髓样分化因子MyD88(myeloid differentiation factor 88)基因主要在免疫细胞中表达，如单核细胞、胸腺细胞、T细胞、B细胞、辅助性细胞、巨噬细胞中^[1]，是激活先天性免疫反应的基本受体，在哺乳动物的先天性免疫反应中发挥重要作用^[2]，最早发现于髓样细胞的分化，由296个氨基酸残基组成，是第1个被发现的接头蛋白分子，主要存在于信号转导通路下游^[3]，具有2个特殊的结构域，即N端的死亡结构域(death domain,DD)与C端的TIR结构域(Toll/IL-1R domain,TIR)^[4]。TLR(Toll-like receptor,TLR)在激活天然免疫和调节获得性免疫过程中起着重要作用^[5]，其信号通路的激活通过一类桥接于受体与蛋白激酶之间的接头蛋白来传导。MyD88作为其中的一种重要的接头蛋白，在TLR激活后首先被招募，通过与TIR家族胞内的TIR结构域相互作用，介导下游信号的转导，在TLR信号通路中起着关键作用^{[6, 7]}。

研究表明，MyD88依赖通路在维持肠道稳态，甚至整个机体的稳态维持都发挥着重要作用^[8]。肠上皮细胞中MyD88信号转导的缺失，可以导致细菌移位、抗菌肽表达量降低、肠道微生物菌群失调及肠炎等的发生。临床上，MyD88基因缺陷在一定程度上增加了儿童对肺炎双球菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的易感性，且对其他革兰阴性菌的易感性也可能有所增加^[9]。当前，MyD88已经成为脓毒症治疗和疫苗研发中的作用靶点。有效控制MyD88依赖通路的传导，对脓毒症有减弱炎症反应的作用；活化MyD88依赖通路在疫苗接种中可起到免疫佐剂的作用，使接种人群获得有效的免疫力^[10]。

shRNA由内切核酸酶将外源或内源的dsRNA加工成21~23nt的双链RNA,是RNAi的中间产物,也是RNAi的关键因素。与核酸技术、反义技术等沉默基因表达的技术相比，shRNA具有特异、高效、稳定、安全的特点，而且其抑制效应可垂直传递多代^[11]。因此,在基因功能研究和基因治疗的应用越来越多。本研究通过在不同靶位点设计4种猪MyD88基因的特异性shRNA干扰载体，并转染猪肺泡巨噬细胞，评价其基因水平及蛋白质水平的干扰效率；利用LPS刺激之后巨噬细胞炎症因子的表达情况，验证其干扰效果，为研究MyD88在巨噬细胞发挥免疫调节过程中的作用及相关机制提供基础资料。

猪肺泡巨噬细胞3D4/2、干扰载体pYr-1.1、克隆宿主菌大肠杆菌(Escherichia coli) DH5α由本实验室保存。

琼脂糖凝胶回收试剂盒、胎牛血清、DMEM培养基(Gibco公司，美国)；质粒提取试剂盒(天根,北京)；限制性内切核酸酶和反转录试剂盒(Fermentas公司，加拿大)；酵母提取物、DEPC水、蛋白胨等培养基、T4 DNA连接酶、DNA聚合酶及其他生化试剂(上海生工生物工程技术有限公司)；SYBR premix Ex Taq (TaKaRa,大连)；脂质体TranSmarter (ABmart，杭州)；脂多糖LPS(Escherichia coli O111:B4，Sigma-Aldrich)。

以表 1中的靶序列为基础，分别设计pigMyD88-shRNA引物(表 2)。用退火Buffer分别溶解引物，然后置于沸水中，自然退火(退火Buffer的配方为：10mmol/L Tris-HCl pH8.0、50mmol/L NaCl、1mmol/L EDTA)。将退火产物与经BsaI酶切回收的pYr-1.1进行连接，构建4个pYr-1.1- pigMyD88 shRNA干扰载体，并转化感受态大肠杆菌DH5α。每个转化平板分别挑取3个克隆分别进行XhoI酶切鉴定及测序鉴定。

按试剂盒操作说明抽提shRNA质粒。猪肺泡巨噬细胞用DMEM 1640培养基(10%胎牛血清，1%青链霉素双抗)培养，培养条件为37℃、5% CO₂。将细胞接种于六孔板，分为以下6组：空白对照组、阴性对照组(pYr-1.1 空载体)、RNAsh-1、RNAsh-2、RNAsh-3、RNAsh-4组，每组3个重复，待细胞 70%~80%汇合时进行转染，转染前将DMEM完全培养基更换为OPTI-MEM,转染条件根据转染试剂TranSmarter (ABmart,杭州)说明书，转染24h后，荧光倒置显微镜(莱卡，德国)拍摄荧光蛋白表达情况。

用Trizol(新景，杭州)裂解液裂解细胞，根据Trizol说明书提取各组细胞的总RNA。将获得的RNA根据反转录酶(Fermentas，Thermo scientific，美国)说明书反转录为cDNA。利用实验室前期设计的MyD88引物(序列)，应用SYBR premix Ex Taq(TaKaRa，大连宝生)试剂盒，按照说明配制反应体系，进行实时荧光定量Real-time PCR反应(StepOne Plus,ABI system,美国)。扩增条件如下：95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火30s，共进行40个循环；95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s，自动采集荧光。检测MyD88 mRNA的相对表达量。MyD88基因的相对表达量用2-ΔΔCt方法计算，以GAPDH为内参基因。

根据全蛋白质提取试剂盒(凯基，南京)说明书提取干扰后细胞全细胞蛋白质，利用BCA全蛋白定量试剂盒(凯基，南京)测定蛋白质浓度后，上样，选用10%分离胶、5%浓缩胶及Tris-甘氨酸电泳缓冲液，电泳至溴酚蓝到达分离胶底部。湿转法转膜后用5%脱脂牛奶常温下封闭2h，加入MyD88抗体(Sant Cruze,美国)，4℃孵育过夜，用HRP标记的特定二抗(联科，杭州)常温孵育1h，0.1%TBST洗膜3~5次，ECL化学发光液孵育20s后，利用化学发光成像仪(UVP，美国)嚗光拍照。

将猪肺泡巨噬细胞3D4/2接种于六孔板，分为以下4组：空白对照组、空载体对照组、阴性对照组、MyD88-sh4干扰处理组，每组3个重复，待细胞 70%~80%汇合时，阴性对照组和干扰处理组进行转染，方法同1.3.1 ；转染6h后，更换为DMEM 1640培养基(10%胎牛血清、1%青链霉素双抗)，空载体对照组、阴性对照、干扰处理组用终浓度1μg/ml LPS处理3h后，收集细胞，进行Real-time PCR检测炎性基因TNF-α基因表达。

利用Invitrogen公司在线设计软件设计出4对shRNA干扰序列(表 1)，经BLAST分析猪基因库中同源序列，未发现包含该序列的其他基因，说明4个靶点特异性较好。以表 1中的靶序列为基础，分别设计pigMyD88-shRNA引物(表 2)。经连接、转化之后，构建pigMyD88 shRNA重组质粒[图 1(a)]。挑取单克隆，进行双酶切鉴定。结果表明，pigMyD88-sh1、pigMyD88-sh2、pigMyD88-sh3、pigMyD88-sh4均成功插入[图 1(b)]。将上述构建的pYr-1.1-pigMyD88-sh1、pYr-1.1-pigMyD88-sh2、pYr-1.1-pigMyD88-sh3、pYr-1.1-pigMyD88-sh4克隆以5′-GACTATCATATGCTTAC CGT-3′ 为引物进行测序，测序结果利用DNAssist软件与目的序列进行比对，结果表明pYr-1.1-pigMyD88-sh1、pYr-1.1-pigMyD88-sh2、pYr-1.1-pigMyD88-sh3、pYr-1.1-pigMyD88-sh4构建成功(图 2)。

图 1 pYr-1.1-pigMyD88-sh1质粒图谱和酶切鉴定图 Fig. 1 Recombinant plasmid of pYr-1.1-pigMyD88-sh1 (pYr-1.1-pigMyD88-sh1 as an example) (a) Recombinant plasmid of pYr-1.1-pigMyD88-sh1 (b) Identification of recombinant plasmid by digesting with Xho I 1：pYr-1.1- pigMyD88 -sh1；2：pYr-1.1- pigMyD88 -sh2；3：pYr-1.1- pigMyD88 -sh3；4：pYr-1.1- pigMyD88 -sh4；M: Marker

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图 2 测序及比对比对结果 Fig. 2 Sequence and blast results of 4 recombinant plasmids (a) Result of pYr-1.1-pigMyD88-sh1 (b) Result of pYr-1.1-pigMyD88-sh2 (c) Result of pYr-1.1-pigMyD88-sh3 (d) Result of pYr-1.1-pigMyD88-sh4

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转染pigMyD88 -shRNA干扰载体的猪肺泡巨噬细胞3D4/2通过荧光显微镜观察，可见细胞发出绿色荧光，表明细胞中有转染的外源基因表达，提示载体转染成功(图 3)。

图 3 绿色荧光蛋白表达在干扰载体转染猪肺泡巨噬细胞3D4/2后的表达情况 Fig. 3 Expression of EGFP in pig alveolar macrophages transfected with interference vector

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在猪肺泡巨噬细胞3D4/2细胞里转染4种MyD88干扰载体、阴性对照(空载体)，TranSmarter诱导6h，RT-PCR和Western blot检测MyD88基因(图 4)及蛋白质(图 5)表达情况，结果显示，对照组相比，阴性对照组不能够降低MyD88的表达量，4种干扰载体能够不同程度地降低干扰MyD88的表达，干扰效率分别达到36%、67%、60%、69%。

图 4 干扰载体转染猪肺泡巨噬细胞后MyD88基因的相对表达量 Fig. 4 Expression level of MyD88 mRNA in pig alveolar macrophages transfected with interference vector CON: Control group; Neg: Negative control group; shRNA-1~shRNA-4: Interference vector group. Different symbol represent significant difference,P<0.05,n=3,GAPDH as reference gene

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图 5 干扰载体转染猪肺泡巨噬细胞后MyD88蛋白的表达量 Fig. 5 Expression level of MyD88 protein in pig alveolar macrophages transfected with interference vector CON: Control group; Neg: Negative control group; RNAsh-1~RNAsh-4: Interference vector group. Different symbol represent significant difference,P<0.05,n=3,β-actin as reference gene

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在猪肺泡巨噬细胞3D4/2里转染干扰效果最优的MyD88-sh4,TranSmart诱导6h，用终浓度1μg/ml的LPS刺激3h后，RT-PCR检测TNF-α基因表达情况。结果显示，与空载体对照组和阴性对照组相比，MyD88干扰组在LPS刺激之后，TNF-α基因表达水平显著降低(图 6)。

图 6 LPS刺激MyD88沉默巨噬细胞TNF-α的相对表达量 Fig. 6 TNF-α gene expression in MyD88 slienced macrophage after LPS stimulation Different symbol represent significant difference,# P < 0.05 compared to control group,* P < 0.05 compared to LPS-treated group,n=3,GAPDH as reference gene

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Toll样受体是参与非特异性免疫(天然免疫)的一类重要蛋白质分子，也是连接非特异性免疫和特异性免疫的桥梁，在天然免疫中发挥着重要的调节作用。TLR信号通路的激活信号通过MyD88的传导，最终导致下游多种转录因子的激活，如NF-κB、干扰素调节因子3(interferon regulatory factor 3，IRF3)等。这些转录因子可上调促炎细胞因子和多种机体防御蛋白的转录，如IL-1β、肿瘤坏死因子α (tumor necrosis factor α，TNF-α)、IL-6、IL-12及干扰素β(interferon-β，INF-β)^{[12, 13]}。MyD88传导的TLR信号激活促炎细胞因子，不仅能控制先天性免疫反应，还可直接影响获得性免疫反应。因此，TLR/MyD88信号通路是一个具有多种调节功能的转导通路，在免疫反应、炎症反应及肿瘤的发生和发展过程中均发挥重要作用^[14]。

TLR信号通路在诸多疾病中均明显表达或被激活，且该通路中重要的接头蛋白MyD88与感染性疾病、败血症、炎性疾病、过敏性疾病、肿瘤和自身免疫性疾病之间均具有较为密切的关系^{[10, 11]}。目前对其的研究主要是在模式动物小鼠上探讨一些病原引起免疫反应的机制，通常利用基因敲除等手段。但是目前猪等大型哺乳动物基因敲除模型的构建尚不成熟，通过针对猪源MyD88基因设计干扰载体，对体外培养猪源细胞MyD88基因进行干扰，可以更为深入地探讨MyD88在猪上免疫相关疾病中的作用，但是目前尚未有猪源MyD88基因干扰载体构建的报道。

本研究利用Invitrogen公司在线设计软件，在MyD88基因的不同靶位点设计出4对shRNA干扰序列，在猪基因库中BLAST分析同源序列确定其特异性后，成功构建了猪MyD88基因的特异性shRNA干扰载体，通过转染猪肺泡巨噬细胞，在转录水平和蛋白质水平评价了其干扰效率。结果表明，2号、3号、4号干扰载体在基因水平上的干扰效率达到了67%、60%、69%，均显著降低了MyD88基因的转录，而1号的干扰效率只有36%。但是Western blot结果分析表明，MyD88沉默之后，1号和3号的的干扰效率差异不显著，2号和4号MyD88在转录水平和蛋白质水平的干扰效果基本一致。推测分析，可能是细胞状态不同导致实验的转染效率不同，进而影响了干扰的效率。同时LPS刺激MyD88沉默的巨噬细胞，炎症因子TNF-α基因表达水平显著下降(P＜0.05)的实验结果也验证了所构建猪MyD88干扰载体的干扰效果较好。本实验首次成功构建猪的MyD88基因干扰载体，为免疫反应、炎症反应等相关疾病在猪上的机制研究提供了基础资料。