骨髓造血功能衰退将导致机体血细胞生成障碍、免疫功能低下、肿瘤发生率增加、重要脏器结构与功能衰退，最终加快机体衰老和促进多种老年性疾病发生^[1]。迄今，骨髓功能衰退机理仍不明确，临床上尚无有效的防治手段。人参是中医临床“补气”要药，人参皂苷Rg1(ginsenoside Rg1)是人参的重要抗衰老成分^[2]。本课题组最新研究表明，造血干细胞是所有髓系和淋巴系细胞的始祖细胞，人参皂苷Rg1能延缓造血干/祖细胞衰老^[3]。由此推测，人参皂苷Rg1可以用于临床防治骨髓功能衰退，但这需要对其作用和相关机理进行研究。本文复制D-半乳糖大鼠衰老模型，探讨人参皂苷Rg1对衰老模型大鼠骨髓造血功能的影响及其机理，旨在为寻找延缓骨髓造血功能衰退的天然药物提供理论和实验依据。

3月龄清洁级雄性SD大鼠40只，体重180~200g，由重庆医科大学实验动物中心提供[合格证号SCXK(渝2007-0001)]。饲养条件控制在20℃~25℃，自然照明，自由饮水和摄食。

人参皂苷Rg1(吉林宏久生物技术有限公司，纯度≥98.6%)；D-半乳糖(Sigma公司)；RPMI-1640培养基(Gibco公司)；混合集落甲基纤维素半固体培养基(Stem Cell Technologies公司)；胎牛血清(Hyclon公司)；CCK-8试剂盒(上海七海复泰生物公司)；衰老相关β-半乳糖苷酶试剂盒(SA-β-Gal，碧云天公司)；P53、P21兔抗鼠多克隆抗体(Prointech公司)；羊抗兔二抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司)；AGEs试剂盒(美国RD公司)。

SD大鼠随机分为4组，每组10只。衰老模型组：皮下注射D-半乳糖120mg/kg qd×42；Rg1衰老模型组，注射D-半乳糖剂量与时间同衰老模型组，第15d起腹腔注射Rg1 20mg/kg qd×28；正常对照组：注射等量与等时生理盐水；Rg正常对照组：注射等量生理盐水qd×14，第15d起腹腔注射Rg1(同Rg1衰老模型组)。药物注射完成后第2d检测各项指标。

采集外周血制备血清，运用AGEs试剂盒检测血清AGEs水平。取大鼠尾静脉血20μl，全自动血细胞分析仪检测外周血白细胞及分类。肝素制备抗凝血，加NH₄Cl孵育抗凝血10min破坏红细胞，离心去上清，BSA-PBS洗涤2次，调整细胞浓度为5×10⁶个/ml，流式细胞仪术检测外周血CD8⁺T细胞与CD4⁺T细胞比例。

无菌条件下取股骨，RPMI-1640培养液冲出骨髓细胞，通过4号针头制备骨髓单个核细胞(BMNCs)悬液。淋巴细胞分离液与细胞悬液按5∶2的比例，2 000g，20min分离并计数每只股骨的BMNCs。收集各组BMNCs 1×10⁴个加混合集落培养基0.5 ml充分混匀，接种于24孔板，在5% CO₂、37℃培养箱中培养10d，根据CFU-Mix形成数量评价各组BMNCs的多向分化能力^{[7, 8]}。

取各组大鼠BMNCs悬液，SA-β-Gal染色固定液室温固定15min,PBS液洗涤3次，加SA-β-Gal染色液，置37 ℃培养箱中孵育12~16h。显微镜下随机计数400个细胞，观察蓝色阳性细胞，计算各组大鼠衰老BMNCs的百分比。

提取各组BMNCs总蛋白，调整蛋白浓度40μg/泳道，12% SDS-PAGE凝胶电泳分离，移至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭2h，加入P53、P21一抗(按1∶200比例稀释)、β-actin抗体(按1∶4 000比例稀释)，4℃孵育过夜，辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(按1∶5 000比例稀释)室温孵育2h，洗膜，ECL发光系统显色，用FluorS^TM Multimager 图像分析仪，Quality-One4.11软件进行图像灰度扫描处理。

向大鼠腹腔内注入预冷的10 ml的PBS，轻揉腹部 3~5min,用吸管收集腹腔渗出液，1 000 r/min 离心5min，PBS液洗涤细胞3次，调整细胞浓度至5×10⁶个/ ml，加入96 孔板中(100μl/孔)，在含15％灭活胎牛血清的DMEM培养液、37℃、5％ CO₂条件下孵育贴壁 2 h。孵育结束后弃上清液，加入2mg/ml 的中性红溶液(200μl/孔)，再置 37℃、5％ CO₂培养3h，弃中性红溶液，PBS 冲洗3次,每孔加入细胞裂解液(50％ 乙酸与50％ 无水乙醇配制)200μl，室温下放置24h，492 nm波长下测定吸光度。

运用 SPSS 软件进行实验数据统计学处理，采用析因设计、单因素方差分析方法，资料以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用t检验。

结果表明，与正常对照组比较，衰老模型组白细胞数(P＜0.05)(图 1)、淋巴细胞数(P＜0.01)(图 2)和CD4⁺T细胞所占比例(P＜0.05)(图 2)明显下降，粒细胞数(P＜0.05)(图 2)和CD8⁺T细胞所占比例(P＜0.05)(图 2)显著上升；与衰老模型组比较，Rg1衰老模型组白细胞数(P＜0.05)(图 1)、淋巴细胞数(P＜0.05)(图 2)和CD4⁺T细胞所占比例(P＜0.05)(图 2)显著增加，粒细胞数(P＜0.05)(图 2)和CD8⁺T细胞所占比例(P＜0.05)(图 2)显著降低。

图 1 人参皂苷Rg1对衰老大鼠外周白细胞计数的影响(x±s，n=10) Fig. 1 Effect of Rg1 on count of peripheral blood leucocytes of aging model rats(x±s，，n=10) 1)：Compared with normal control P＜0.05；2)：compared with aging model P ＜0.05,n=10

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图 2 人参皂苷Rg1对衰老大鼠外周白细胞分类计数及CD4+T细胞与CD8+T细胞计数的影响(x±s，n=10) Fig. 2 Effect of Rg1 on classification of peripheral blood leucocytes and ratio of CD4+ T lymphocytes and CD8+ T lymphocytes of aging model rats(x±s，，n=10) Compared with normal control 3)：P＜0.01；1)：P＜0.05；Compared with aging model 2)：P ＜0.05,n=10

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衰老模型组外周血晚期糖基化终末产物高于正常组(P＜0.05)(图 3)，Rg1衰老模型组外周血晚期糖基化终末产物低于衰老模型组(P＜0.05)(图 3)。

图 3 人参皂苷Rg1对衰老大鼠外周血晚期糖基化终末产物的影响 Fig. 3 Effect of Rg1 on amount of AGEs in serum of aging model rats(x±s，n=10) 1)：Compared with normal control P＜0.05；2)：Compared with aging model P ＜0.05,n=10

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结果表明，衰老模型组较正常对照组大鼠BMNCs计数显著减少(P＜0.05)(表 1)，Rg1衰老模型组较衰老模型组大鼠BMNCs计数显著提升(P＜0.05)(表 1)。

BMNCs胞浆呈蓝色为SA-β-Gal阳性细胞，着色深浅与着色数量与BMNCs衰老程度呈正相关(图 4)。结果显示：Rg1对照组SA-β-Gal阳性BMNCs数较正常对照组明显减少(P＜0.05)(图 5)，衰老模型组SA-β-Gal阳性BMNCs数与正常对照组比显著增多(P＜0.05)(图 5)，Rg1衰老模型组SA-β-Gal阳性细胞数与衰老模型组比明显减少(P＜0.05)(图 5)。

图 4 人参皂苷Rg1对衰老大鼠SA-β-Gal染色阳性BMNCs的影响(SA-β-Gal染色×400),n=10 Fig. 4 Effect of Rg1 on the number of SA-β-Gal positive BMNCs of aging model rats,n=10 A: Control group; B:Rg1 control group; C: Aging model group; D: Rg1 aging model group

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图 5 人参皂苷Rg1对衰老大鼠BMNCsSA-β-Gal染色阳性百分率影响 Fig. 5 Effect of Rg1 on the ratio of SA-β-Gal positive BMNCs of aging model rats 1)：Compared with normal control P＜0.05；2)：Compared with aging model P＜0.05,n=10

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结果表明，衰老模型组大鼠BMNCs形成CFU-Mix能力较正常对照组明显下降(P＜0.01)(图 6、图 7)，Rg1衰老模型组大鼠BMNCs形成CFU-Mix能力较衰老模型组显著提升(P＜0.05)(图 6、图 7)。

图 6 人参皂苷Rg1对衰老大鼠BMNCs形成CFU-Mix能力的影响(x±s，n=10) Fig. 6 Effect of Rg1 on the formation of CFU-Mix of BMNCs of aging rats(x±s，n=10)

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图 7 人参皂苷Rg1对衰老大鼠BMNCs形成CFU-Mix能力的影响 Fig. 7 Effect of Rg1 on the number of CFU-Mix in BMNCs of aging rats(x±s，n=10) 3)：Compared with normal control P＜0.01；2)：Compared with aging model P＜0.05，n=10

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结果表明，衰老模型组较正常对照组大鼠BMNCs中 P21、p53蛋白表达上升(P＜0.05)(图 8，表 2)，Rg1衰老模型组较衰老模型组BMNCs中P21、P53蛋白表达量降低(P＜0.05)(图 8，表 2)。

图 8 人参皂苷Rg1对衰老大鼠BMNCs表达P21、P53蛋白的影响 Fig. 8 Effect of Rg1 on expression of P21，P53 in BMNCs of aging rats 1： Rg1 aging model； 2：Aging model； 3：Control group； 4：Rg1 control,n=4

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结果表明，衰老模型组大鼠巨噬细胞吞噬中性红指数明显低于正常对照组(P＜0.01)(图 9)，给衰老大鼠注射人参皂苷Rg1后，巨噬细胞吞噬中性红指数明显增高(P＜0.05)(图 9)。

图 9 人参皂苷Rg1对衰老大鼠巨噬细胞吞噬中性红吞噬指数的影响 Fig. 9 Effect of Rg1 on phagocytic index of aging rats 3)：Compared with normal control P＜0.01；2)：Compared with aging model P＜0.05,n=10

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随着人口老年化进程加快和在肿瘤治疗中广泛使用抗肿瘤化学药物，骨髓造血功能衰退的发生率日渐增多。迄今，骨髓功能衰退的机制不清楚,临床治疗更无有效手段。因此深入研究骨髓造血功能衰退的生物学机制，为其临床防治相关疾病提供理论与实验室依据极为重要。人参是中医临床的“补气”要药，人参皂苷Rg1是其重要的药效成分。我们最新研究证明^{[2, 3]}，人参皂苷Rg1是人参调控细胞衰老的重要成分，它既能延缓造血干/祖细胞细胞衰老，还能促进白血病干细胞衰老等作用，而造血干细胞是髓系和淋巴系细胞的始祖细胞。中医理论认为，骨髓造血功能衰退属于“气血双虚”症候，我们推测人参皂苷Rg1可以用于临床防治骨髓造血功能衰退。本文采用D-半乳糖复制大鼠衰老模型，探讨人参皂苷Rg对衰老模型大鼠骨髓造血功能的影响及其机理，旨在为寻找延缓骨髓造血功能衰退的天然药物提供理论和实验依据。

D-半乳糖(D-gal)致衰老模型是迄今公认的氧化损伤衰老动物模型。β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色是鉴定细胞衰老的重要生物学标志。晚期糖基化终末产物(advanced glycosylation end products,AGEs)是非酶糖基化反应的终产物，可作为测试老化进程的时钟^[9]。 巨噬细胞起源于骨髓粒-巨噬细胞祖细胞(CFU-GM)，它参与机体非特异性免疫和特异性免疫应答的调节，其功能能间接反映骨髓造血细胞功能状况^[10]。本研究采用D-半乳糖连续皮下注射大鼠42天，观察大鼠骨髓功能。实验结果表明，衰老大鼠外周血晚期糖基化终末产物和SA-β-Gal 染色阳性的BMNCs百分率显著增加,每根股骨的BMNCs数和BMNCs形成混合造血祖细胞集落(CFU-Mix)能力明显降低，外周血白细胞总数量减少，淋巴细胞比例下降，粒细胞比例上升，同时衰老模型大鼠的巨噬细胞吞噬中性红指数显著下降，这些结果符合骨髓功能衰退的生物学特征。本研究结果证明D-半乳糖连续注射可成功建立大鼠骨髓造血功能衰退模型。

我们给骨髓造血功能衰退大鼠注射人参皂苷Rg1(20mg/kg qd×28)。结果表明，大鼠外周血晚期糖基化终末产物和SA-β-Gal 染色阳性的BMNCs百分率显著下降，每根股骨的BMNCs数和BMNCs形成混合造血祖细胞集落(CFU-Mix)能力明显上升，淋巴细胞比例升高，粒细胞比例降低，CD8⁺T细胞所占比例降低，CD4⁺T细胞所占比例升高，同时大鼠的巨噬细胞吞噬中性红指数显著上升。以上结果说明人参皂苷Rg1可以拮抗D-gal对骨髓造血细胞的致衰老作用，可以用于临床防治骨髓功能衰竭。

衰老相关信号通路对阐释衰老分子机制有重要理论意义，调控衰老信号通路对延缓或促进细胞衰老有重要应用价值。p53/p21通路据认为是细胞衰老的重要途径^[11]，p21 是p53下游的主导基因，也是p53的直接靶基因，p53活化后p21转录增加，高水平的p21抑制周期蛋白依赖性蛋白激酶(CDK)的活性，使细胞停滞在G1期，诱发细胞衰老，因此上调p53/p21的活性将引发细胞衰老^{[12, 13]}。本文我们给衰老大鼠注射人参皂苷Rg1可使BMMCs表达P53与P21蛋白水平有所下降，提示人参皂苷Rg1可通过下调p53/p21信号通路拮抗D-半乳糖所致大鼠骨髓造血衰退。

综上所述，人参皂苷Rg1可以拮抗D-gal对骨髓造血细胞的致衰老作用，其机理与下调p53/p21通路有关。本实验结果提示人参皂苷Rg1可以用于临床骨髓造血功能衰退的防治。