目前,几乎临床上使用的所有抗生素都有其抗性细菌,多重耐药菌株的检出也相当普遍,甚至出现了能抵抗绝大多数临床用抗生素的超级细菌。广泛存在且不断增长的细菌抗生素抗性将或已经成为我国食品安全和人类健康领域的最主要威胁之一^[1]。世界卫生组织(WHO)已经将抗生素抗性列为人类医疗健康面临的三大威胁之一。例如，在美国每年有超过100 000人感染甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(MRSA)，其中将近20 000死于MRSA感染。在世界范围内，每年受多抗结核杆菌影响的人数超过500 000人^[2]。由于抗生素的长期应用，许多细菌病原菌已经发展成为多抗菌株(MDR) ，欧盟每年大约有25 000人死于多抗细菌导致的感染，美国每年死于医院获得性细菌感染的人数超过63 000,由此导致的治疗费用1992为1.3亿美元，2006年更高达1.87亿，远远超过每年流感的治疗费用^{[3, 4]}。人们对广泛存在的微生物抗生素抗性的严重危害提出了这样的疑问：如此多样且广泛存在的病原菌抗性从哪里来？为什么短短几十年的抗生素应用会导致环境和病原菌抗性的爆发？

抗生素自上世纪40年代被发现并进入临床医疗以来，一直作为抗感染治疗的主要手段，拯救了千百万人的生命，被誉为人类二十世纪最伟大的发现之一^{[4, 5]}。在过去的几十年间,新的抗生素不断被发现并进入临床^[6]。随着抗生素产业的发展，抗生素的应用范围也由原来的临床抗感染治疗发展到人畜感染控制，甚至水产养殖、饲料添加等，越来越多的抗生素被作为生长促进剂长期添加于饲料中而导致抗生素的滥用问题日趋严重。根据丹麦1994年的统计，在丹麦大约24千克万古霉素用于人类抗感染治疗，而同期用作饲料添加剂用量则达到24 000千克^[7]。美国1951年用于动物饲料添加剂和致病治疗的抗生素分别为110吨和580吨；到了1978年这两个数字分别为5 580吨和6 080吨，几乎有一半的抗生素用在养殖行业；而2000 年消耗的16 200 吨抗生素中，70%用于兽药，仅30%用于人类医药^[8]。据统计，我国畜牧养殖行业使用抗生素情况也比较广泛，滥用问题更甚。据化学工业学会和制药工业学会2005年的统计数据，我国人均抗生素使用量远高于世界平均水平。我国每年抗生素原料生产量约为21万吨，其中有9.7万吨(占46.1%)用于畜牧业^{[9, 10]}。

抗生素的广泛使用导致了环境和病原菌抗生素抗性的普遍增加,抗生素的治疗效果日益下降,临床感染性疾病的治疗越来越面临巨大挑战^[11]。其实,早在抗生素第一次进入临床应用之前,就已经出现关于抗性细菌的报道^[12]。随着抗生素的广泛使用,抗性细菌在数量、多样性以及抗性强度上都显著增大。在对分离于1885~1941年间的433株肠杆菌(Murray’s collection)的抗性检测中，只有不到3%的菌株对抗生素具有抗性。而据对1973~1983这10年间收集的72株大肠杆菌菌株(ECOR collection)的抗性调查，18株(25%)的菌株至少抗一种抗生素，14株(20%)抗两种以上的抗生素^[11]。另一个典型的例子来源于对蜜蜂肠道微生物抗生素抗性的调查。从上世纪50年代开始，四环素被FDA批准成为唯一可以用于防治蜜蜂蜂房芽孢杆菌病的抗生素。Tian等^[13]、Levy等^[14]通过收集美国6个州25份不同蜂群样品，运用定量PCR、宏基因组高通量测序、功能宏基因组筛选和微生物培养的方法系统调查了长期的抗生素处理对蜜蜂肠道微生物抗性的影响，并与野生大黄蜂，欧洲和新西兰(无抗生素处理)的蜜蜂样品对比。结果表明美国蜜蜂肠道微生物具有8种四环素抗性基因，经常接受四环素处理的蜂群抗生微生物的比例20%~60%，最高可达80%。没有抗生素处理或者对照只有2~3种，比例只有2%~5%左右。这些抗性基因主要通过水平基因转移的方式转播，表明长期的抗生素应用导致了美国蜜蜂肠道微生物有更高的抗生素抗性。

宋立等^[15]对我国20 世纪70~90年代和2000 年收集的326株食品动物大肠杆菌的抗性调查表明,在过去的30 多年里,食品动物大肠杆菌对主要临床用抗生素的耐药性普遍呈逐渐增长趋势。从1970~2000 年,对青霉素类的耐药率从19.0%增长到81.3%; 对四环素类药的耐药率从61.9%~63.5%增长到89.5%~93.1%; 对氨基糖甙类的耐药率从0~9.5%增长到5.0%~63.1%,对氟喹诺酮类的耐药率从无增长到 50.2%~53.0%; 对磺胺类药的耐药率从11.7%~57.1%增长到77.7%~79.7%; 对氯霉素的耐药率从39.7%增长到51.8%。而据国家细菌耐药性监测中心的数据，金少鸿等^[16]对1986年分离的71株和2001年分离的86株正常猪粪便大肠杆菌抗生素耐药性的调查表明,对环丙沙星的耐药率从1986年的0%增加到 2001年的65.4%。另外氯霉素、四环素、复方磺胺甲唔哇、链霉素、庆大霉素等抗生素的耐药率明显增高。另据Zhu等^[17]对我国北京、浙江和福建三个大型养猪场及周边地区的猪粪、猪粪堆肥和施用堆肥环境样品中的244种抗性基因进行了检测和定量分析。检测到149种抗生素抗性基因，这些抗性基因涵盖了目前已知的主要抗性类型，其中有63种抗性基因丰度显著高于没有施用抗生素的对照样品(192~21 600倍)。而我们对福建省家养动物包括鸡、鸭、鸽、猪等畜禽以及宠物猫、狗和兔肠道肠杆菌9种常用抗生素抗性的检测表明，家养畜禽平均60%~90%的肠道肠杆类细菌可以抗至少一种抗生素，40%~50%的测试细菌可以抗5个以上的抗生素，最多的可以抗全部9类抗生素。在抗生素种类方面，对一些较早进入市场的抗生素类，如氨苄青霉素，氯霉素，四环素，链霉素，红霉素以及磺胺类抗生素普遍具有较高的抗性，而对头孢氨苄的抗性较低。宠物肠道肠杆菌类细菌的抗药性明显低于饲养畜禽，除了对磺胺类和四环素的抗性较高外(60%~90%)，对其他的抗生素抗性均比较低，只有10%~20%。但考虑到与人类的紧密联系，宠物肠道细菌的抗生素抗性更需要引起关注。数据表明了我国环境微生物抗生素抗性面临的形势比较严峻。

近年来的研究表明，抗生素抗性基因并不是在抗生素时代才产生，而是早在抗生素时代之前就已广泛存在于自然环境中。研究者通过对红霉素，链霉素和万古霉素代谢途径的进化分析表明，它们分别出现在8.8,6.1 和2.4亿年之前，即使是相对较晚的Daptomycin，其代谢途径在3千万年之前就已经存在了。学者对 β-内酰胺酶的进化分析表明青霉素抗性基因出现在2百万年之前，甚至在革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌分化之前^{[18, 19]}。D’Costa等^[20]通过对3万年前Beringian永久冻土带沉积物的分析，鉴别出多种耐β-内酰胺类，四环素类，糖肽类抗生素的基因，以及和现代抗性基因结构一致的古霉素抗性基因。结果表明，抗生素耐药性是一种自然现象，早在现代临床使用抗生素的选择性压力之前就已经广泛存在。

我们今天使用的大多数抗生素来源于环境微生物产生的天然化合物或其衍生体。通常这些抗生素作为抗生素产生菌抑制其他微生物获得或抢占有利生态位的生化武器，同时，生产者本身或者周围微生物也会进化出相应的对应策略以保证自身生存。许多工作已经表明多样的环境微生物蕴藏多样而广泛的抗生素抗性，临床上发现的病原菌抗性很多都源于环境抗性基因^{[21, 22, 23, 24]}。2007年,Wright^[18]提出将环境微生物中所具有的全部抗生素抗性基因的集合叫做抗生素抗性组(Antibiotic resistome or resistance reservoir)。致病菌携带的抗性基因只占抗性组很小的一部分，抗性组还包括抗生素生产者携带的抗性基因、潜在的抗性基因以及前体基因。在一定的选择压力下,这些基因可以进化为有效的抗性基因，并通过水平基因转移的方式在空气，水以及动物和人类等不同环境下传播扩散，或最终进入人体病原菌^{[18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25]}。近年来，来自不同研究团队关于土壤和人肠道微生物抗生素抗性的一系列工作为这个假设提供了最为直接的证据^{[21, 24, 26, 27]}。

土壤是地球上最多，最为丰富的微生物栖息地，同时也是最大的抗生素抗性基因库^[26]。结合新一代高通量测序与经典细菌培养方法，D’Costa等^[21]研究了土壤中分离的480株产孢链霉菌Streptomyces(大约有一半的抗生素来自于该属微生物)的抗生素抗性。他们首先构建包含这些微生物基因组的宏基因组文库，通过用12种不同的抗生素平板筛选，最终得到252个抗生素抗性基因，将这些基因序列与已知的人类病原体的基因进行比对，发现110个基因与已知的耐药基因有明显的相似序列，其中18个基因与人类病原体中发现的基因 有100%一致性。Dantas等^[24]对D’Costa的工作进行了补充^[21]，他们从11个不同土壤样品中随机选取了上百株微生物并分别测试了它们在18种抗生素作为唯一碳源和氮源平板上的生长。结果表明，测试的土壤样品均可至少利用其中的13~17种抗生素，在分离的75株细菌中，包括伯克氏菌(41%)和假单胞菌(24%)，有74株可以至少利用一种抗生素作为营养源进行生长。在随后的工作中，Sommer等^[28]利用同样的技术研究健康人肠道微生物组和可培养微生物抗性基因与人病原菌抗性基因的差异。通过对比，发现有氧的可培养微生物抗性基因序列大部分与病原菌相似，但是通过肠道微生物宏基因组文库筛选的抗性基因与病原菌差别较大。 Forsberg等^[27]用宏基因组测序发现在沙门氏菌、肺炎克雷伯菌及其它致病病原体的不同菌株中有着完全同一性的农田土壤细菌中的7种抗药基因。这些抗药基因簇集在一起并在其两侧有已知能够使细菌之间发生基因转移的移动DNA元件。

家养畜禽被认为是病原菌和环境抗生素抗性基因的一个重要载体^{[8, 29, 30]}。近年来随着畜牧养殖集约化发展，抗生素滥用情况日益严重，直接后果很可能是养殖动物肠道微生物内诱导产生丰富的抗性耐药菌，并在环境中传播扩散。已有研究表明，这些抗性菌株通过动物排泄物，或者畜牧活动扩散到环境中，或者通过食品形式进入到人体，并通过质粒交换等水平基因转移方式将抗性基因传播给环境微生物，或者这些微生物又可能通过多种方式传播进入人体^{[8, 31, 32, 33, 34]}。Looft 等^[35]进行的一项研究表明，在猪饲料中添加抗生素ASP250将增加猪体内肠道微生物的抗药性。研究者在一个高度可控的环境中饲养猪，其中一部分饲料中添加抗生素(金霉素、磺胺、盘尼西林)，其余部分不添加。结果发现添加抗生素的猪肠道细菌耐药基因的数量和种类都变得更丰富。同样，在Zhu等^[17]的工作中，通过高通量基因定量技术对三个城郊大型养猪场及周边地区的猪粪、猪粪堆肥和施用堆肥环境样品中的244种抗性基因进行了检测和定量分析，这些抗性基因靶标涵盖了目前已知的主要抗性类型。结果不仅检测到 其中的149种抗性基因，其中更有63种抗性基因丰度显著高于没有施用抗生素的对照样品(192~21 600倍)。另外，转座酶基因丰度最高可达对照样品的9万倍，而且与抗生素抗性基因的浓度呈显著正相关，暗示转座酶是引起抗性基因富集的原因之一。这些结果表明，过度的抗生素使用可引起抗生素抗性基因的富集，并可通过动物粪便排放到环境中。高丰度的转座酶可能使得这些抗性基因转移到人类致病菌中，危害人类健康。其它的对饲养动物肠道微生物抗性的研究，如鸽^[17],猪^{[35, 36]},牛^[37]，鱼^[38]和鸡^[39]等也都表明在牲畜饲养中过度使用抗生素可能是环境细菌中出现抗生素耐药基因选择的促成因素。

总之，已有的研究清楚地表明抗生素抗性基因广泛存在于自然环境中，多样环境微生物来源的抗生素抗性基因集合构成了不同环境下的微生物抗生素抗性组。抗生素抗性组不仅仅存在于人体自身肠道微生物组^[28]，以及与人类活动密切相关的动物肠道和土壤等自然环境中^{[13, 17, 22, 24, 27, 40]}；而且也广泛存在于多种土壤、空气以及水生环境中^{[18, 41, 42]}，甚至很少受到人类活动影响的地下洞穴、南极冻土层等一些特殊或极端环境^{[20, 43]}。结果表明抗生素抗性的存在是一种自然现象。自然界广泛存在的抗生素抗性组反映了自然环境下微生物之间为适应营养竞争而进化出的对应策略以保证自身生存。不同环境下微生物通过水平基因转移的方式形成了一个跨越不同环境、不同生态区域和微生物物种而形成的相互交流，相互影响，快速进化和流行的复杂网络^{[12, 23, 44]}。

病原菌获得抗生素抗性主要通过两个途径：基因变异或者水平基因转移。这些抗性基因通过改变膜渗透功能，使抗抗生素的酶失活；或通过主动运输，进行目标性修饰；或通过改变接触点的代谢来完成目标菌的防御^{[11, 41]}。近年来，大量研究揭示病原菌主要是通过水平基因转移获得抗性基因，而通过基因突变获得抗性的比例很小^{[3, 12, 33, 41]}。 通过对人体自身微生物组，病原菌以及不同环境微生物所携带的不同种类抗性基因的对比分析和研究证明了病原菌抗性基因与环境抗生素组之间的联系。Sommer等^[28]通过功能宏基因组学研究对比了人体肠道微生物组(优势菌)，病原菌以及人体肠道可培养细菌所携带抗性基因的差异，结果表明人肠道可培养有氧菌抗性基因与人肠道微生物(主要为厌氧菌)抗生素抗性组之间序列同源性很低，而这些可培养微生物携带的抗性基因与病原菌之间具有很高的同源性。结果说明病原菌抗性基因不是来源于人自身抗生素抗性组。病原菌抗性基因序列和环境微生物抗性基因序列的高度相似性表明了病原微生物抗生素抗性基因的环境来源。

传统研究环境抗生素抗性基因的方法包括抗性微生物培养，抗性基因的筛选鉴定，抗性基因的PCR扩增和定量PCR分析。近年来通过这些方法从不同微生物类群中已经鉴定和分离了大量的不同类群抗生素的抗性基因，阐释了不同的抗生素抗性基因的作用机制。大量抗生素抗性微生物及其抗性基因的分离鉴定也使得进一步追踪病原菌抗性基因的来源和进化、传播途径成为了可能。一般情况下，我们很难在实验室通过实验重现过去的基因进化事件，基因进化历史的回顾主要是通过对基因的回顾性系统进化发育分析来完成。例如通过对核糖体保护蛋白(RPP)的聚类分析，Aminov等^[45]确认四环素抗性基因RPPs起源于一个早期的分枝并与其它延伸因子EF-G分开，而进一步八个不同的RPPs类群分枝事件发生在前抗生素时代。在我们先前的对蜂房芽孢杆菌四环素抗性基因tetL的对比和聚类分析发现，其与鸡肠道微生物中的tetL基因序列具有100%的一致性，并且与另外一个四环素抗性基因tet48同源关系最近^{[13, 39]}。

然而，不同于抗性基因本身的进化，病原菌获得抗性基因主要是一个水平基因转移事件，在不同环境中传播的这些抗性基因保持99%~100%的序列一致性，很难找到足够的进化信息构建基因的进化历史。例如尽管先前Sommer等^{[19, 28]}和Forsberg等^[27]的工作表明病原菌抗性基因与人肠道和土壤中可培养微生物具有一致的基因序列，高度相似的基因序列无法提供足够的信息使得我们可以确定这些基因的传播方向以及它们的进化历史。既有可能是病原菌从环境中获得这些抗性基因，也有可能这些抗性基因是从病原菌传播到环境中去。另一方面，我们也无法通过追踪这些抗性基因的进化历史来获得这些抗性基因的最初来源。我们目前无法从已有的数据库中获得更多的信息去构建一个完整的链条。一方面，我们需要更多的信息来构建病原菌抗性基因和不同环境抗生素组之间流动传播以及抗性基因进化路径上的每一个进化链条；另一方面，除了抗性基因本身，我们需要寻找新的基因标记来分析和追踪抗性基因的进化传播途径。

传统的抗性微生物培养、PCR和定量PCR分析具有一定的限制性，如大多的微生物不可培养，而PCR结果的真实程度则取决于是否可以获得足够的序列信息设计引物，因此我们很难得到有关环境微生物抗生素抗性组的全面和详细的信息。近年来，基于功能的宏基因组筛选和基于高通量测序为基础的宏基因组测序分析技术与方法的发展为研究环境抗生素抗性组的生态，起源，进化和传播机制提供了最强有力的工具。在1985年，Pace等首先建议通过直接提取环境基因组DNA对不可培养微生物进行分类，第一个基于功能筛选为基础的宏基因组文库构建于1995年。随后在1998年Handelsman等提出了宏基因组学(Metagenomics)的概念。通过宏基因组文库筛选了几个新的抗生素抗性基因，包括抗β-内酰胺类，四环素类，氨基糖类和博来霉素抗性基因^{[26, 44, 46]}。功能宏基因组筛选是研究未知抗生素抗性基因的有力武器，然而筛选是基于在大肠杆菌表达的结果，这限制了宏基因组文库的应用。随着高通量测序和分析技术的发展，宏基因组学方法进一步分为基于功能的宏基因组筛选和基于序列的宏基因组学测序。如今已经有超过1 000个来源于不同环境的样品被测序，包括土壤，人肠道，和海洋等^[44]。基于同源序列对比为基础的宏基因组学分析可以使得我们获得大量已知或者潜在的抗生素抗性功能基因。D’Costa等^[21]和Dantas的研究团队^[24]对土壤和人肠道微生物组的高通量测序和分析使我们对人体肠道微生物组以及土壤微生物所蕴藏的抗生素抗性基因的广度和深度都有了更进一步的理解，同时这一系列工作也为不同环境下微生物抗生素抗性基因的传播和流动提供了最为有力的证据^{[26, 27]}。对多样化环境条件下微生物组的高通量测序分析和抗性基因的宏基因组学分析极大推动了对环境抗生素组概念的认识和理解^{[12, 18, 20, 43, 44]}。

高通量测序和基于序列的宏基因组学分析最大的挑战是由于缺乏足够的信息而无法完整解析宏基因组序列中包含的大量的功能基因。另外，由于基因组的拼接是基于最大一致性原则，最终得到序列结果是最优势的基因信息，或掩盖了突变信息的单个基因单元，或者是无法追踪微生物来源的抗性基因及其转移元件序列。发展和改进现有的研究手段研究环境微生物的抗生素抗性机制十分必要。一个可供选择的策略是将传统分子和微生物技术与高通量测序技术的结合。在我们前期对蜜蜂肠道微生物抗生素抗性组的研究中，综合利用微生物培养、定性和定量PCR方法分析不同蜂群样品中四环素抗性基因的种类，数量和分布；将宏基因组学测序分析结果与功能宏基因组筛选，fosmid大片段测序分析相结合，研究四环素抗性基因的进化和传播过程。我们的结果表明长期的四环素处理在蜜蜂肠道生物中产生了高比例多样性的四环素抗性基因。通过对宏基因文库抗性克隆筛选获得的大片段基因组DNA的高通量测序分析，以及抗性基因转移元件序列和结构的对比分析，表明其中鉴定的两个携带tetC的转座子(相同的tetC基因，但是二者transposase不同)，一个与猪肠道衣原体菌株Chlamydia suis的携带tetC的转座子和序列一致，另一个则与人，污水处理厂，鸡肠道，养猪场和火鸡致病细菌携带的tetC转座子完全一致，其它的携带有tetB，tetD和tetL的转座子都分别可以从不同来源的环境微生物中发现，如人体病原细菌，肠道微生物，海绵共生细菌等。这些相同的抗性基因及其相同的转座子表明了与蜜蜂肠道微生物四环素抗性基因相对的这些基因主要通过水平基因转移的方式获得，以及这些抗性基因的环境来源，或者他们可能的共同起源。此外，我们的工作也表明长期的抗生素应用会导致蜜蜂肠道微生物菌群结构的改变，进而影响蜜蜂的健康，这很可能是2006年起造成蜂群大量死亡的蜂群衰竭失调(CCD)的重要原因之一^{[13, 14]}。

在蜜蜂肠道微生物抗性组中，相同的抗性基因整合在不同的转座子，或者同样的转座子携带了不同的抗性基因。比如在蜜蜂肠道微生物抗性组中有两种类型的转座子携带抗性基因TetB，除了Tn10，另一个携带tetB的转座子则是在Tn10转座子glts基因的位置插入一个携带氨苄青霉素抗性基因的Tn3，形成一个新的具有双抗的杂合转座子。tetH所在的质粒也是一个包含一个转座子和tetH基因的新杂合质粒。这两个转座子目前都还没有在其他微生物中发现。新类型的转座子的发现表明一些抗性基因可能是从蜜蜂肠道微生物进化而来。同一微生物组中不同的新转座子的形成提供了一个可供选择的策略是通过跟踪转移元件序列和结构变化来追踪抗性基因在不同环境中的进化和传播。在蜜蜂蜂房芽孢杆菌四环素抗性基因tetL的进化分析中，我们注意到鸡肠道微生物抗性组中存在两种不同形式的tetL转移元件，前者与tet48转移元件一致，后者则与蜂房芽孢杆菌tetL转移元件具有高度相似，二者大小相同。说明tetL很可能是首先在第一个转座子上完成从tet48到tetL的进化，获得在芽孢杆菌中兼容性表达的能力，之后通过转移元件的更换，获得进入芽孢杆菌的能力。对tetL的进化分析阐释了蜜蜂病原菌蜂房芽孢杆菌获得抗性基因的途径和为什么该菌会在四环素应用50多年之后获得抗性^{[13, 39]}。

总之，通过宏基因组学手段和大规模的数据测序分析，可以对病原的抗生素抗性基因序列及其转移元件序列进行对比和系统进化分析，从而阐释病原菌抗性基因起源、获得途径及水平基因转移机制，追踪抗性基因及其转移元件在不同环境中的进化历史和传播途径。通过对环境细菌抗生素抗性组生态和进化生物学的系统深入调查将为理解抗生素抗性产生及传播机制，指导新抗性药物发现和研制，制定合理的抗生素应用和管理政策，以及抗生素抗性细菌发生和爆发的早期预警和检测提供坚实的理论和实践基础。