鸭疫里默氏杆菌(RA)是黄杆菌科，里氏杆菌属的革兰氏阴性菌，能感染幼龄鸭、鹅、火鸡等多种禽类，特别是水禽^[1]，引起一种急性或慢性败血性细菌性传染病，该病的典型病理变化是纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎^{[2, 3]}。目前，该病在世界范围内常有发病和流行，至少有21种血清型被发现^{[4, 5, 6, 7]}，给养鸭业带来了巨大的经济损失。近年来，国内外对鸭疫里默氏杆菌的研究主要集中在基因组学研究^{[6, 8]}、诊断及检测方法的研究^{[9, 10]}、流行病学研究^[11]等。

Western blot技术在国内外广泛地运用在细胞和分子生物学研究。运用Western blot技术研究蛋白表达调节的关键因素之一是内参，选择正确合适的内参能保证实验结果的准确性和权威性。目前，对于鸭疫里默氏杆菌尚未有 Western blot内参的运用。基于此原因，我们拟寻找合适的Western blot内参蛋白，为进一步研究鸭疫里默氏杆菌蛋白表达水平奠定基础。

RecA，即重组酶A，主要功能是参与细菌DNA的重组，在大部分情况下，其表达量比较恒定。recA基因是原核生物的一种常见的持家基因，常被用作原核生物RT-qPCR的内参基因^[12]。基于此，我们选择鸭疫里默氏杆菌的RecA蛋白作为研究对象，评价其是否适合作为Western blot的内参蛋白。

质粒pET32a由本实验室保存；大肠杆菌DH5α和Rosetta由本实验室保存；鸭疫里默氏杆菌CH-1由本实验室分离保存。

限制性内切酶NdeI、HindIII、T4 DNA连接酶、BCA蛋白定量试剂盒等购自Thermo Fisher公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG购自Cell Signaling Technology公司；ECL发光试剂盒购自BIORAD公司；PCR试剂盒购自New England Bio-Lab公司；His-tag亲和层析试剂镍琼脂糖购自Novagen公司；质粒小提试剂盒和DNA纯化回收试剂盒均购自TIANGEN公司；DNase I、溶菌酶和氨苄青霉素(Amp)购自Amersco公司；2′2-联吡啶(Dip)、血红素(Hemin)、弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂购自Sigma公司。

根据GenBank中收录的RA CH-1的recA序列(Gene ID: 13715637)，设计2对引物分别扩增recA基因全长和截段序列。扩增全长序列的引物是recA p1(5′-GGAATTCCATATGGCAAAG

先后用NdeI和HindIII酶切PCR扩增出的RA CH-1的RecA全长和截段DNA片段。纯化回收后与同样酶切的表达载体pET32a在T4连接酶的作用下16 ℃连接过夜。连接产物转化到大肠杆菌DH5α中，并在含有氨苄青霉素(Amp)的培养基中初步筛选，用PCR方法进行再次鉴定。提取PCR阳性的重组质粒，经EcoRI和HindIII双酶切鉴定无误后送华大基因进行DNA测序。

将测序正确的重组质粒转化大肠杆菌Rosetta，挑取单菌落接种于新鲜的含有Amp的LB培养基中过夜培养。次日，重新接种于新鲜并含有Amp的LB培养基中，初始浓度为OD₆₀₀=0.05。在37℃，180 r/min摇床震荡培养2 h，添加1mmol/L的IPTG进行诱导表达。在37℃，180r/min摇床震荡培养诱导2 h，室温8 000r/min离心收集菌体。分别取1 OD的菌体加入100 μl SDS-PAGE loading buffer重悬，煮沸10min。取10μl(约10μg)进行SDS-PAGE，并用考马斯亮蓝染液染色。

按照1.2.2 的表达程序，接种1L表达菌进行大量表达。收集到的菌体按照20 OD∶1 ml的比例加入Tris-HCl缓冲液重悬，再加入1mmol/L溶菌酶和3000U/ml的DNase I，混匀后冰浴30 min，置于－80℃反复冻融3次。在4℃，12 000r/min离心30min，收集上清(RecA)或沉淀(RecA_P)。沉淀用8mol/L尿素溶解过夜。在4℃，12 000r/min离心10 min，收集上清。收集到的上清用His-tag亲和试剂镍琼脂糖进行亲和层析(按说明书操作)。取洗脱得到的蛋白10μl与2.5μl 4×SDS-PAGE loading buffer混匀，沸水煮10 min，进行SDS-PAGE，并用考马斯亮蓝染液染色。

用BCA蛋白定量试剂盒对纯化的可溶性蛋白RecA和RecA_P进行定量，分别取50 μg蛋白与等体积弗氏完全佐剂进行乳化，经腹腔注射免疫4周龄昆明鼠。两周后，取50 μg蛋白与等体积弗氏不完全佐剂进行乳化，经腹腔注射2次免疫，再两周后以同样方法进行3次免疫。3次免疫后10天，采集血液，收集血清。

在不同条件下培养鸭疫里默氏杆菌，包括在普通环境LB和TSB，铁限制性环境TSB+100μmol/L Dip，血红素丰富环境LB+Hemin。收集菌体，按1OD∶100μl 的比例混合菌体和SDS-PAGE loading buffer，煮沸10 min。分别取约10μg样品进行两个相同的SDS-PAGE，一个用于考马斯亮蓝染液染色，另一个用于Western blot检测。Western blot操作步骤：SDS-PAGE后的胶经10 V电压半干转30 min转移至PVDF膜。用TBST洗涤PVDF膜3次，在5%脱脂奶粉中封闭过夜。依次用400倍稀释的鼠源多克隆抗体血清室温孵育1 h，TBST洗涤PVDF膜3次，2 000倍稀释的羊抗鼠二抗室温孵育1 h，TBST洗涤PVDF膜3次，最后用ECL发光试剂盒显色。

为了构建更加特异的RecA多克隆抗体，我们分析预测了RA CH-1的RecA蛋白的抗原表位。预测结果表明，RecA蛋白的抗原表位平均分布在各个肽段，所以我们同时表达全长的RecA蛋白和羧基端截段的RecA蛋白，以制备更高特异性的多克隆抗体。

用RA CH-1基因组DNA为模板，进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳分别得到特异的条带。通过与Marker对比，目的条带与预期大小相符(图 1a)。测序结果表明，PCR扩增的目的基因序列与Genbank数据库的参考序列(NC_018609)完全一致，分别为1 032 bp和552 bp。重组质粒pET32a∷recA/pET32a∷recA_P经EcoRI和HindIII双酶切后分别得到与空质粒同样大小的条带，以及一条单一条带。通过与Marker对比，该条带与克隆的目的基因大小相符(图 1b)。这些结果表明，recA基因成功地克隆在表达载体pET32a上。

图 1 recA的PCR扩增产物和重组质粒pET32a∷recA/pET32a∷recAP的酶切产物电泳图 Fig. 1 The amplification of recA/recAP by PCR and the restriction analysis of recombinant plasmid pET32a∷recA/pET32a∷recAP (a) The PCR product of recA and recAP of RA CH-1 1: recA; 2: recAP; M: BM marker 5000 (b) Identification of recombinant plasmid pET32a∷recA/pET32a∷recAP by enzyme digestion 1: pET32a; 2: pET32a∷recA; 3: pET32a∷recAP; M: BM marker 5000

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将测序正确的重组质粒转化到大肠杆菌Rosetta中并诱导表达。IPTG诱导浓度为1mmol/L，诱导时间为2h。以空质粒组Rosetta pET32a的总蛋白作为阴性对照，经SDS-PAGE后考马斯亮蓝染色，可见重组质粒组均多出明显的一个条带。通过与Marker对比，目的条带与预期大小20 kDa/37 kDa相符(图 2)。

图 2 RecA和RecAP的诱导表达 Fig. 2 The expression of RecA and RecAP of RA CH-1 in E. coli Rosetta M: Protein marker. 1: The total proteins of Rosetta pET32a； 2:The total proteins of Rosetta pET32a∷recAP; 3: The total proteins of Rosetta pET32a∷recA

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从大量表达的菌体样品中纯化RecA蛋白和RecA_P蛋白，经镍琼脂糖亲和层析，我们纯化出了较纯的目的蛋白。经SDS-PAGE后考马斯亮蓝染色，可见与表达菌中表达的条带大小相符。通过与Marker对比，目的条带与预期大小20 kDa/37 kDa相符(图 3)。

图 3 纯化的RecA和RecAP蛋白 Fig. 3 The purified RecA and RecAP proteins of RA CH-1 M: Protein marker; 1: About 2 μg RecAP protein; 2: About 2 μg RecA protein

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利用RecA和RecA_P蛋白制得的多克隆抗体对鸭疫里默氏杆菌总蛋白进行Western blot反应，评价两种多克隆抗体的特异性。结果如图 4，两种多克隆抗体都能得到与目的大小一致的条带，但是RecA的多克隆抗体与鸭疫里默氏杆菌总蛋白有非特异性的反应条带出现，而RecA_P的多克隆抗体反应条带单一。结果表明，截段表达的RecA_P蛋白制备的多克隆抗体与鸭疫里默氏杆菌总蛋白能产生更特异的Western blot反应。

图 4 RecA和RecAP蛋白的多克隆抗体与鸭疫里默氏杆菌总蛋白反应 Fig. 4 Detection of the specificity of antibody including anti-RecA and anti-RecAP by Western blot 1 and 2 show the hybridization reaction between the total proteins of RA and anti-RecA or anti-RecAP

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铁是几乎所有生命的必需营养元素。在细菌体内，有多数蛋白的表达量都受到铁离子调控蛋白Fur的调控^{[13, 14]}，即在高铁离子浓度时，这些蛋白的表达量降低，而在低铁离子浓度时，这些蛋白的表达量升高。血红素作为绝大多数细菌的必需营养物质，它的浓度过高可能造成细菌的抗氧化压力减弱而表现出毒性，所以环境中的血红素浓度对细菌的多种蛋白可能有影响^{[15, 16]}。为了验证鸭疫里默氏杆菌RecA蛋白的表达量在铁离子浓度和血红素浓度变化时不受影响，我们用RecA_P的抗体与在TSB、TSB+Dip(铁离子螯合剂)、LB、LB+血红素等不同培养环境中培养的鸭疫里默氏杆菌总蛋白进行Western blot反应。用Image-Lab软件对结果进行定量分析，结果表明，各组蛋白的上样量相同的情况下，RecA表达量一致(图 5)。总之，鸭疫里默氏杆菌在不同铁离子浓度和血红素浓度环境中培养，RecA的表达量恒定。在上述条件下，RecA能作为鸭疫里默氏杆菌Western blot的内参蛋白。

图 5 鸭疫里默氏杆菌RecA蛋白在不同环境中的表达水平检测 Fig. 5 Western blot (upper) and SDS-PAGE (lower) analysis of RecA protein of R. anatipestifer grown in iron chelated condition or hemin present condition 1: The total proteins of R. anatipestifer grown in TSB; 2: The total proteins of R. anatipestifer grown in TSB containing 100μmol/L Dip; 3: The total proteins of R. anatipestifer grown in LB; 4: The total proteins of R. anatipestifer grown in LB containing 10μmol/L hemin; Upper bands are detected by anti-recAP serum using Western blot； Lower bands are detected by Coomassie brilliant blue

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鸭疫里默氏杆菌在世界范围内流行，为养禽业带来了巨大的经济损失。目前针对鸭疫里默氏杆菌的研究主要集中于基因组研究，流行病学研究等，而对其致病机制的研究较少。利用分子生物学方法，特别是Western blot技术对细菌蛋白水平的研究是非常普遍实用的。因为recA基因是细菌的持家基因，广泛地用作细菌基因转录水平研究的内参基因。我们的转录组测序结果表明鸭疫里默氏杆菌recA基因的转录水平不受血红素和铁离子浓度的影响(未发表)。鸭疫里默氏杆菌RecA蛋白的分子量约为37 kDa，在电泳时能和分子量相近的蛋白较好地分离，且不会因为分子量太小而限制了其他蛋白的分离，所以其分子量大小表明它适合作为内参蛋白。因此，我们拟进一步评价RecA蛋白作为鸭疫里默氏杆菌内参蛋白并制备其多克隆抗体，为研究鸭疫里默氏杆菌的蛋白表达提供参考。

为获得能与鸭疫里默氏杆菌特异性反应的RecA蛋白抗体，我们分析了RecA蛋白的抗原表位的分布，并依此设计了一对截段表达RecA蛋白的引物扩增recA基因的部分序列，以期表达出抗原表位更少的RecA_P蛋白并进一步制备特异性的多克隆抗体血清。和预期一样，截段表达的RecA_p的多克隆抗体与鸭疫里默氏杆菌反应更加特异，更适合用作内参抗体。

Western blot的内参蛋白应该在所研究环境下表达量相对恒定，通过和内参蛋白表达量作对比来比较不同环境下目的蛋白的表达情况。本研究表明鸭疫里默氏杆菌的RecA蛋白在血红素丰富环境和铁离子限制环境中均表达恒定。目前，我们已成功运用鸭疫里默氏杆菌的RecA蛋白作为内参蛋白研究了其部分蛋白的表达水平，如HmuY蛋白在低铁离子浓度条件下表达量明显升高(未发表)。综上所述，鸭疫里默氏杆菌的RecA蛋白能作为相关研究的内参蛋白。