作为典型的细菌超抗原，金葡菌肠毒素(Staphylococcal enterotoxins,SEs)只需极低浓度(pg-ng级)即可特异性地激活T淋巴细胞库中5%~20%的细胞，释放大量细胞因子，强化其所依赖的细胞介导的细胞毒作用(superantigen-dependent cell-mediated cytotoxicity,SDCC)，促使机体产生较强的免疫应答^{[1, 2]}。因此，针对SEs的超抗原特性，国外已广泛开展SEs用于癌症治疗的临床前研究，而国内沈阳协合集团开发的以金葡菌肠毒素C2(SEC2)为主要成分的抗肿瘤产品“高聚生”，经各类癌症患者的临床应用证实效果显著，并且与放疗或化疗联合使用时效果更佳^{[3, 4, 5, 6]}。然而SEs自身所存在的肠毒性，在大剂量使用时能够诱发机体出现催吐、腹泻和发热等毒副作用，在一定程度上限制了 SEs作为抗肿瘤生物制剂在临床上的应用^{[7, 8]}。

近年来，随着对 SEs 生物学活性研究的深入，发现致呕吐毒性不是所有金葡菌超抗原所必须的。因此 2004 年国际命名委员会(International Nomenclature Committee)将 SEs 中缺乏致呕吐毒性或者致呕吐毒性还未验证的命名为金葡菌类肠毒素 (staphylococcal enterotoxin-like,SEl)，而已确认的无致呕吐毒性的成员包括SElH、 SElK、 SElL 和 SElQ^[9]。本研究首先构建SElK原核表达载体，Ni⁺亲和层析获得重组SElK蛋白纯品；进一步检测其刺激小鼠脾淋巴细胞增殖活性，并分析体内注射后对小鼠血常规及主要脏器关键酶活性的影响，为将SElK开发为新型抗肿瘤生物制剂提供理论支持。

携带SElK基因的金葡菌及pET-28a质粒(图1a)由本组保藏；E. coli BL(DE3)感受态细胞购自宝生物工程(大连)有限公司；6~8周SPF级BABL/c 雌性小鼠，体重(24±2)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司(许可证号SCXK(京)2012-0001)。

MTT(四甲基偶氮唑盐)、IPTG(异丙基硫代-β-D半乳糖苷)购自Sigma公司；ConA(伴刀豆蛋白蛋白A)购自北京索莱宝科技有限公司；Pyrobest DNA聚和酶、限制性核酸内切酶及T4 DNA连接酶购自宝生物工程(大连)有限公司；细菌基因组提取试剂盒、质粒提取纯化试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒及Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒(可溶性蛋白)购自北京康为世纪生物科技有限公司；RPMI1640培养基及FBS(胎牛血清)购自Hyclone公司；本研究所需引物合成及测序均由苏州金唯智生物科技有限公司完成。

以携带SElK基因的金葡菌基因组为模板(按细菌基因组提取试剂盒说明进行操作)，应用SElK特异性引物(图1b，下划线处分别为EcoRI和XhoI内切酶位点)扩增获得SElK基因全长片段。上述反应中获得的PCR片段纯化后经EcoRI和XhoI酶切后与经同样双酶切的表达空载体pET-28a进行连接，连接产物转化E. coli BL(DE3)感受态细胞。筛选获得的阳性克隆进行SElK基因的特异性PCR扩增和双酶切验证后测序。

随后将携带有构建成功的pET-28a-SElK质粒的BL21(DE3)单菌落接种于含卡那霉素(60μg/ml)的液体LB培养基中，过夜活化培养；以1%(V/V)接种量转接下一级，37℃摇床培养至OD₆₀₀为0.5，加入终浓度1.0mmol/L的IPTG，30℃诱导表达4h；经离心收集菌体超声破碎后按照Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒说明进行SElK的纯化，SDS-PAGE电泳鉴定蛋白大小及纯度，BCA蛋白定量试剂盒进行浓度测定。

无菌条件取小鼠脾脏，200目筛网研磨，收集研磨后细胞悬液，1 500 r/min离心5 min；收集细胞沉淀，加入5 ml红细胞裂解液，静置2min待样品透明后1 500 r/min离心5min；收集细胞沉淀，用含10% FBS的RPMI1640培养基洗细胞2次，最后用含10% FBS的RPMI1640培养基调整细胞浓度至1×10⁷个/ml。将稀释好的细胞悬液加至96孔板中，每孔100μl；将SElK用含10% FBS的RPMI1640培养基稀释后，加至96孔板中，每孔100μl，使蛋白终浓度分别达到0.05、0.1、1、5和10μg/ml，每个样品设5个复孔；以5μg/ml伴刀豆蛋白A(ConA)处理组为阳性对照组，10μg/ml牛血清白蛋白(BSA)处理组为阴性对照组，不添加任何蛋白的RPMI1640培养基作为空白对照，37℃，5% CO₂连续培养48 h。待培养结束后向各孔中加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml)，继续培养4 h后，离心、弃上清、收集细胞沉淀并用DMSO充分溶解后于酶标仪上测定各孔吸光值(检测波长570 nm，参比波长630 nm)，并按下式计算增殖指数(proliferation index，PI)：PI = 实验孔吸光值/阴性对照孔吸光值。

BABL/c小鼠随机分为对照组(n=5)及实验组(n=20)；将SElK稀释到250μg/ml，实验组小鼠尾静脉注射0.2ml后使每只小鼠注射超抗原的量达到50μg，对照组给予等量生理盐水；无菌环境下饲养。实验组小鼠于腹腔注射SElK后1d、3d、5d及7d(每个时间节点取小鼠5只)，采用摘眼球法收集血液约1ml于柠檬酸钠抗凝管中，立即送至新乡医学院第三方医学检验中心进行相关指标检测。其中小鼠血常规由西门子ADVIA2120全自动血细胞分析仪(德国)完成，血清中ALT、AST、CK及LDH活性通过速率法检测；血清中Urea和CR含量通过脱氢酶法和氧化酶法进行测定。

常规PCR获得SElK基因片段(约660bp)如图1c所示；转化后所得阳性克隆菌株首先进行菌落PCR，产物进行琼脂糖凝胶电泳，如图1d(1、2泳道)所示；随后将鉴定正确的阳性克隆菌株扩大培养后提取质粒，所提质粒进行EcoRI和XhoI双酶切，酶切鉴定结果如图1d(3、4泳道)所示。菌落PCR和双酶切结果均表明pET-28a-SElK载体构建正确，随后送往苏州金唯智生物科技有限公司测序进行最终确定。

图 1 SElK原核表达载体构建及验证 Fig. 1 The construction and identification of pET-28a-SElK (a) Map of the vector pET-28a(+) (b) The primers used in the amplification of the SElK gene (c) PCR products of SElK were analyzed by electrophoresis (d) The results of colony PCR (lane 1 and 2) and digestion of pET-28a-SElK by EcoR I and XhoI (lane 3 and 4)

图选项

将上述验证过的携带有pET-28a-SElK质粒的BL21(DE3)单菌落扩大培养后，IPTG低温诱导目的蛋白表达，分别于诱导0h和4h收集菌液经SDS-PAGE电泳鉴定蛋白大小(图2中的1、2泳道)，结果表明经IPTG诱导后，可高效表达(约2mg/ml)分子量大小约为29kDa的重组蛋白SElK。经进一步Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒纯化后获得较高纯度(>95%)的重组蛋白SElK(图2中的3泳道)。进一步通过检测刺激小鼠脾淋巴细胞的增殖能力来评价SElK的超抗原活性，结果如图3所示：SElK能够刺激小鼠脾淋巴细胞显著增殖(P < 0.05)，并且在0.05~5μg/ml剂量范围内呈剂量依赖性，且在5μg/ml的浓度下增殖活性达到峰值。

图 2 SElK的诱导表达与纯化 Fig. 2 The expression and purification of SElK The expression of SElK induced with 1 mmol/L IPTG at 30℃ for 4h; bacterial culture samples were taken from 0 and 4h throughout the inducible expression period and were analyzed by the SDS-PAGE (lane 1 and 2); purified SElK by Ni+-affinity chromatography (lane 3)

图选项

图 3 SElK体外刺激小鼠脾淋巴细胞增殖活性检测 Fig. 3 The proliferation index of splenic lymphocytes stimulated by SElK in vitro

图选项

通过尾静脉注射大剂量(50μg)SElK后，小鼠血液中白细胞的变化结果见表1：SElK注射3d后血液中淋巴细胞数量达到峰值，与对照组比较具有显著性差异(P <0.05)，随后淋巴细胞数量开始下降到正常水平；而血液中的中性粒细胞在5d时数量达到峰值，但与对照组无统计学差异；其余类别白细胞在SElK注射后的任一时间节点均与对照组无统计学差异。

尾静脉注射SElK后，通过检测不同时间节点与心脏、肝脏及肾脏相关的关键酶活性及活性物质的含量变化来评价SElK对机体关键脏器的影响。结果如表2所示：实验组动物血清中的AST活性及Urea含量在注射后1d显著升高，3d时达到峰值，与对照组相比具有极显著差异(P < 0.01)，随后开始下降并在注射后7d恢复到正常水平；此外，实验组动物血清中CR含量仅在注射后3d略高于对照组，但无统计学上差异；而血清中的ALT、LDH及CK活性在SElK注射后的任一时间节点均与对照组无统计学差异。

迄今，利用SEs超抗原活性将其开发为新型抗肿瘤生物制剂得到国内外广泛关注。前期大量研究表明，在典型SEs中SEA和SEB均具有较高体外抑瘤活性，并且在国内以SEC2为主要药效成分的新型抗肿瘤制剂“高聚生”已于1999年获国家卫生部和国家药监局批准生成，为国家二类生物制品用于肿瘤的辅助治疗。随后，中国科学院沈阳应用生态研究所微生物资源与生态课题组针对金葡菌超抗原SEC2展开系列高效低毒突变蛋白的构建，并已成功筛选出若干个具有潜在临床应用价值的SEC2高效低毒突变蛋白^{[3, 4, 5, 6]}。然而典型SEs由于体内毒性反应严重，限制了其作为新型抗肿瘤生物制剂的可行性。因此，SEls的发现与定义为开发新型超抗原类抗肿瘤生物制剂提供了更优选择，而目前已确认的无致呕吐毒性的SEls成员包括SElH、 SElK、 SElL 和 SElQ。

本研究之所以选择SElK为目的蛋白除其无致呕吐毒性的优势外，其晶体结构也已于2007年获得解析^[10]。结果表明SElK结合到MHC II的方式与SEA相似，除拥有一个基本的类SEB结合位点外，还拥有一个与锌离子相关、作用力更强的结合位点，其超抗原活性理论上要强于与SEB同亚族的SEC2。此外，有研究表明金葡菌注射液“高聚生”中除包含有SEC2外，也已从其生产菌株中克隆出了SElK和SElQ基因，暗示SElK可能也在抗肿瘤过程中发挥一定作用^[11]。

因此，本实验首先通过常规分子生物学技术成功构建SElK原核表达载体(图1a),诱导表达后通过Ni⁺亲和层析获得纯度大于95%的SElK重组蛋白(图2)；随后的实验表明SElK能够显著刺激小鼠脾淋巴细胞增殖(图3)；并且尾静脉注射后能够有效地刺激血液中淋巴细胞的增殖(表1)。为进一步评价SElK潜在的肠毒性，本实验通过检测与心脏、肝脏及肾脏相关的关键酶活性及活性物质的含量发现：SElK注射后能显著增加AST活性及Urea含量，但具有“一过性”，很快便下降至正常范围(表2)。该结果暗示SElK对机体肝脏及肾脏具有一定毒性，在临床研究中应考虑并重视其在抗肿瘤过程中对机体可能产生的副作用。

本研究成功制备出高纯度SElK，并对其生物学活性进行了初步分析。该结果不仅丰富了对SElK活性的认识，而且为进一步通过基因工程技术手段获得低毒高效的SElK突变蛋白奠定了坚实基础，为开发更优良的抗肿瘤制剂提供了备选药物。