固定化酶技术是20世纪60年代发展起来的一项生物工程技术。由于具有重复使用周期长，可以大大提高酶稳定性的特点，受到各个领域的青睐^{[1, 2]}。目前，该技术不仅在生物学、化学方面发展迅速，而且在环境、食品、医学等领域应用也较为广泛。在固定化酶技术中，载体材料上的活性基团、微环境、载体的形状等因素，可影响载体与酶的亲和力，固定化酶活力、稳定性、重复使用性及可回收性，已引起国内外学者的关注^[3]。同时，这类材料大多具有较大的比表面积、一定的孔径、较好的硬度和机械强度，以及容易进行表面改性或包覆的特点^[4]，可通过研究载体材料固定化酶前后的形貌、结构、元素组成及其比表面积和孔径的变化，进一步分析载体材料固定化酶的情况，因此，固定化酶载体的选择和表征手段对于酶的有效固定化有着非常重要的意义，应该得到足够的重视。虽然国内外关于固定化酶载体材料已有大量报道，但大都集中在载体材料研制、载体材料固定化酶条件优化和应用方面，而有关应用各种分析表征手段，分析载体固定化酶前后的特征、结构，推测载体和酶的结合方式，以及合适的改性或包覆方式使得各种载体材料表现出的优缺点方面的综述报道较少。本文综述了目前使用较多的固定化酶载体材料的优缺点、研究进展、应用情况及表征手段。

介孔材料具有有序、可调节的孔道结构、相对于微孔材料具有较大的比表面积、较大的孔容、较窄的孔径分布、良好的热稳定性、化学稳定性和无毒性等特性^[5]。目前用于固定化酶的以硅基介孔材料较多，如SBA-15^[6]、MCM-41^[7]、MCF^[6]及MSU^[8]等。虽然介孔材料用于固定化酶显著提高了酶的活性，但用于酶的固定化时会引起酶的泄漏、失活，酶分子容易从载体脱落，降低了固定化酶的活力和重复使用性^[9]。因此，使用过程需要对载体进行适当的改性，以增强酶与载体的亲和力。例如，各种功能化的硅烷改性介孔材料，引入—NH₂、—SH、—CN、—Cl、—C₆H₅及不同链长烷基等有机功能基团到介孔材料上^[10]，这些基团提供了大量反应位点，可以与酶通过共价键或次级键连接，提高了载体对酶的负载量和固定化酶的稳定性，同时部分有机基团进入介孔孔道，使得孔径和孔容减少，防止酶的泄漏^[11]。Yasmin和Müller^[12]应用丁基硅烷与辛基硅烷对MCM-41进行改性，发现长链烷基只能结合到介孔材料表面，而短链烷基可以结合到介孔材料内部。Li等^[13]应用3-氯丙基三乙氧基硅烷对SBA-15进行改性并用于固定化酶，由于功能化基团与酶分子之间较强的作用力，使得SBA-15-Cl在不同温度、不同pH条件下固定化酶的活力总是高于SBA-15固定化酶的活力，改性载体固定化酶也展示了优良的耐热、耐酸碱性的特点，同时，与SBA-15相比，改性载体SBA-15-Cl的孔径由7.05nm减少到4.71nm，酶分子不易从孔道中渗出，有效降低了酶分子脱附。Guan等^[14]通过硅烷改性合成氨丙基-乙烷双功能介孔有机二氧化硅，用于固定化β-葡萄糖苷酶，结果显示，固定化酶保留了游离酶活力的95.5%，经过20轮反应后，固定化酶仍有75%的活力，大大提高了酶的重复使用性，同时，相对于游离酶，其热稳定性也有所提高。

另外，一种新型的改性方式—离子液体改性介孔材料固定化酶^{[15, 16]}引起了研究者的关注，由于离子液体化学性质稳定、对环境无污染，可通过调节阴阳离子改变载体与酶的亲和力，被认为是“可调控的绿色”溶剂^[17]。Bian等^[18]应用室温离子液体对SBA-15进行改性并用于固定化木瓜蛋白酶，由于离子液体中阳离子与木瓜蛋白酶中阴离子之间的静电作用，使得改性的SBA-15固定化酶量远高于未改性的SBA-15。唐苏苏等^[19]采用不同链长烷基咪唑类离子液体改性SBA-15，并用于固定化脂肪酶，研究表明，随着烷基碳链的延长，固定化酶的泄漏率降低，热稳定性、重复使用性及储存稳定性明显提高。

此外，介孔材料都需要模板剂参与合成，如硅基介孔材料MCM-41以阳离子表面活性剂为模板合成，SBA-15以嵌段共聚物为模板合成，由于合成介孔材料所需要的模板剂价格昂贵，脱除模板剂需要经过高温焙烧，条件较为苛刻，使得模板剂难以回收，如果不经过焙烧，介孔材料的稳定性较差。因此，制备成本较低的模板剂或不用模板剂，用其他方式代替焙烧，简化改性步骤，降低固定化成本，制备出孔结构稳定、孔隙率和比表面积较高的介孔材料，等等，将成为该载体今后研究的方向。

纳米材料具有粒径小、比表面积大，表面结合能大，易于与酶稳定结合的特点，可以有效提高载酶量及酶的稳定性^[20]。用于固定化酶的纳米材料有碳纳米管^[21]、纳米多孔金^[22]等。

碳纳米管具有极好的化学稳定性、极高的机械强度、极大的韧性、良好的电导率、良好的生物相容性^[23]，已成为报道较多的纳米载体材料，包括单层碳纳米管和多层碳纳米管两类。目前，常用电弧放电法^[24]、化学气相沉积法^[25]、激光蒸发法^[26]等方法制备碳纳米管，但这些方法制备的碳纳米管杂质含量多，需要利用强酸氧化去除杂质^[27]。同时，强酸氧化引入了功能基团羧基、羟基等，改变了碳纳米管表面的疏水结构，防止其在溶剂中团聚，提高了碳纳米管的分散性和溶解性，可以更好的发挥固定化酶作用。因此，浓酸氧化是最常用的碳纳米管改性方法。Raghavendra等^[28]研究发现，由于碳纳米管长时间浸泡于强酸中，使得碳纳米管表面变的粗糙，溶解性增强，表面更易发生化学反应。Shen等^[29]应用单层碳纳米管和强酸氧化的单层碳纳米管对C—C键水解酶进行固定化，固定化酶分别保持了52.5%和99.7%的游离酶活性。通过同源模建和分子对接预测酶与载体的结合位点，结果表明，各种可能的结合方式都远离酶的活性中心，通过研究亚基之间的相互作用，发现未氧化的单层碳纳米管可以进入到两个亚基之间，干扰亚基之间的相互作用，降低单层碳纳米管固定化酶活力。Zhou等^[30]研究发现强酸氧化的单层碳纳米管固定化C—C键水解酶BphD，固定化酶的K_m和V_max与游离酶相近，保持了较高的催化活性，并通过分子动力学模型分析了载体对酶的吸附途径及结合位点。Feng和Ji^[31]研究了碳纳米管固定化酶的不同方法和途径。但是，强酸用于纯化，有时会引起碳纳米管结构的改变，影响固定化效果。因此，今后工作应进一步深入研究碳纳米管与酶的结合机制，寻找温和、纯化率高的纯化方法，合适的改性步骤。

目前为止，Au/Ag为原料的去合金法是制备纳米多孔金最方便和容易操作的方法，通过强酸腐蚀去除Ag原子后，Au原子迅速聚合和扩散形成纳米多孔金结构^[32]。纳米多孔金作为固定化酶载体具有以下优点：①制备方法简单、容易再生；②中间相互连通的多孔结构，具有载酶量高的特点；③保留了Au良好的生物相容性，可以有效避免酶的失活；④酶分子中的氨基和半胱氨酸中的巯基可直接结合到金纳米粒子表面用于固定化酶^{[33, 34]}。

纳米材料已经广泛用于电子、能源、机械、环境、健康等领域^[35]，近几年也开始应用于生物学领域。Mohamad等^[36]应用强酸氧化的多层碳纳米管固定化脂肪酶，并用于合成香叶基丙酸，结果表明，固定化酶合成香叶基丙酸的量是游离酶的2倍。Boncel等^[37]研究多层碳纳米管和氧化的多层碳纳米管固定化脂肪酶，固定化酶的活力异常高于游离酶，用于酯化反应，经过10次循环利用之后活力几乎没有改变，4℃储存7个月保留100%的活性，显示了较高的酶活力、良好的操作稳定性和储存稳定性，有利于工业化的大规模使用。Pedrosa等^[38]应用强酸氧化单层碳纳米管固定化有机磷水解酶，并用于生物传感器，传感器表现出高敏感性和良好的稳定性。Qiu等^[39]应用纳米多孔金固定化木质素过氧化物酶：固定化酶4℃放置1个月，仍保持95%的酶活力，而游离酶仅剩70%的酶活力；在45℃保育2h，固定化酶仍保持55%的酶活力，而游离酶在同样条件下保育，1.25h后没有了酶活力。固定化酶表现出了较好的储存稳定性和热稳定性。

1973年，Robinson等首次将磁性物质作为载体用于酶的固定化。此后，磁性载体越来越多地应用于酶的固定化^[40]。磁性纳米粒子除了具有纳米材料的优点外，最为显著的特点是具有磁性性能，即可以通过改变外部磁场的方向、磁力大小来改变粒子的运动轨迹，从而使酶与载体结合与分离可以在可控条件下完成，便于固定化酶分离和回收^[41]。同时，由于纳米粒子表面能较大、粒子表面活性较高，以及磁性粒子之间磁偶极矩作用，使得磁性纳米粒子极容易出现团聚现象，粒子的分散性和稳定性降低，所以在使用过程中需要对粒子进行表面改性或包覆，防止粒子团聚^{[42, 43]}。用于改性或包覆的有壳聚糖、麦芽糖、纤维素、聚合多巴胺、淀粉、透明质酸等高分子聚合物，有硅烷等有机硅化合物，有柠檬酸、葡糖糖酸、油酸等小分子有机物，有Co²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺等金属离子。

壳聚糖有与酶亲和力强、易反应的功能基团，易于化学改性，且来源丰富、价格低廉、生物相容性好等特性，在磁性纳米粒子包覆中应用非常广泛^{[44, 45]}。Liu等^[46]应用壳聚糖包覆的Fe₃O₄磁性纳米粒子固定化木聚糖酶，固定化酶量达162.2mg/g，显示了较高结合酶的能力。Liu等^[47]研究了磁场对壳聚糖包覆的Fe₃O₄纳米粒子形貌的影响，发现外加磁场使壳聚糖Fe₃O₄纳米粒子由球形变为杆状。

硅烷偶联剂，尤其是氨基硅烷用于磁性纳米粒子改性的报道也较多。Zhang等^[48]应用氨乙基三乙氧基硅烷、氨乙基三甲氧基硅烷、氨丙基三乙氧基硅烷改性的磁性纳米粒子固定化纤维素酶，改性的磁性纳米粒子对纤维素酶的吸附能力分别为69mg/g、89mg/g、73mg/g，均高于未改性的磁性纳米粒子62mg/g的吸附能力。Song等^[49]利用3-氨丙基三乙氧基硅烷改性的超顺磁性纳米粒子固定化重组锰超氧化物歧化酶，结果显示，固定化酶比游离酶表现出更好的抗温度、pH、金属离子、酶抑制剂、洗涤剂等性质。

改性或包覆的磁性纳米粒子作为新型载体材料，已经被广泛应用于酶固定化。Pan等^[50]应用壳聚糖包覆的磁性纳米粒子固定化β-D-半乳糖苷酶，固定化酶在室温下长期放置后，酶活力损失较小，用于催化乳糖生成低聚半乳糖，重复利用15次，仍保留92%的酶活力。Jin等^[51]采用3-氨丙基三乙氧基硅烷改性的磁性纳米粒子固定化蛋白酶，并用于水解油菜籽，研究发现固定化蛋白酶储存60天，酶活力几乎没有损失，显示出良好的储存稳定性，同时磁性纳米粒子在固定化蛋白酶水解油菜子后可回收。表 1为表面改性或包覆的磁性纳米粒子在固定化酶中的应用。

天然高分子材料具有来源广泛、生物相容性好、成本低廉等优点，可用于改善酶的稳定性和使用效率，从而用做固定化酶的载体材料，这类材料有海藻酸、壳聚糖、甲壳素、淀粉等。海藻酸具有一定的凝胶性质和无毒的特性，加入氯化钙溶液中，可形成机械强度大、灵活性好的微球，已作为固定化酶最常用的的载体材料之一^{[60, 61]}。本课题组赵林果等^[2]成功应用海藻酸钠和氯化钙固定化β-葡萄糖苷酶，比较了直接包埋、交联-包埋、包埋-交联方法固定化酶的效果，发现交联-包埋法固定化酶的固定率最高达64%，酶的稳定性明显提高。应用固定化β-葡萄糖苷酶连续水解纤维二糖，重复使用20次以上，仍能保持90%以上的酶解得率，体现了良好的操作稳定性，显著降低了大规模使用的成本。

固定化酶载体常用的形貌分析手段是扫描电子显微镜( SEM)分析、透射电子显微镜(TEM)分析、原子力显微镜(AFM)分析等。SEM分析或TEM分析可显示出载体材料及酶与载体复合物的形貌，所以，可通过酶与载体结合后形貌的变化情况，反映载体对酶的固定化情况；二者均具有分辨率高、放大倍数大、制样简单等优势，已成为固定化酶载体形貌分析的常用手段；SEM主要用于表面形貌分析，TEM主要用于内部组织形貌分析。

Hisamatsu等^[62]研究了三种硅基介孔材料的形貌，SEM分析显示FEM和KIT-6为随意的无定形形貌，SBA-15为聚集的长杆状形貌；TEM分析显示KIT-6为有序的三维介孔结构，SBA-15为有序的二维介孔结构，FEM为较薄的无序介孔结构。Onishchenko等^[63]通过咪唑基离子液体对MCM-41和SBA-15进行改性，通过SEM观察到，物理吸附法进行改性，没有改变MCM-41的球形结构和SBA-15的圆柱形结构；通过SEM观察到，共价交联法改性，使MCM-41出现聚集、SBA-15的形状变得细长；通过TEM观察到，共价交联法改性，使SBA-15的圆柱形结构发生坍塌。

Mubarak等^[64]应用强酸氧化的多层碳纳米管固定化纤维素酶，通过SEM观察发现，原始的多层碳纳米管为紊乱管状结构、表面光滑；浓硫酸和硝酸混合物氧化的多层碳纳米管为较短的有序管状结构、表面粗糙；强酸氧化的多层碳纳米管固定化酶后多层碳纳米管的孔隙上覆盖着薄膜结构，同时上面显示许多亮点，这主要是由于羧基和氨基形成了肽键，表明纤维素酶成功吸附到了改性的多层碳纳米管上。此外，通过SEM观察发现，改性多层碳纳米管固定化酶、改性多层碳纳米管与原始多层碳纳米管相比直径和表面形貌相似，意味着改性和固定化酶没有太多改变多层碳纳米管结构。Qiu等^[39]通过SEM观察发现，纳米多孔金为中间相互连通的多孔结构，固定化酶木质素氧化酶后，大多数孔被填满，呈现相对偏暗和模糊的图像。Pan等^[50]通过TEM观察，Fe₃O₄磁性纳米粒子为聚集状态，而包覆壳聚糖的Fe₃O₄磁性纳米粒子为分散状态。

固定化酶载体的结构分析手段有傅里叶变换红外光谱(FTIR)分析、X射线衍射( XRD) 分析、圆二色性(CD)分光偏振计分析、核磁共振(NMR)光谱仪分析、紫外-可见固体漫反射光谱分析、荧光光谱分析、拉曼光谱分析等。由于载体、载体和酶的复合物中各种基团对红外光吸收特性不同，在FTIR出现不同的吸收峰值，可用于分析载体的结构、类型及载体固定化酶的情况，所以，FTIR分析是载体材料固定化酶有力的表征手段。Carlsson等^[65]应用介孔氧化硅固定化脂肪酶，用FITR观察到硅醇基(Si-OH)的吸收峰值明显下降，暗示载体的硅醇基与脂肪酶的氨基连接形成了氢键(N—H键)，此外，C—H伸缩振动吸收峰，C=O伸缩振动吸收峰及C—H变形振动吸收峰可以在图谱中观察到，进一步证明酶已固定化到载体上。Zou等^[17]通过对离子液体改性的SBA-15固定化猪胰脂肪酶进行FITR分析，光谱显示具有介孔二氧化硅独特的吸收峰，还显示了两个新的峰值，分别为N—H伸缩振动吸收峰和来源于离子液体中咪唑基的C=C伸缩振动吸收峰，表明离子液体改性和猪胰脂肪酶进入到SBA-15的孔道中。Zhang等^[66]通过多层碳纳米管、单层碳纳米管、氧化的单层碳纳米管固定化过氧化氢酶，研究发现这三种材料固定化酶活性逐渐增加，用FITR分析和CD分析后，发现多层碳纳米管固定化酶比单层碳纳米管固定化酶损失了更多的α螺旋和β折叠，同时氧化的单层碳纳米管固定化酶β折叠的数量增加。Li等^[67]对比壳聚糖包覆的Fe₃O₄纳米粒子共价固定化乙醇脱氢酶和壳聚糖包覆的Fe₃O₄纳米粒子FITR图谱，发现固定化酶后出现了C=N伸缩振动吸收峰，该峰值的形成是由于戊二醛的羧基与载体的氨基、酶的氨基形成了肽键，也意味着通过戊二醛将载体和酶成功进行了共价交联。

在XRD图谱上，通过衍射峰的半高宽和强度可以反映晶体的结晶情况，另外，通过计算晶格常数，可以确定被测物质。Zhai和Sun^[68]将胃蛋白酶、SBA-15、甲基改性SBA-15及改性SBA-15固定化酶的样品进行XRD分析，由于胃蛋白酶为非晶体物质，没有出现特征吸收峰，其它样品均出现六边形的介孔结构，也证明了通过改性和固定化酶并没有改变SBA-15的结构。Marta等^[69]通过XRD分析Fe₃O₄磁性纳米粒子和壳聚糖包覆的Fe₃O₄磁性纳米粒子图谱，发现均是倒尖晶石结构，表明磁化途径和壳聚糖包覆过程没有改变Fe₃O₄粒子结构。

目前，常用的固定化酶载体元素分析手段是X射线光电子能谱(XPS)和能量散射X射线光谱(EDS)。Kondyurin等^[70]通过XPS光谱分析碳纳米管固定化酶前后的元素组成，固定化酶之前观察到非常微弱的氧和氮峰值，固定化酶后出现强大的氧和氮峰值，用清洁剂对酶与载体复合物清洗后，氧和氮的分值略微下降，说明大部分酶牢固的结合到载体上。Yan等^[33]通过EDS光谱分析纳米多孔金及固定化酶前后的元素组成，固定化酶之前只有Au元素，固定化酶后出现了碳、氧、硫等元素，表明酶已经成功固定化到纳米多孔金载体上。Kuo等^[71]研究壳聚糖包覆的Fe₃O₄磁性纳米粒子固定化酶时，用EDS观察到Fe₃O₄纳米粒子铁、氧、碳元素组成分别为70.9%、29.2%和2.8%，包覆壳聚糖后碳元素和氧元素分别增加9.8%和0.9%，说明壳聚糖包覆到Fe₃O₄纳米粒子上。

氮气等温吸附曲线是用于确定多孔材料比表面积、孔径大小的一项常用技术。Zou等^[72]应用离子液体改性的SBA-15固定化脂肪酶，氮气等温吸附曲线描述SBA-15、改性的SBA-15及改性的SBA-15固定化脂肪酶均属于Ⅳ型等温曲线H1滞后环，表明样品为介孔材料。离子改性使SBA-15部分结构坍塌，比表面积降低，固定化酶后，比表面积继续减小，说明酶固定化到了载体上。同时，随着离子液体改性和固定化，孔径逐步减小，进一步证实了离子液体和酶进入到SBA-15的孔道中。Gomez等^[73]通过氮气等温吸附曲线分析，发现多层碳纳米管存在非常轻微的微孔型，用BET(Brunauer-Emmet-Teller)方法计算，多层碳纳米管的比表面积为130m²/g，符合纳米材料大比表面积的特点。邱华军等^[74]通过氮气等温吸附曲线发现，浓硝酸处理的Au/Ag合金制备的纳米多孔金孔径为30～50nm，经过200℃退火1h得到的纳米多孔金孔径为80～100nm。Wang等^[75]通过氮气等温吸附曲线分析，发现氧化石墨烯、壳聚糖Fe₃O₄磁性纳米粒子复合物为Ⅴ型等温曲线(弱吸附作用)，用BET方法计算，复合物的比表面积为65.81m²/g，用BJH(Barrett-Joiner-Halenda)法计算，复合物的孔径约为18.96nm。

随着固定化酶技术发展日趋成熟，大量载体被成功用于酶的固定化。本文就固定化酶载体的优缺点、研究进展、应用情况及表征手段进行综述。虽然在固定化酶领域发展起来的载体大多都能使酶的稳定性和重复使用率有所提高，但也存在一些不足，如酶与载体之间的结合存在阻力，改性或包覆使酶蛋白活力降低，固定化酶步骤繁琐，部分载体存在不易回收、难以降解、污染环境等问题。

今后固定化酶载体可能在以下几个方面取得更大进步。①在现有工作中，虽然通过改性或包覆等方式，使固定化酶的稳定性和重复利用率提高，但大多降低了酶与底物的亲和力，固定化酶活力有所损失。所以，通过定点、定向改性或包覆，改变酶分子结构，增加酶与底物的亲和力，将是解决以上问题的新途径。②目前，国内外学者对载体固定化酶条件优化研究较多，但对载体固定化酶具体作用机制研究较少。所以，各种载体固定化酶的作用机制有待于进一步研究，为载体改性和载体选择提供重要依据。③通过结合各种载体的优点，可以提高固定化酶的效率。所以，双载体或多载体共固定方式也将是今后研究方向之一。④就长远来看，载体与酶分子中非必需基团可操作性的结合与分离，将是载体固定化酶的研究热点。同时，适合的固定化方法将会使载体固定化酶效率大大提高。此外，选择成本低廉、绿色环保、生物相容性好的载体将是今后发展的主要趋势。随着新型固定化酶载体的不断涌现，将会出现越来越多经济、易得、高效的固定化酶载体。