重组蛋白药物来说，修饰位点的不同往往会给药物的理化及生物学等性质带来差异，因此对修饰后药物的修饰位点进行测定是全面认识和研究修饰后蛋白质结构的重要前提。但直接对修饰后蛋白质进行修饰位点检测通常得到的信号过于繁琐，解析困难，因此大多先采用适宜的方法将蛋白质降解后再通过对降解片段进行分析确定修饰位点。蛋白酶解法因其降解温和、识别位点特异，常与HPLC或氨基酸组成分析技术联用以分析PEG的修饰位点。除此之外，源内衰减及诱导碰撞解离等蛋白质裂解技术也可用于修饰位点的测定。

胰蛋白酶的特异性强，仅识别Lys和Arg两个位点，因此常用于蛋白质的降解，但受肽键周围氨基酸的种类、所在肽段构象及环境中空间位阻的影响，胰蛋白酶对各酶切位点的敏感性并不完全相同，因此所得各肽段的相对含量会存在一定差异，可采用HPLC、MS或氨基酸分析等技术单独或联合对降解后的肽段进行分析^[10]。Monkarsh等^[11]利用离子交换色谱法对酶切后的肽段混合物进行分离，得到目的肽段后通过氨基酸分析技术测得多肽序列信息，但氨基酸分析测定修饰位点不能测定N端的修饰位点，且对与蛋白质偶联多肽的纯度要求较高。Yu等^[12]采用胰蛋白酶将rhIFN-ω及其PEG修饰产物IFN-ald-P20K在相同条件下进行酶解，将所得肽段混合物进行HPLC-MS分析，选择不会被修饰的肽段T11(75~123)作为内标物，比较修饰前后蛋白酶酶解产物中肽段的含量变化，发现IFN-ald-P20K酶解后T1(1~14,LGCDLPQNHGLLSR)段缺失，因Arg¹⁴无法被修饰，由此推断出PEG化位点为rhIFN-ω的N端(Leu¹)。基于蛋白酶酶解法测定PEG修饰位点的方法操作简便，样品预处理步骤少，不但可测定N端修饰位点，还可测定结构复杂的多修饰重组蛋白的修饰位点。

蛋白酶酶解法测定修饰位点简化了分析过程但也有一定的局限性，PEG的偶联使蛋白酶酶解难度增加，对含多修饰位点的生物大分子的测定，HPLC-MS分析过程中多肽的分离度也会影响多肽的离子化效率进而影响测定结果，同时由于稀有氨基酸在生物技术上的应用，使得酶解测定修饰位点的方法受到限制。随着检测技术的发展，研究者们陆续建立了一系列以串联质谱(MS/MS)为基础的修饰位点分析方法。串联质谱可以直接在完整蛋白质的基础上进行修饰位点分析，Lu等^[13]学者用5kDa PEG对胰高血糖素(glucagon)进行修饰，将修饰后的glucagon直接经源内裂解(in-source fragmentation，ISF)使PEG部分裂解变短，选定最强的同位素离子峰作为母离子，用碰撞诱导解离串联质谱(CID MS/MS)分析其产生的b、y离子碎片，结果发现所有含Lys¹²的y离子片段均发生了m/z的偏移，在完整蛋白质的基础上成功确定了PEG的偶联位点。除此之外，串联质谱同样可用于含非天然氨基酸蛋白质的修饰位点的测定，Yoo等^[14]用mPEG 20kDa对预设计的含瓜氨酸、高精氨酸等非天然氨基酸的合成多肽进行了修饰，采用反射式源内衰减-基质辅助激光解吸附串联质谱(reISD-MALDI MS)对完整蛋白质进行自上而下(top-down)的分析，PEG链会导致多肽断裂过程在偶联位点终止，通过解析PEG化多肽碎片确定了PEG的修饰位点。串联质谱法测定修饰位点具有样品制备过程简单、样品损耗小、灵敏度高、反应过程迅速等优点，可适用于结构复杂、多修饰及含非天然氨基酸的生物大分子的PEG修饰研究。

PEG化产品中会有游离PEG残留，这些残留PEG的来源有投料过量的PEG和修饰后蛋白质脱落的PEG，后者可以反映修饰蛋白质的稳定性，因此是质量控制的重要项目。

常用的PEG分析法，如电位法、比色法、光干涉法和碘沉淀法等均会受到与蛋白质共价结合的PEG干扰，测定结果误差很大^[15]。更准确的是HPLC和蒸发光散射检测器联用的方法，检测修饰后蛋白质药物中残留的游离PEG。PEG本身没有紫外吸收物质，不能用普通紫外检测器检测，蒸发光散射检测器是通用型质量检测器，弥补了紫外检测器不能检测没有紫外吸收物质的缺陷，因此在经过RP-HPLC分离后，要使用蒸发光检测器检测残留的PEG^[16]。苑方圆等^[17]采用反相高效液相色谱-蒸发光散射检测器(ELSD) 联用对PEG化尿酸氧化酶中游离的PEG进行含量测定，新方法测定PEG的灵敏度可达到0.2μg，可用于PEG的精确定量分析。此外，PEG能够与碘和氯化钡发生特异性原位显色反应。先通过SDS-PAGE分离蛋白质和游离PEG，再用碘染色法进行游离PEG的分析，该方法的灵敏度达到0.1μg，但由于无法准确定量，只用于游离PEG含量的限度检查^[18]。

PEG化重组蛋白药物由于原料的复杂性和修饰工艺的特殊性，修饰后产物不仅有目的蛋白，还有残余的原型蛋白及多修饰PEG组分等物质，会对产品质量产生干扰，是监测的重点。

目前常用来检测蛋白质纯度的方法有非还原SDS-PAGE法和HPLC法，这两种方法操作简便、灵敏度和分辨率高，应用十分广泛，PEG修饰后蛋白质的纯度检测也多采用这两种方法。在用非还原型SDS-PAGE法测定PEG化重组蛋白纯度时，考马斯亮蓝染色和银染的染色效果不佳，影响纯度的判断，可使用锌-咪唑盐染色^[19]或PEG碘染色法^[20]改进染色效果，再进行灰度分析计算蛋白质纯度。在用HPLC法测定PEG修饰后蛋白纯度时，应尽量采用与SDS-PAGE法原理不同的反相柱或其他离子交换柱进行分析，以便从不同角度证明蛋白质的均一性。除了上述常用的方法外，成像毛细管等电聚焦(iCE)的方法只根据各组分所带电荷数量不同对各组分进行分离，该方法可避免PEG蛋白在电泳凝胶介质或色谱介质迁移速率慢等不利因素，同时又具有简便、快速、灵敏度和分辨率高等优点。已有学者提出iCE在分离PEG蛋白方面较其他方法具有优势，但研究尚处于初步阶段^[21]。

由于PEG是具有一定分子质量分布的高聚物，修饰后的蛋白质也具有聚合物的性质，不再有单一分子质量，增加了测定难度。还原型SDS-PAGE法测定修饰后蛋白质分子质量，修饰后蛋白水力学半径的增加及PEG长链之间的相互缠结，使电泳行为异常、迁移率降低，电泳得到的表观分子质量往往大于其真实分子质量。Zheng等^[22]发现对PEG-HSA采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(native PAGE)进行检测，修饰后蛋白的电泳行为较在SDS-PAGE中得到较大改善，可提高分子质量测定的准确性。除此之外，对PEG链的阻碍引起的蛋白质染色效果不佳，研究人员也进行了新的探索，使用PEG碘染色法^[23]或复染法^[24]等可以有效地改善染色效果。

质谱法是目前测定蛋白质分子质量最先进的方法^[25]。其中MALDI-MS抗杂质干扰强，可降低样品预处理的难度，并且PEG化蛋白质经MALDI方式离子化后所得单电荷离子居多，质谱图易解析，因此是目前准确测定修饰后蛋白质分子质量的主流工具，但面对高分子质量的PEG化蛋白质，分辨率限制了所得数据的准确性。而ESI-MS可以产生高电荷的离子，使质荷比(m/z) 降低到多数质量分析仪器都可以检测的范围，因而有效扩展了分子质量的分析范围，但同时多电荷的质谱峰群图谱复杂，使结果分析较困难。美国Indiana大学的Huang等^[26]学者通过在色谱分析柱后加胺，适当减少样品ESI离子化后的荷电数从而简化其ESI-MS图谱，使图谱得到了高效解析。

生物技术药物与化学药物不同，单独的物化方法不能完全反映其特性，生物学活性反映了重组药物有效成分的含量，是一项重要的质控指标。蛋白质分子的PEG修饰程度、修饰位点的不同都会对蛋白质构象和电荷产生影响，进而引起蛋白质生物学活性的改变。修饰后蛋白质活性一般会有所下降，PEG脱落反而会造成整体活性的上升，因此生物学活性检测可反映产品的稳定性^{[27, 28]}。

PEG化重组蛋白的生物活性检测方法通常与未修饰蛋白质一致，细胞实验因其操作方便、定量准确、变异度小、成本低得到广泛应用，但活性测定相关的标准品目前尚未统一。WHO生物制品标准化专家委员会发起全球23家实验室(多中心)对3个候选PEG-G-CSF标准品进行研究，从效力、相对效力及稳定性等多方面考虑，确定并建立了PEG-G-CSF的第一代国际标准品^[29]，对PEG化重组蛋白药物生物学活性的统一提供了有力支持。

国内有关PEG修饰蛋白的开发正处在高速发展期，目前PEG化重组人集落刺激因子、PEG化艾塞那肽、PEG化集成干扰素及PEG干扰素α2b等十余种PEG修饰重组蛋白药物均已进入临床研究阶段，其中PEG化重组集成干扰素变异体注射液、PEG化洛塞那肽注射液和PEG化胸腺素α1注射液已进入临床Ⅲ期临床试验登记与公示：国家食品药品监督管理总局药品审评中心.http://www.chinadrugtrials.org.cn/eap/clinicaltrials.searchlist.。因此，保障临床试验品质量的PEG修饰药物质量控制研究已越来越受到重视，针对PEG修饰药物质量属性的高度复杂性，国家“重大新药创制”等科技计划专门设立了“生物技术药物质量标准和质量控制技术平台”，开展此类生物大分子药物质量属性分析及评价方法研究，服务于“重大新药创制”计划支持的PEG修饰类蛋白创新品种的研发和成果转化，保证进入临床试验阶段的产品安全有效、质量可控。随着PEG化蛋白质药物质量控制研究的进一步深入，会有越来越多的长效药物成功上市。