DNA组装方法是合成生物学实施过程中的关键技术^{[1, 2]}。目前使用的DNA组装技术主要可以分为两类：第一类是需要使用限制性内切核酸酶和连接酶的组装技术，如BioBricks^TM[3]、BglBricks^[4]和Golden Gate^[2]；第二类是无需使用限制性内切核酸酶和连接酶的组装技术，如OE-PCR(overlap extension polymerase chain reaction)^[5]、In-Fusion^TM[6]、Gibson组装^[7]等。第二类方法不受酶切位点的限制，且得到的组装产物中不存在疤痕序列。Zhang等^[8]于2012年提出了一种名为SLiCE (seamless ligation cloning extract)的组装方法。SLiCE可以利用大肠杆菌E.coli DH10B的细胞裂解物，在体外一步组装多个DNA片段，并首次在体外成功组装含有其他物种染色体片段的BAC(bacteria artificial chromosome)质粒。大肠杆菌细胞裂解物易于获得、相对便宜且便于保存。因此与其他不需要使用限制性内切核酸酶和连接酶的方法相比，SLiCE方法成本更低。利用该方法，还可以为不具备In-Fusion组装系统的菌株(如链霉菌)拼接可在其体内表达的基因和模块。

2013年，Fisher等^[9]针对反应缓冲液组分、反应时间和反应温度对SLiCE组装方法做了进一步的优化和改进，并进一步扩展了可用于SLiCE组装方法的细胞裂解物来源。但是对所用的酿酒酵母(S. cerevisiae)等来源的细胞裂解物是否真正具备体外组装的能力仍然存在疑问，即不能区分所获得的重组子是归功于在大肠杆菌内源的重组系统还是所使用的细胞裂解物。所以需要通过体外实验对酿酒酵母细胞裂解物是否具备体外组装能力进行验证。此外，Itaya等^[10]利用枯草芽孢杆菌(B. subtilis)内源的同源重组系统，在其体内成功拼接了完整的16.3kb小鼠线粒体基因组和134.5kb的水稻叶绿体基因组。这说明枯草芽孢杆菌本身就具有可用于片段组装的同源重组系统，可尝试利用枯草芽孢杆菌细胞裂解物进行体外组装，进一步扩展可用于SLiCE组装方法的细胞裂解物来源。

Zhang为了提高大肠杆菌DH10B(基因型为recA^－)的体外组装效率，将L-阿拉伯糖诱导表达的λ重组系统整合到其染色体中，获得了高效率体外组装的菌株PPY。在利用SLiCE研究两片段组装时发现，随着插入片段质量的增加，每纳克(ng)载体得到的转化子的数量增加。但是作者并没有统计所得到的转化子的阳性克隆率。综上所述，本文首先通过体外组装实验，分别研究表达λ重组系统的大肠杆菌、酿酒酵母及枯草芽孢杆菌的细胞裂解物是否具备体外组装DNA片段的能力。然后建立以转化子颜色筛选阳性克隆的方法，并以该方法计算三片段不同摩尔比例组装时，所对应的阳性克隆率。最后使用优化后的SLiCE方法，成功组装酿酒酵母黑色素合成模块。

1.1 质粒、菌株与培养方法

本文中所使用的质粒与菌株见表 1。

表 1 本文所用的质粒与菌株 Table 1 Plasmid and strains used in this research

Strains/Plasmids

Genotype /Description

Reference/Source

Plasmids
pRedET	Low copy number plasmid(5~10)with λ prophage Red recombination system	Purchased from Gene BridgeTM
pRS415k	Single copy plasmid in S.cerevisiae with LEU2 and Kan marker	This laboratory
pPC016	Plasmid harboring RFP ORF, promoter Galp and terminato CYC1t, Ampr	This laboratory
pUC57-melA	pUC57 with melA (Rhizobium etli CFN42, codon optimized), Ampr	Purchased from Genscript Inc
pPC016-melA	pPc016 with melA expression cassete	This work
Strains
E．coli DH10B	F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZΔM15 ΔlacX74 recA1 endA1 araD139 Δ(ara, leu)7697galE15 galK λ- rpsL nupG	This laboratory
E．coli QF-Ec-01	DH10B with plasmid pRedET	This work
S. cerevisiae BY4741	MATa,his3Δ1,leu2Δ0,met15Δ0,ura3Δ0	This laboratory
BY4741+pPC016-melA	BY4741 with plasmid pPC016-melA	This work
BY4741+ pPC016	BY4741 with plasmid pPC016	This work
Bacillus subtilis WB700	nprE aprE epr bpr mpr::ble nprB	This laboratory

表选项

大肠杆菌DH10B的培养见参考文献[6]。酿酒酵母BY4741培养所用YPD培养基见参考文献[7]。缺陷型酿酒酵母培养于合成型缺陷培养基(SD)(22g/L葡萄糖、6.7g/L不含氨基酸酵母氮源、2g/L氨基酸省却混合物和适当的氨基酸母液)中，若需要可将葡萄糖换成20g/L半乳糖。枯草芽孢杆菌WB700在37℃培养于LB培养基(10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母浸粉和10g/L氯化钠)中。

1.2 体外组装所用片段的设计与制备

以含有红色荧光蛋白基因的质粒pPC025为PCR模板，用引物50 Amp R/Primer 1 F和50/80 F/2R 50(表 2)分别扩增片段Amp 2k(2 482bp)与Amp 3k(3 730bp)(图 1a)。所获得PCR产物需经DpnI消化模板质粒、纯化后，用于体外组装验证。

表 2 本文所用的引物 Table 2 Primers used in this research

Primers	Description	Sequence(5′-3′)
For Amp 2k amplification
50 Amp R		gcggccaacttacttctgacaac
Primer 1 F		gctgccgttcgcttgggaca
For Amp 3k amplification
2R 50		tggaaccgtactggaactgcg
50/80 F		gcggttagctccttcggtc
For RFP1 and RFP2 amplification
Primer RFP1	For RFP1	aagcttgatatcgaattcctgcagcccgggggatccactagttctagagcgaattcgcggccgcttctag
Primer RFP2	For RFP2	caattaaccctcactaaagggaacaaaagctggagctccaccgcggtggccatcgccggcgacgtc
For melA amplification
MelA-F	50bp homologous arm with pPC016	atatacctctatactttaacgtcaaggagaaaaaactataatggcttggttggttggtaagcc
MelA-R	50bp homologous arm with pPC016	ctaattacatgatatcgacaaaggaaaaggggcctgtttattaagcagaaacgatagcgatttccaactt
For melA sequencing
MelA-sequence1F		aaggctttcgctcaaatcc
MelA-sequence2R		gtaagctctgtgccatgg
MelA-sequence3F		cgctaactctactgacagattg
MelA-sequence4F		tgtcagccttcaagtcgttc
Note：The underlined sequence indicates the sequence of homologous arm

表选项

图 1 片段Amp 2k与Amp 3k体外组装验证 Fig. 1 Fragment Amp 2k and Amp 3k assembly

图选项

以质粒pPC025为PCR模板，分别用引物Primer RFP1/2R 50和Primer 1 F/ Primer RFP1(表 2)扩增片段RFP1(406bp)、RFP2(706bp)(图 2)。质粒pRS415k经NotI酶切、纯化后，与片段RFP1、RFP2用于构建以颜色鉴别阳性克隆的方法体系。

图 2 片段RFP1、RFP2和pRS415k体外组装 Fig. 2 Fragments RFP1，RFP2 and pRS415k assembly

图选项

1.3 细胞裂解物的制备

制备大肠杆菌细胞裂解物，将大肠杆菌QF-Ec-01于37℃培养过夜后，以OD₆₀₀为0.1转接到120ml 2×YT培养基中。继续培养至OD₆₀₀为0.3，加入L-阿拉伯糖(终浓度0.3%)诱导1h，4℃离心收集菌体并称量湿重。按照1.3μl/mg湿重，加入试剂CelLytic^TM B Cell Lysis Reagent(Sigma)重悬菌体，按照其使用说明书裂解细胞。

制备酿酒酵母细胞裂解物，酿酒酵母BY4741于30℃培养过夜后，以OD₆₀₀为 0.1转接到120ml YPD培养基中。继续培养至OD₆₀₀为0.5，收集菌体并称量湿重，按照1.3μl/mg湿重，以试剂 CelLytic^TM Y Cell Lysis Reagent(Sigma)重悬菌体。按照其使用说明书裂解细胞。

制备枯草芽孢杆菌细胞裂解物，将枯草芽孢杆菌WB700 在LB培养基中37℃培养过夜后，以OD₆₀₀为0.1转接到120ml新鲜LB培养基中。继续培养至OD₆₀₀ 为0.4，收集菌体并称量湿重。按照1.3μl/mg湿重，以超声缓冲液(20mmol/L Tris-HCl pH 7.9,20% glycerol,0.1mol/L KCl,0.2mmol/L EDTA,0.5mmol/L dithiothreitol,0.2mmol/L PMSF)重悬菌体。使用超声波破碎细胞，直至菌液澄清。超声程序为每个循环工作10s，间歇10s。

大肠杆菌、酿酒酵母和枯草芽孢杆菌细胞破裂后在4℃ 16 000g离心10min以去除细胞碎片。将含有可溶活性蛋白的上清液用移液枪小心吸入EP管中，并向上清液中加入等体积的100%甘油。吹吸混合均匀后，分装于PCR管中于－20℃保存。

1.4 体外组装反应体系

体外组装反应体系含有50ng线性片段混合物，1μl 10×SLiCE Buffer [500mmol/L Tris-HCl(pH 7.5,25℃),100mmol/L MgCl₂,10mmol/L ATP，10mmol/L DTT]，1.5μl细胞裂解物(蛋白质浓度为16.4mg/ml)，用无菌水补齐至10μl。将混合好的体系置于PCR仪中，37℃反应1h。然后根据后续实验需要进行琼脂糖凝胶电泳验证或转入大肠杆菌DH5α中。

1.5 黑色素模块的组装

以pUC57-melA为模板、用引物MelA F和MelA R(表 2)PCR得到与载体pPC016具有50bp同源臂的片段s-melA，然后与载体pPC016以1∶1的比例混合体外组装(图 3)。反应产物转入大肠杆菌DH5α中。通过菌落PCR(通用引物M13F和M13R)、测序对转化子验证，得到pGalp-melA-CYC1t。

图 3 黑色素和载体组装 Fig. 3 The assemble of melA and pPC016

图选项

将质粒pGalp-melA-CYC1t和pPC016分别转入酿酒酵母BY4741。从平板上挑取转化子，接种于10ml SC-Ura(半乳糖浓度20%)液体培养基，并添加0、20、40、60mg/ml浓度的Cu²⁺。于30℃培养7~8天后，每个试管均取1ml菌液离心，观察菌体颜色。

2 结果与分析

2.1 不同菌株体外组装能力测试结果

2.1.1 大肠杆菌细胞裂解物体外组装测试

为适当提高λ重组系统蛋白质的表达量，将含有L-阿拉伯糖诱导表达的λ重组系统的质粒pRed/ET导入大肠杆菌DH10B中，得到菌株QF-Ec-01。

如图 1a所示，用于体外重组实验的片段Amp 2k和Amp 3k之间有50bp的同源区域。将片段Amp-3k和Amp-2k混合，以QF-Ec-01细胞裂解物催化体外组装。反应1h后，可以清晰地观察到2 482bp片段的Amp-2k和3 730bp 片段的Amp-3k在QF-Ec-01细胞裂解物的催化下组装成大小为6kb左右的条带(图 4)，证明本文构建的QF-Ec-01细胞裂解物具有体外组装的能力。此外，在体外组装时还形成了7/8kb的条带，推测为Amp 2k和Amp 3k(图 1c、图 1d)。

图 4 大肠杆菌细胞裂解物体外组装结果 Fig. 4 The assemble result for E.coli extract 1~4 lanes represent different combinations’ reaction results of fragments Amp 2K (50ng), Amp3k (50ng) and E.coli extract (16.4 μg). The Marker DNA bands are 10kb, 8kb, 6kb, 5kb, 4kb, 3kb, 2kb, 1.5kb and 1kb

图选项

2.1.2 酿酒酵母细胞裂解物体外组装测试

将酿酒酵母BY4741细胞裂解物与片段Amp-3k和Amp-2k混合，以检测其细胞裂解物在体外是否具有拼接DNA片段的能力。如图 5所示，经过1h反应后，BY4741的细胞裂解物在体外不能把片段Amp-3k和Amp-2k拼接在一起。证明BY4741的细胞裂解物在当前条件下不具有体外组装DNA片段的能力。

图 5 酿酒酵母细胞裂解物体外组装结果 Fig. 5 The assemble result for yeast extract 1~5 lanes represent different combinations’ reaction results of fragments Amp 2K (50ng), Amp3k (50ng) and yeast extract (15μg). The Marker DNA bands are 10kb, 8kb, 6kb, 5kb, 4kb, 3kb, 2kb, 1.5kb and 1kb

图选项

2.1.3 枯草芽孢杆菌细胞裂解物体外组装测试

将枯草芽孢杆菌(B. subtilis WB700)细胞裂解物与片段Amp-3k和Amp-2k混合，以检测其细胞裂解物在体外是否具有拼接DNA片段的能力。如图 6所示，经过1h反应后，没有出现拼接产物所代表的6kb(正确组装)的条带，反而片段Amp 2k和Amp 3k对应的条带变暗(图 6泳道1、2和3)，同时出现更小的条带(约为1kb)，推测组装所用片段被WB700细胞裂解物所降解。将片段Amp 2k和Amp 3k分别与WB700细胞裂解物混合(图 6泳道5和6)也出现类似的现象。而片段Amp 2k和Amp 3k不与细胞裂解物混合时则可保留原始片段大小(图 6泳道4、7和8)。因此推测WB700的细胞裂解物含有过多核酸酶，故其不适宜用于体外组装DNA片段。

图 6 枯草芽孢杆菌WB700细胞裂解物体外组装结果 Fig. 6 The assemble result for B.subtilis WB700extract 1~8 lanes represent different combinations’ reaction results of fragments Amp 2K (50ng), Amp3k (50ng) and B.subtilisWB700 extract (15μg). The Marker DNA bands are 10kb, 8kb, 6kb, 5kb, 4kb, 3kb, 2kb, 1.5kb and 1kb

图选项

2.2 使用大肠杆菌裂解物组装时片段比例对组装结果的影响

如图 2所示，将互相之间有50bp同源序列的片段RFP1、RFP2与线性pRS415k载体混合，使用QF-Ec-01细胞裂解物进行体外组装实验。将产物转化入大肠杆菌DH5α。如果组装正确，片段RFP1、RFP2融合形成RFP表达盒，插入pRS415k载体的LacZ表达盒中，即正确组装的转化子为红色，否则为蓝色或白色(图 7)。

图 7 RFP1、RFP2与pRS415k组装后转化子 Fig. 7 The transformants of assemble of RFP1, RFP2 and pRS415k

图选项

将RFP1、RFP2和pRS415k 3个片段按表 3中设定的摩尔比例混合，以QF-Ec-01细胞裂解物催化体外组装反应。反应结束后将产物转入DH5α，并随机挑选10株红色阳性转化子进行测序，测序结果显示阳性率为100%。随后，根据转化子颜色计算各种混合比例下阳性克隆率。如表 3所示，随着插入片段总摩尔的增加，得到的转化子数量增多。当插入片段摩尔比例为3∶1时，阳性克隆率最高。

表 3 不同片段比例对应得到的CFU值 Table 3 Different insert and vector ration with its result CFU

Ratio	1∶1	2∶1	3∶1	7∶1	8∶1
阳性克 隆率	24/25, 96%	47/51, 92.2%	132/134, 99.2%	356/365, 97.5%	356/362, 98.3%

表选项

2.3 黑色素合成模块的组装

黑色素可以作为阳离子交换剂、药物载体及非晶态半导体。melA编码的酪氨酸酶(tyrosinase)，在氧气存在的条件下，利用L-酪氨酸生成黑色素单体左旋多巴，左旋多巴再经自发反应，生成聚合物——黑色素^{[12, 13]}。酪氨酸酶催化反应需要Cu^{2+[12, 13]}参与。

如图 3所示，通过PCR在melA两端引入与pRS415k的同源臂，与线性pPC016载体1∶1混合，通过QF-Ec-01细胞裂解物催化，在体外组装成质粒pPC016-melA。随机挑取克隆，通过菌落PCR(图 8)获得含有正确组装质粒的菌株，并进行测序验证。结果显示，组装阳性克隆率为90.9%。将菌株BY4741+pPC016-melA和BY4741+pPC016于SD-Ura液体培养基中培养。如图 9所示，含有黑色素合成模块pPC016-melA的酿酒酵母菌株经Cu²⁺诱导后，经过7天的积累，菌体呈褐色，且随着Cu²⁺浓度的增大，菌体颜色逐渐变深。而没有经Cu²⁺诱导的菌株和只含有空载体的对照菌株BY4742+pPC016则只呈现菌体自身的颜色。表明所组装得到的黑色素模块可以在酿酒酵母体内正常表达酪氨酸酶。构建的黑色素合成模块可用于在酿酒酵母中筛选影响L-酪氨酸途径的相关基因。

图 8 菌落PCR验证结果 Fig. 8 The result of melanin expression verification Colonies 1~11 were picked out for testing, and colony12 was the negative control containing plasmid of pPC016.The Marker DNA bands are 5 000bp, 3 000bp, 2 000bp, 1 000bp, 750bp, 500bp, 250bp and 100bp

图选项

图 9 黑色素表达验证结果 Fig. 9 The result of melanin expression verification A~H reprsent BY4741+pPC016melA and BY4741+pPC016 cultured in different conditions for 7 days, and the concentration of Cu2+ added in the culture was labeled on the figure

图选项

3 小 结

本文通过体外片段组装证实了表达λ重组系统的大肠杆菌的细胞裂解物可以进行体外组装，而酿酒酵母和枯草芽孢杆菌的细胞裂解物，在目前实验条件下不能用于体外组装。建立转化子颜色筛选阳性克隆的方法，经过不同组合优化后确定了3组DNA片段组装最适摩尔比例为3∶1，并成功体外组装了可在酿酒酵母中表达的黑色素载体。合成生物学的发展离不开DNA合成组装技术，利用细胞裂解物进行DNA体外组装具有低成本、高效率的特点，适用于大规模的DNA组装实验，如基因合成、载体构建，甚至合成染色体等工作。因此研究提高细胞裂解物体外组装方法对今后生物学的发展有重要的作用。

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