中国生物工程杂志  2015, Vol. 35 Issue (8): 23-29

文章信息

朱志坚, 连凯琪, 杨帆, 张伟, 郑海学, 杨孝朴
ZHU Zhi-jian, LIAN Kai-qi, YANG Fan, ZHANG Wei, ZHENG Hai-xue, YANG Xiao-pu
稳定表达鼠源整联蛋白αvβ6的CHO-677细胞系的构建
Establishment of a Stable CHO-677 Cell Line Expressing Murine αvβ6 Integrin
中国生物工程杂志, 2015, 35(8): 23-29
China Biotechnology, 2015, 35(8): 23-29
http://dx.doi.org/10.13523/j.cb.20150804

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收稿日期：2015-04-30
修回日期：2015-05-19
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朱志坚, 连凯琪, 杨帆, 张伟, 郑海学, 杨孝朴. 稳定表达鼠源整联蛋白αvβ6的CHO-677细胞系的构建[J]. 中国生物工程杂志, 2015, 35(8): 23-29.
ZHU Zhi-jian, LIAN Kai-qi, YANG Fan, ZHANG Wei, ZHENG Hai-xue, YANG Xiao-pu . Establishment of a Stable CHO-677 Cell Line Expressing Murine αvβ6 Integrin[J]. China Biotechnology, 2015, 35(8): 23-29.
稳定表达鼠源整联蛋白αvβ6的CHO-677细胞系的构建
朱志坚1,2,连凯琪2,杨帆2,张伟2,郑海学2 ,杨孝朴1     
1. 甘肃农业大学 动物医学院 兰州 730070;
2. 中国农业科学院 兰州兽医研究所 家畜疫病病原生物学国家重点实验室 兰州 730046
收稿日期:2015-04-30; 修订日期：2015-05-19;
基金项目：国家自然基金资助项目(31302118).
通讯作者, 电子信箱: yangxpu@gsau.edu.cn;haixuezheng@163.com
摘要：口蹄疫是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的一种高度接触性传染病,主要侵害偶蹄动物。乳鼠常作为一种重要的实验动物模型用于FMDV的研究;整联蛋白αvβ6是FMDV的重要受体之一。为深入研究整联蛋白αvβ6在FMDV感染乳鼠中所发挥的作用,克隆了乳鼠整联蛋白αvβ6的两个亚基,并将其导入中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary, CHO-677)基因组中,构建了稳定表达乳鼠整联蛋白αv 和 β6亚基的细胞系CHO-677-mαvβ6,并分别选用两种不同血清型的野生型FMDV毒株Asia1/HN/CHA/06和O/BY/CHA/2010感染细胞系来分析细胞系对FMDV的易感性。首先通过PCR和间接免疫荧光试验证明了细胞系中整联蛋白αvβ6在基因水平成功导入,在蛋白水平成功表达。然后,通过实时荧光定量RT-PCR检测病毒RNA拷贝数,并结合TCID50试验测定了代表毒株在两个细胞上的生长曲线。结果表明,与亲本细胞CHO-677相比,细胞系CHO-677-mαvβ6对FMDV更易感,从αvβ6的功能性上进一步验证了细胞系被成功构建。
关键词： FMDV     整联蛋白受体     αvβ6     细胞系    
Establishment of a Stable CHO-677 Cell Line Expressing Murine αvβ6 Integrin
ZHU Zhi-jian1,2, LIAN Kai-qi2, YANG Fan2, ZHANG Wei2, ZHENG Hai-xue2 , YANG Xiao-pu1     
1. College of Veterinary Medicine, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China;
2. State Key Laboratory of Veterinary Etiological Biology, Lanzhou Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou 730046, China
Abstract:Foot-and-mouth disease (FMD) is a highly contagious disease of domestic and wild cloven-hoofed animals, and its causative agent is FMD virus (FMDV). The suckling mouse is an important experimental animal model for FMDV and integrin αvβ6 is an important receptor of FMDV. In order to further study the role of integrin αvβ6 in FMDV infection for suckling mice, two subunit genes of integrin αvβ6 from suckling mice were cloned and transduced the Chinese hamster ovary 677 (CHO-677) cell line to stably express both suckling mouse integrin subunits αv and β6 (CHO-677-mαvβ6). The presence of αvβ6 in CHO-677-mαvβ6 cell line was detected by PCR and indirect immunofluorescent assay (IFA) at the gene and protein levels, respectively. In order to analyze the susceptibility of FMDV to the cell line, the wild-type strain Asia1/HN/CHA/06 and O/BY/CHA/2010 were used to infect the cell line. Viral RNAs were detected by real-time quantitative RT-PCR. Growth curves of the representative strains in the cell line and its parental cell line were determined by TCID50 assay. The data showed that CHO-677-mαvβ6 cell line was more susceptible to FMDV than the CHO-677 cell line, indicating that CHO-677-mαvβ6 cell line was constructed successfully.
Key words: FMDV     Integrin receptor     αvβ6     Stable cell line    


口蹄疫(foot-and-mouth disease，FMD)是一种感染偶蹄动物的高度接触性传染病，其宿主包括牛、猪、绵羊、山羊等。该病病原为口蹄疫病毒(FMDV)，是小RNA病毒科口蹄疫病毒属的典型成员，至少存在7种血清型，即亚洲1型、A型、O型、C型和南非1、2和3型，且型间无交叉保护性[1, 2] 。FMDV病毒基因是一种单股正链的RNA，大约为8.5 kb，仅含有一个长的开放阅读框，首先被翻译成一个大的多聚蛋白，然后通过自裂解以及蛋白酶3C和L蛋白的作用裂解成4种结构蛋白以及15种非结构蛋白[3, 4, 5, 6]。

识别并吸附细胞表面的受体是病毒起始感染的重要步骤[7]。之前的研究表明，FMDV可以利用4种整联蛋白(αvβ1、αvβ3、αvβ6和αvβ8)感染宿主细胞[8, 9]；细胞培养适应毒株也可以利用硫酸乙酰肝素(heparan sulfate)受体感染宿主细胞[10, 11]；近年来，有研究者证实存在尚未被鉴定的第三类受体[12, 13]。虽然，FMDV具有利用多种受体的能力，但病毒在易感宿主中的复制和感染只与整联蛋白受体有关，其通常表达在表皮细胞上作为病毒的主要受体介导FMDV对宿主的感染[14]。针对最先验证可作为FMDV受体的整联蛋白αvβ3，本实验室前期构建了可稳定表达αvβ3的细胞系，并利用FMDV对其生物学特性进行了验证。然而，研究表明，在FMDV可高效复制的牛上皮细胞表位上表达的是整联蛋白αvβ6而不是αvβ3，αvβ6是决定病毒嗜性的主要受体[15]。并且，多个研究已证明αvβ6是FMDV最有效的受体[16, 17]，因此构建可稳定表达整联蛋白αvβ6的细胞系对研究口蹄疫病毒具有重要的意义。FMDV的自然宿主是牛、猪等，但是乳鼠在实验室常被作为一种重要的实验动物模型，被用于分离野毒、病毒传代以及动物的半数致死剂量(LD50)实验等。因此，在这个研究中我们克隆了乳鼠整联蛋白αvβ6的两个亚基基因，构建到pLVX-Tight-Puro慢病毒载体上，并转入CHO-677细胞，建立了CHO-677-mαvβ6细胞系。CHO-677细胞是一种口蹄疫整联蛋白受体和硫酸乙酰肝素受体都缺失的细胞，使其成为构建稳定表达整联蛋白αvβ6细胞系的最佳选择[12, 18]。最后，我们从基因、蛋白和功能水平上验证了CHO-677-mαvβ6细胞系得以成功构建。

1 材料与方法 1.1 材 料

3日龄SPF级乳鼠(BALB/c小鼠)购自兰州兽医研究所实验动物场。pOK-12、pLVX-Tight-Puro慢病毒载体、BHK-21细胞、293T细胞、鼠源整联蛋白亚基αv和β6以及Asia1/HN/CHA/06毒株和O/BY/CHA/2010毒株的多克隆抗体血清均为本实验室保存；兔抗αv多克隆抗体和兔抗β6多克隆抗体为本实验室前期通过原核表达αv和β6的部分胞外域蛋白并免疫新西兰大白兔制备获得。CHO-677(或pgsD-677; ATCC CRL-2244)细胞购于美国模式培养物保藏中心(ATCC)。Lenti-XTM Tet-Off诱导表达系统购自Clontech公司。抗生素G418 Sulfate(E859)购自Amresco公司；嘌呤霉素(Puromycin)(P9620)购自Sigma公司。

1.2 基因克隆

将3日龄乳鼠安乐处死，解剖取其肺脏和心脏组织，研磨后按照Trizol提取RNA操作说明提取组织RNA，使用反转录酶M-MLV reverse Transcriptase进行反转录，程序为：25℃，10 min； 37℃，1 h；70℃，15 min。然后使用DNA聚合酶LA-Taq version 2.0 plus dye扩增αv和β6的基因[19]。根据GenBank数据库中已公布鼠源αvβ6的参考序列，设计了两对引物αvF和αvR、β6F和β6R。使用梯度PCR扩增，将扩增出来与预期大小相符的条带胶回收纯化，连接pMD-18T载体。然后送北京金唯智公司测序。

1.3 CHO-677-mαvβ6细胞系的建立

我们利用表 1中的引物引入相应的酶切位点，通过pOK-12作为过渡载体，把αv和β6的基因最终连接到pLVX-Tight-Puro载体上，而且IRES作为非帽依赖性元件连接在αv和β6的基因中间，起始β6基因的翻译。最终得到pLVX-mαv-IRES-mβ6质粒，并通过测序验证正确。该质粒和慢病毒系统中的辅助质粒分别被转染293T包装细胞，然后按照1∶1的比例感染CHO-677细胞。用已探索的最佳抗生素G418浓度(500μg/ml)和嘌呤霉素(Puromycin)浓度(4 μg/ml)对转染后的CHO-677细胞进行连续加压筛选，最终形成单克隆并进行扩大培养，得到的细胞系被命名为CHO-677-mαvβ6。

表 1 进行RT-PCR或PCR扩增的引物信息 Table 1 Primer used for RT-PCR or PCR amplification
NameSequence(5′ →3′ )a,b Genome position
αvF

αvR

β6F

β6R

IRESF

IRESR

pL-αvF

pL-αvR

pL-β6F

pL-β6R		ATGGCTGCTCCCGGGCGC

TCAGGTTTCAGAGTTTCCT

ATGGGGATTGAGCTGGTCTG

CTACCCATCTGAGGAAAGGCCT

CTAGCTAGCGCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAA

CGGGCGGCCGCTGTGGCCATATTATCATCGTGT

TTTGCGGCCGCGCCACCATGGCTGCTCCCGGGCGC

CTAGCTAGCTCAGGTTTCAGAGTTTCCTTCGCCATT

CGGTCTAGAGCCACCATGGGGATTGAGCTGGTCTG

TCGACGCGTCTACCCATCTGAGGAAAGGCCT		1-18

3117-3135

1-20

2343-2364

1-25

562-584

1-18

3117-3143

1-20

2343-2364
a: Red letters represent restriction enzyme site; b: Blue letters represent the Kozak sequence
表选项
1.4 CHO-677-mαvβ6细胞系的鉴定

为了检测小鼠αv和β6基因是否被导入CHO-677细胞中并得到表达，分别从基因和蛋白水平两个方面对CHO-677-mαvβ6细胞系进行了检测。同时，考虑到细胞系的遗传稳定性，在细胞系传至20代后，进行重复检测。

1.4.1 基因水平检测

提取细胞系的总RNA，进行反转录，用αvF和αvR、β6F和β6R分别扩增αv和β6亚基的基因，对扩增产物进行电泳分析，并连接到pMD-18T载体上进行测序。

1.4.2 蛋白水平检测

通过间接免疫荧光技术对细胞系CHO-677-mαvβ6中异二聚体整联蛋白的表达情况进行鉴定[20]。具体过程如下，将构建好的细胞系细胞铺于6孔板中培养36 h，待细胞长至约50%单层，用4%的多聚甲醛固定30 min，并用0.1%的TritonX-100通透25 min，随后用5%的牛血清蛋白在室温封闭1 h；用TBST漂洗3次，加入兔抗αv多克隆抗体(1∶50)和兔抗β6单克隆抗体(1∶50)37℃孵育1 h，用TBST洗3次；再用异硫氰酸荧光素标记的山羊抗兔二抗(1∶400)在室温分别避光孵育2 h，用TBST洗3次，加入4,6-二氨基-2-苯茚二酮(DAPI)染核15 min。最后用奥林巴斯BX-40荧光显微镜获取荧光图片进行分析。

1.5 CHO-677-mαvβ6细胞系功能性鉴定

为了验证该细胞系表达mαvβ6的功能活性，在细胞系稳定传至20代后，通过FMDV感染进一步鉴定该细胞系。选用FMDV Asia1/HN/CHA/06株和O/BY/CHA/2010株感染该细胞系CHO-677-mαvβ6及其亲本细胞CHO-677，并进行病毒RNA、病毒蛋白和病毒滴度的检测。

1.5.1 病毒RNA检测

为确定病毒Asia1/HN/CHA/06和O/BY/CHA/2010在CHO-677-mαvβ6和CHO-677两种细胞系上的复制水平，将传20代稳定之后的两种细胞接6孔板，培养过夜至细胞单层长满培养孔，用PBS洗2次，分别加入1 ml的病毒液(感染复数MOI=1)，5% CO2、37℃的培养箱中孵育1 h，吸弃病毒液，加入2 ml新鲜培养基(含2% FBS的DMEM培养基)，5% CO2、37℃的培养箱中分别培养12 h、24 h、36 h、48 h和60 h后收取样品，利用Trizol法提取细胞样品中的总RNA，并依照两步法Prime Script RT-PCR操作说明进行实时荧光定量RT-PCR。FMDV的复制水平利用标准曲线函数y = －3.416log(x) + 42.85进行计算[21]。

1.5.2 病毒生长曲线测定

通过TCID50进一步检测两种血清型的毒株在细胞系CHO-677-mαvβ6和其亲本细胞CHO-677上的感染能力。细胞处理如上所述，收取不同时间点的样品后，反复冻融2～3次，离心取上清在BHK-21细胞上测定不同时间点收获病毒的TCID50，绘制病毒生长曲线。利用Reed-Muench法计算TCID50。每组实验分别重复3次测TCID50，取其平均值绘制生长曲线。

1.6 统计分析

以GAPDH基因为内参对照，采用2－△△Ct法对荧光定量RT-PCR进行统计，利用SPSS19.0软件进行数据处理，分析差异显著性。结果以“平均值±标准误”表示，P＜0.05为差异显著性标准。

2 结 果 2.1 αv和β6亚基基因的扩增

以提取的乳鼠组织总RNA为模板，进行反转录。以获得的cDNA为模板，用设计的引物对αvF和αvR、β6F和β6R扩增αv和β6的基因，扩增产物大小约为3 135和2 364 bp，与预期的目的片段大小相符，连接pMD-18T载体送公司测序，结果表明成功克隆了鼠源αv和β6的基因(图 1)。

图 1 乳鼠整联蛋白αv和β6亚基PCR扩增产物电泳结果 Fig. 1 PCR products from suckling mouse integrin subunits αv and β6 were electrophoresed through 1.0% agarose gels (a) The PCR product of β6 (2364 bp) gene (b) PCR product of αv (3135 bp) gene M: DL5000 DNA Marker
图选项
2.2 重组质粒pLVX-mαv-IRES-mβ6的鉴定

以重组质粒pLVX-mαv-IRES-mβ6为模板，PCR扩增出与目的片段大小相符的条带，而以pLVX-Tight-Puro为模板没有扩增出合适的片段(图 2)。测序结果表明，目的基因已成功插入pLVX-Tight-Puro表达载体，且开放阅读框完全正确。

图 2 重组质粒pLVX-mαv-IRES-mβ6的PCR鉴定结果 Fig. 2 Identification of the recombinant plasmid pLVX-mαv-IRES-mβ6 by PCR (a) The PCR products amplified of αv (lane 1) and β6 (lane 2) genes from pLVX-αv-IRES-β6 (b) The PCR product of IRES gene (lane 3). Molecular weight marker fragment (TaKaRa) was in lane M
图选项
2.3 CHO-677-mαvβ6细胞系的鉴定

用PCR和间接免疫荧光技术从基因和蛋白水平检测CHO-677-mαvβ6细胞系中的αv和β6整联蛋白亚基。细胞系传20代稳定之后，用PCR检测αv和β6基因，结果与预期一样，能够检测出目的条带,且扩增出的目的片段连接T载体测序后，序列与插入的基因相符(图 3a)。然后，用间接免疫荧光检测细胞系CHO-677-mαvβ6中异二聚体整联蛋白的表达情况。结果显示，CHO-677-mαvβ6细胞系中能够检测到高强度荧光，并且绿色荧光均匀致密地分布于细胞核以外区域，说明外源蛋白αvβ6主要表达在细胞膜及细胞质内；而亲本细胞CHO-677中仅出现微弱的荧光(图 3b)，这可能是非特异性反应的结果。进一步表明αv和β6基因已经成功导入重组细胞并能稳定表达。

图 3 细胞系CHO-677-mαvβ6的鉴定结果 Fig. 3 Identification of CHO-677-mαvβ6 cell line (a) Detection of integrin subunit αv and β6 genes in CHO-677-mαvβ6 cell line at the twentieth passages by PCR,The PCR products of αv gene (lanes 2,3) and β6 gene (lanes 5,6) are shown in CHO-677-mαvβ6 cell line,lanes 1and 7 are the negative control of αv gene and β6 gene,respectively. Molecular weight marker (TaKaRa) in lane M (b) Expression of integrin subunits αv and β6 in CHO-677-mαvβ6 cell line at the twentieth passages by IFA Photographs were taken at a magnification of 40 fold. One representative experiment is shown
图选项
2.4 CHO-677-mαvβ6细胞系功能性鉴定

为了研究CHO-677-mαvβ6细胞系的功能特点，用FMDV的两种血清型毒株Asia1/HN/CHA/06和O/BY/CHA/2010感染CHO-677-mαvβ6细胞和CHO-677亲本细胞，分析了FMDV对细胞的易感性。为了分析病毒在两种细胞中的复制能力，用不同时间点收获的两种病毒上清进行实时荧光定量RT-PCR实验。结果表明，亲本细胞CHO-677中两种病毒的RNA复制水平均比细胞系CHO-677-mαvβ6低，并具有显著差异(表 2、表 3、图 4a和图 5a)。同时对两种毒株在两种细胞上的生长曲线进行比较，将不同时间点收获的上清液在BHK-21细胞上测定TCID50，然后根据不同时间点的TCID50绘制出病毒生长曲线，结果表明Asia1/HN/CHA/06毒株和O/BY/CHA/2010毒株在细胞系CHO-677-mαvβ6上的生长曲线明显高于亲本细胞CHO-677，并且在24 h、36 h、48 h和60 h具有显著差异(表 2、表 3、图 4b和图 5b)。FMDV RNA拷贝数和生长曲线两种生物学特性显示，细胞系CHO-677-mαvβ6比亲本细胞CHO-677对FMDV更易感，这说明鼠源整联蛋白αvβ6的导入增加了CHO-677-mαvβ6对FMDV的易感性，进一步证实了细胞系CHO-677-mαvβ6得以成功构建。

表 2 FMDV Asia1/HN/CHA/06株感染两种细胞的RNA拷贝数/TCID50检测结果 Table 2 The RNA copy number and TCID50 of FMDV Asia1/HN/CHA/06 in CHO-677-mαvβ6 and CHO-677 cells
Time (h)ReplicatesRNA copy number / TCID50
CHO-677-mαvβ6CHO-677
1235.62±0.2a/2.50±0.104.49±0.27b/2.41±0.1
2436.08±0.25a/3.00±0.12a4.87±0.31b/2.57±0.12b
3636.42±0.30a/3.20±0.12a5.03±0.29b/2.80±0.08b
4836.89±0.21a/3.59±0.09a5.29±0.33b/3.20±0.10b
6036.97±0.24a/2.80±0.13a5.52±0.35b/2.59±0.13b
7237.07±0.28a/2.57±0.175.67±0.28b/2.50±0.12
a,b. Values with different superscripts within the same row differ significantly (P﹤0.05). The same as below
表选项

表 3 FMDV O/BY/CHA/2010株感染两种细胞的RNA拷贝数/TCID50检测结果 Table 3 The RNA copy number and TCID50 of FMDV O/BY/CHA/2010 in CHO-677-mαvβ6 and CHO-677 cells
Time (h)ReplicatesRNA copy number / TCID50
CHO-677-mαvβ6CHO-677
1235.92±0.41a/1.80±0.184.49±0.36b/1.50±0.14
2437.08±0.30a/3.57±0.20a5.87±0.38b/2.33±0.16b
3638.41±0.35a/3.80±0.19a6.03±0.44b/3.00±0.21b
4838.89±0.38a/4.57±0.21a6.29±0.42b/3.57±0.24b
6039.57±0.36a/4.80±0.20a6.52±0.39b/3.80±0.19b
72310.07±0.43a/4.41±0.156.67±0.37b/4.00±0.20
表选项

图 4 FMDV Asia1/HN/CHA/06株在CHO-677-mαvβ6和CHO-677 细胞系中的生长特点 Fig. 4 Growth characteristics of FMDV Asia1/HN/CHA/06 strain in CHO-677-mαvβ6 and CHO-677 cells (a) The levels of viral RNA replication dynamics were determined in infected CHO-677-mαvβ6 cells at different time points by real-time PCR Copy numbers of FMDV were calculated using the standard curve function [y = －3.416log(x) + 42.85] (b) Single-step growth curves of Asia1/HN/CHA/06 in CHO-677-mαvβ6 and CHO-677 cells
图选项

图 5 FMDV O/BY/CHA/2010株在CHO-677-mαvβ6和CHO-677 细胞系中的生长特点 Fig. 5 Growth characteristics of FMDV O/BY/CHA/2010 strain in CHO-677-mαvβ6 and CHO-677 cells (a) The levels of viral RNA replication dynamics were determined in infected CHO-677-mαvβ6 cells at different time points by real-time PCR Copy numbers of FMDV were calculated using the standard curve function [y = －3.416log(x) + 42.85] (b) Single-step growth curves of O/BY/CHA/2010 in CHO-677-mαvβ6 and CHO-677 cells
图选项
3 讨 论

口蹄疫作为一种高度感染性传染病，它的爆发严重影响着国家和地区的经济发展，对肉制品安全产生重大威胁。由于其病原FMDV的宿主范围广，变异频率高，对多种动物健康状况和生产能力的影响持久，使其成为一种具有重要经济意义的动物疫病[22, 23]。病毒的细胞表面受体在其宿主范围和组织嗜性中起着重要的作用。牛、猪以及野生偶蹄类动物是FMDV的自然宿主，然而乳鼠是FMDV实验室研究中重要的模型动物，具有很多优点，如便于操作、节约饲养空间和经费等。先前关于整联蛋白受体的研究主要集中在FMDV自然宿主牛和猪等牲畜上，而乳鼠作为FMDV的重要模式动物，且鼠源整联蛋白与猪或牛源整联蛋白有着高度的同源性，所以对乳鼠整联蛋白的研究具有重要的意义。另外，试验中用于构建细胞系的靶标细胞CHO-677不表达整联蛋白受体(αvβ1、αvβ3、αvβ6和αvβ8)和硫酸乙酰肝素受体[12]，有助于对细胞系的验证；并且，成功构建后的细胞系CHO-677-mαvβ6用于研究整联蛋白αvβ6作为受体在FMDV感染中所发挥的作用时具有更强的特异性。

本文首先克隆了乳鼠整联蛋白αvβ6的基因，构建表达αvβ6的慢病毒载体，然后与辅助质粒共转染293T包装细胞，包装成慢病毒颗粒，再感染靶标细胞，经过抗生素筛选获得单克隆细胞系CHO-677-mαvβ6，通过PCR和间接免疫荧光实验从基因和蛋白水平检测了该细胞系，最后用FMDV感染，验证了该细胞系的功能。结果显示，该细胞系比亲本细胞更易感FMDV，证实我们成功构建了细胞系CHO-677-mαvβ6。为深入研究整联蛋白αvβ6作为病毒受体所发挥的功能及生物学意义提供了基础和平台。

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稳定表达鼠源整联蛋白αvβ6的CHO-677细胞系的构建
朱志坚,连凯琪,杨帆,张伟,郑海学 ,杨孝朴