2型猪链球菌(Streptococcus suis serotype 2,S. suis2)作为一种人畜共患病病原体，分别于1998年、2005年在我国江苏和四川两省暴发了大规模的S. suis2感染猪和人的公共卫生事件，在患者中出现了国内外罕见的链球菌中毒性休克综合征(streptococcal toxic shock syndrome，STSS)^[1]。除此之外，S.suis2还可导致人和猪患脑膜炎、急性败血症、心内膜炎、关节炎及猝死^[2]。S.suis2的致病性与毒力因子有着非常密切的关系，常见的毒力相关因子主要有荚膜多糖(capsular polysaccharide，CPS)、胞外因子(extracellular factor，EF)、溶菌酶释放蛋白(muraminidase released protein，MRP)、纤连蛋白结合蛋白(fibronectin-binding protein，FBP)、溶血素(suilysin，SLY)等^{[3, 4, 5, 6]}。

然而，上述毒力相关因子多从单一组分进行研究，不能有效地解析和评估各毒力因子之间可能的相互作用，从而导致分离于某些特定S. suis2菌株的毒力相关因子却在其他S. suis2菌株中得到与致病性无关的结果。例如，CPS，它就同时存在于强毒株，弱毒株和非致病性菌株中^[7]。细菌在生存、代谢和致病等生命过程中的调控是复杂而有序的，细菌主要是通过非常精密的信号系统来感受并且响应外部环境(宿主)的改变，从而在不同的生命阶段(或感染阶段)和营养条件下，对不同的毒力基因进行调控表达，完成其侵袭、定植及致病等过程。为了进一步阐明S. suis2的致病机制，明白转录调控因子如何调控毒力因子是至关重要的。

在猪链球菌中MocR家族是一类重要的转录调节因子，调节多种生物学过程。MocR为GntR的亚家族。GntR具有非常保守的拓扑结构，在N端的69个氨基酸残基区域内氨基酸序列及其相似，并且形成保守的螺旋-转角-螺旋(helix-turn-helix，HTH)DNA结合区域，其C端则为高度分化的效应物/寡聚作用域(effector binding and oligomerization,E-b/O)^[8]，并以此将GntR进一步分类为6个亚家族：FadR、MocR、HutC、YtrA、AraR和PlmA^{[9, 10, 11]}，MocR的C端则为一个假定的氨基酸转移酶结构域，能够结合维生素B₆辅酶-磷酸吡哆醛(pyridoxal 5′- phosphate，PLP)^[12]。MocR与氨基酸转移酶第一类基团同源^[13]。转移酶以磷酸吡哆醛(PLP)作为辅因子，催化氨基基团从氨基酸底物可逆性转移到α-酮酸上。转移反应是氨基酸代谢最重要的一步，因此，MocR亚家族很可能参与调节猪链球菌中氨基酸代谢，并且可能和碳水化台物、脂肪代谢有关。

本课题组前期已完成2型猪链球菌强毒株05ZYH33全基因组的测序和注释。通过基因组注释分析发现SSU0562编码蛋白具有DNA结合位点及PLP结合位点，推测其可能属于MocR家族。目前，尚无针对2型猪链球菌中MocR家族的研究报道，为探索MocR家族在05ZYH33中的调控作用，本文构建了S.suis2强毒株05ZYH33的MocR家族转录调控因子SSU0562基因突变株Δ0562，并对其生物学特性及毒力进行了系统性分析。

本实验所用的菌株、质粒及引物见表 1，引物由上海赛百胜基因技术有限公司合成。

DNA限制性内切核酸酶、Ex-Taq DNA聚合酶、T4DNA连接酶、RNA反转录试剂盒及质粒DNA抽提试剂盒均购自TaKaRa公司；蛋白酶K购自Merck公司；RNA提取试剂盒、胶回收试剂盒购自Promega公司；Todd-Hewitt Broth(THB)培养基购自Difco公司；Ultraspec 2000型紫外分光光度计购自Pharmacia公司;Gene Pulser X Cell TM型电穿孔仪购自Bio-Rad公司。

BALB/c雌性小鼠,SPF级,4周龄,购自军事医学科学院实验动物中心。

(1)重组敲除质粒PUC-LSR的构建。以05ZYH33基因组为模板，分别以引物L1/L2、R1/R2进行PCR扩增SSU0562编码基因的上下游片段L及R；同时以pSET2质粒为模板，用引物Spc1/Spc2进行PCR扩增壮观霉素抗性基因Spcr(Spcrcasstte)。利用双酶切及T4 DNA连接酶将它们依次克隆到pUC19载体上，形成一个Spc^r基因两侧具有与SSU0562基因上下游同源序列的重组敲除质粒pUC-LSR(图 1)。

图 1 SSU0562基因敲除载体示意图 Fig. 1 Construction of plasmid pUC19-LSR

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(2)基因敲除突变株Δ0562的筛选。参照Smith等^[14]的方法略作改动制备05ZYH33感受态细菌，设置电转参数2 250V/cm、200Ω和25uF，用构建好的重组质粒pUC19-LSR电转化制备好的05ZYH33感受态细菌，电转化结束后37℃、160r/min振荡孵育2h后，将菌液涂布于THB平板(含有100μg/ml壮观霉素)，37℃培养48h，挑取所有的单菌落于THB培养基(含有100μg/ml壮观霉素)中培养，之后用SSU0562基因内引物IN1/IN2进行PCR初步筛选,对疑似阳性菌用引物OUT1/Spc2、Spc1/Spc2、Spc1/OUT2进行组合PCR进一步验证。

(3)RT-PCR鉴定。利用RNA提取试剂盒提取野生株05ZYH33及突变株Δ0562的RNA，将提取的RNA反转录成cDNA，并利用SSU0562基因内部引物IN1/IN2对cDNA进行鉴定。

(1)形态结构和溶血活性。为比较野生株和突变株之间生长状态的差异，采用了分区划线法，将野生株05ZYH33和突变株Δ0562分别涂布于THB血平板(含5%绵羊血)，37℃孵育24h，观察菌落的形态及溶血活性。

(2)生长曲线的绘制。在相同培养条件下，取等量的野生株05ZYH33和突变株Δ0562接种于THB培养基中，37℃振荡培养，每隔1h测OD₆₀₀值，重复实验3次并绘制生长曲线。

(3)革兰氏染色。根据绘制的生长曲线，将野生株05ZYH33和突变株Δ0562在THB培养基中37℃培养至对数中期，然后分别取样对其进行革兰氏染色，在普通光学显微镜下观察菌落形态。

将20只SPF级BALB/c小鼠随机分成2组，每组10只。从THB平板上挑取野生株和突变株的单菌落，转接于THB液体培养基中过夜培养，次日以1∶50的比例接种于新鲜THB中，当生长至OD₆₀₀=0.4时，取1ml突变株和野生株腹腔注射小鼠各10只(1×10⁸CFU/只)，每日2次观察记录小鼠发病及死亡情况，观察1周。

PUC19-LSR的验证构建基因敲除质粒pUC19-LSR，并对其进行不同引物对(L1/L2、Spc1/Spc2、R1/R2、L1/Spc2、Spc1/R2、L1/R2)的PCR扩增,得到的片段大小和理论值一致，结果见图 2(a)。对敲除质粒进行双酶切验证，各组酶切产物大小均与理论预期值吻合，双酶切产物出现6条相应的核酸片段[图 2(b)]。pUC19-LSR测序结果显示L、R和Spc^r片段连接次序均正确，证实重组质粒构建成功。

图 2 PUC19-LSR交叉PCR及双酶切验证 Fig. 2 Multiple-PCR analysis and restriction enzyme digesting of the recombinant plasmid pUC19-LSR (a) Multiple-PCR analysis M: 250bp DNA marker; 1: PCR products with L1/L2; 2: PCR products with Spc1/Spc2; 3: PCR products with R1/R2; 4: PCR products with L1/Spc2; 5: PCR products with Spc1/R2; 6: PCR products with L1/R2 (b) Restriction enzyme digesting M: 250bp DNA marker 1: Digested by EcoRI and BamHI; 2: Digested by BamHI and PstI; 3: Digested by PstI and HindIII; 4: Digested by EcoRI and PstI; 5: Digested by BamHI and HindIII; 6: Digested by EcoRI and HindIII

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基因敲除的筛选和鉴定挑取电转化后的单菌落振荡培养，用引物IN1/IN2进行PCR扩增验证。IN1/IN2位于SSU0562基因内部(产物大小为780bp)，如果SSU0562基因被成功敲除将得到阴性结果；反之，则得到阳性结果。通过上述方法初步筛选后，发现两株扩增结果为阴性[图 3(a)]，泳道3、7的疑似敲除菌株。然后对PCR初步筛选得到的疑似敲除株进行组合PCR扩增，基于同源重组原理，如果SSU0562基因位点被Spc^r基因所取代，则用引物Out1/Spc2、Spc1/Spc2、Spc1/Out2进行PCR扩增，其大小将分别为1 945bp、1 130bp和2 208bp，在野生株05ZYH33中，用以上引物进行PCR，则均为阴性结果；用引物IN1/IN2进行PCR扩增，在野生株中会得到780bp大小的片段，而在SSU0562基因敲除突变株中则得到阴性结果。结果[图 3(b)]与理论值相符合。为了进一步证实SSU0562敲除成功，用引物Out1/Out2扩增得到大小为3 023bp的片段，将PCR产物进行测序，结果比对正确，将该突变株命名为Δ0562。然后提取野生株05ZYH33和突变株Δ0562的总RNA进行反转录，得到的cDNA使用引物IN1/IN2进行PCR扩增，观察SSU0562在转录水平的改变。如图 4所示：05ZYH33扩增结果为阳性，提示SSU0562基因正常转录；Δ0562为阴性，证实SSU0562基因在转录水平的缺失，上述结果再次表明突变株Δ0562构建成功。

图 3 Δ0562的PCR初步筛选及组合PCR鉴定结果 Fig. 3 PCR analysisand multiple-PCR analysis of Δ0562 (a) PCR analysis M：250bp DNA marker; 1~8：Mutant strains (b) Multiple-PCR analysis M: 250bp DNA marker; 1: IN1/IN2 PCR amplification using 05ZYH33 genomic DNA as template; 2: IN1/IN2 PCR amplification using Δ0562 genomic DNA as template; 3: SPC1/SPC2 PCR amplification using 05ZYH33 genomic DNA as template; 4: SPC1/SPC2 PCR amplification using Δ0562 genomic DNA as template; 5: OUT1/SPC2 PCR amplification using 05ZYH33 genomic DNA as template; 6: OUT1/SPC2 PCR amplification using Δ0562 genomic DNA as template; 7:SPC1/OUT2 PCR amplification using 05ZYH33 genomic DNA as template; 8: SPC1/OUT2 PCR amplification using Δ0562 genomic DNA as template

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图 4 Δ0562 RT-PCR分析 Fig. 4 RT-PCR analysis of Δ0562 (a) Total RNA of 05ZYH33 and Δ0562 1: RNA of 05ZYH33; 2: RNA of Δ0562 (b) RT-PCR analysis M: 250bp DNA marker; 1: IN1/IN2 PCR amplification using cDNA of 05ZYH33; 2: IN1/IN2 PCR amplification using cDNA of Δ0562

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将野生株05ZYH33和突变株Δ0562分别涂布于THB血平板(含5%绵羊血)，两者均长出表面光滑、湿润、灰白色、圆形半透明的细小菌落，菌落周围均有明显的溶菌环(图 5)。在溶血活性和菌落形态方面，野生株与突变株并未出现明显差异。如图 6所示，两者的革兰染色均为阳性，菌落形态为圆形或椭圆形，05ZYH33呈链状排列；相比05ZYH33，突变株Δ0562排列更加散在，链的长度明显较野生株的短，提示SSU0562基因敲除后猪链球菌的成链能力减弱。

图 5 野生型05ZYH33(a)和突变株Δ0562(b)的菌落形态和溶血活性 Fig. 5 Sheep blood THB plates of 05ZYH33(a) and Δ0562(b)

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图 6 野生株05ZH33(a)和突变株Δ0562(b)的结构形态(×1 000) Fig. 6 Gram stain of the wide type 05ZYH33(a) and mutant Δ0562(b)

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在相同的培养条件下，测定野生株05ZYH33和突变株Δ0562的OD₆₀₀值，绘制生长曲线。结果如图 7所示。从图中可以看出，突变株Δ0562与野生株05ZYH33均在培养约3h后进入对数生长期，野生株05ZYH33在7h后进入平台期，突变株Δ0562在8h后进入平台期，总体而言两者的生长速率并无明显差异。

图 7 野生株与突变株的生长速率比较 Fig. 7 Growth rate of the parent strain and mutant Δ0562

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野生株组小鼠在接种(1×10⁸CFU/ml)野生株05ZYH33后，数小时内均出现精神萎靡、食欲下降等反应，12h内全部死亡；突变株组在攻毒12h内死亡8只，2只萎靡不振,发病较重，24h内死亡。统计学分析显示，与野生株相比突变株的毒力并未显著改变，提示SSU0562基因不改变猪链球菌强毒株05ZYH33的毒力特性。

MocR家族是细菌中重要的转录调控因子家族，对MocR家族的研究主要集中在谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)和芽孢杆菌(Bacillus)，其作用机制尚不清楚。目前，MocR家族成员只发现了GabR和PdxR^{[15, 16, 17]}。在枯草芽孢杆菌中，GabR作为gabTD操纵子的转录激活因子，主要通过γ-氨基丁酸和5′-磷酸吡哆醛对gabT的表达进行正向调控，γ-氨基丁酸作为唯一氮源的利用会因为gabR的缺失而受到阻断^{[15, 22]}。γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)由谷氨酸经谷氨酸脱羧酶催化转化而来，通过GABA旁路(GABA shunt)完成代谢^[17]。有研究报道GABA在微生物中参与氮、碳源的代谢^{[12, 18]}，以及腐胺和精胺等多胺的代谢^[19]，且能够对多种逆境产生协同应答，具有重要的生理功能^[20]。最新研究表明GABA作为真核生物与病原菌相互作用的一种重要信号分子，可通过调控细菌群体感应信号分子OC8-HSL [N-(3-oxooctanoyl)homoserine lactone]的表达水平，影响病原菌对真核生物的致病力^{[21, 22]}。在本课题组前期研究工作的基础上，我们对MocR家族转录调控因子SSU0562基因的功能进行了研究，探索其对2型猪链球菌强毒株05ZYH33的基本生物学性状和毒力的影响。

为探讨MocR家族成员SSU0562基因在2型猪链球菌致病过程中的作用，本研究通过同源重组基因敲除方法构建了猪链球菌强毒株05ZYH33中SSU0562基因敲除的突变株Δ0562。组合PCR和RT-PCR结果证实SSU0562基因无论是在基因水平上还是在转录水平上均被成功敲除。通过生物学功能实验，我们发现突变株Δ0562与野生型05ZYH33相比，在溶血活性与生长速率均无明显差异；但突变株Δ0562的成链能力明显减弱，提示SSU0562基因可能参与调控2型猪链球菌的成链能力。小鼠致病实验结果显示，突变株的毒力较野生株没有明显变化，敲除SSU0562基因并没有明显改变S.suis2的毒力。细菌的基础代谢和毒力调节是由多种因素共同作用的结果，SSU0562作为重要的转录调控因子，其在细菌代谢和毒力调控网络中的作用可能是复杂的，SSU0562调控作用是否与环境压力诱导等外在因素相关仍待进一步探索。

通过本实验的研究，我们发现SSU0562编码基因参与调节了2型猪链球菌的成链能力，但对其溶血活性及生长速率没有明显影响；小鼠致病实验提示，SSU0562可能在感染致病过程中发挥了重要作用，但并非S.suis2的毒力决定因子。MocR家族作为一种重要的转录调控因子家族，在S.suis2中的作用还有待进一步的阐明。