口蹄疫是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的一种主要侵害偶蹄兽的急性热性高度接触性传染病。FMDV是小RNA病毒科，口蹄疫病毒属的典型成员，是一种无囊膜单股正链RNA病毒，其基因组大约含有8400个核苷酸^{[1, 2]}。病毒必须进入宿主细胞，到达细胞内的特定区域才能启动并完成自我复制，通常DNA病毒需要进入细胞核，而RNA病毒需要到达细胞核周的区域。病毒进入细胞是病毒“劫持”宿主细胞某种组分，完成其在细胞内移行的过程，在这个过程中涉及包括病毒在内的众多蛋白和分子参与的信号转导。包括FMDV在内的大部分无囊膜病毒利用网格蛋白，小窝蛋白，或脂质筏调节的內吞机制入侵细胞^{[3, 4]}。在该过程中，病毒首先通过受体结合位点(receptor-binding site，RBS)与细胞表面的受体结合起始感染，然后被内化到內吞囊泡中，再通过未知机制被转移到细胞核内体中。已证实大部分病毒通过动力蛋白调节的机制被转移到细胞核内体^{[5, 6]}。动力蛋白是GTP酶家族成员，能够促进网格蛋白覆盖区的发育，有利于包被囊泡的形成，同时也可以调节小窝蛋白介导的內吞路径。但是，动力蛋白在FMDV內吞过程中的作用尚未被验证。进入核内体的FMDV依赖低pH环境诱导病毒衣壳裂解，并通过未知机制穿过病毒诱导的核内体膜上的小孔来释放病毒遗传物质^{[7, 8]}。FMDV在内的正链RNA病毒感染细胞后可导致细胞内的膜结构重排，形成囊泡结构为病毒基因组复制提供场所，但这些膜的来源还不清楚。近期关于自噬诱导剂和抑制剂对病毒量影响的研究证实自噬体结构可以为RNA病毒的复制提供平台。O’Donnell等人^[9]发现FMDV也可利用自噬机制促进自身复制，为阐明自噬在FMDV感染中的作用提供了重要参考。本文旨在对FMDV入侵方面的前期研究进行总结，为后续FMDV入侵机制的深入研究提供参考。 1 不同受体介导的FMDV入侵路径

目前已知的FMDV受体包括与FMDV结构蛋白VP1的G-H环上RGD基序相互作用的四种整联蛋白受体αvβ3、αvβ6、αvβ1和αvβ8^{[10, 11, 12]}；与FMDV结构蛋白VP3上56位精氨酸相互作用的硫酸乙酰肝素(HS)受体^{[13, 14, 15]}；以及一种仍未被鉴定的第三受体^{[16, 17]}。FMDV首先通过细胞表面的受体吸附宿主细胞，然后通过受体介导的內吞路径进入细胞。FMDV必须识别并结合一种或多种受体分子才能起始感染。 1.1 整联蛋白介导的FMDV入侵路径

整联蛋白受体结合位点主要集中在FMDV结构蛋白VP1上G-H环中的RGD序列。这些位点的突变可能会影响与之结合的受体，进而改变病毒的入侵路径。病毒与细胞表面的整联蛋白受体结合后，通过受体胞内区的特殊氨基酸基序与胞内接头蛋白相互作用将内化信号传入胞内，使胞浆侧的网格蛋白—三脚蛋白复合体聚合形成网格蛋白包被小穴，小穴脱离胞浆膜形成网格蛋白包被小泡，包被小泡进入早期核内体^[18]。内化过程中，病毒很快在早期核内体中被检测出，随后出现在细胞核周围的循环核内体中，但在晚期核内体中没有被发现^[8]，这是由于病毒在被呈递给溶酶体前逃避到了细胞质中的特殊部位。在此过程中，FMDV利用早期核内体的酸性pH环境使自身衣壳裂解并将遗传物质释放到胞浆中。由此表明整联蛋白受体介导的口蹄疫病毒感染依赖clathrin内吞路径以及核内体中的酸性环境^[19]。O’Donnell等^[7]利用特殊的抑制剂和细胞标记物进行共定位分析发现A型和O型FMDV在与整联蛋白结合后同样利用网格蛋白依赖性机制去感染宿主细胞，并通过未知机制引起病毒衣壳结构的破裂并释放基因组。通过建立沉默网格蛋白重链(CHC)基因的细胞系，Acebes等^[20]证明了C型FMDV利用网格蛋白介导的內吞路径感染细胞。虽然大量研究已经表明整联蛋白受体介导的FMDV利用网格蛋白依赖性内吞途径感染细胞，但受体介导病毒入侵的机制还不清楚，并且病毒入侵过程中，內吞信号的传递及分子间的互作仍需要大量研究进行阐释。此外，对于早期核内体中病毒遗传物质的释放也没有合理的解释。已知小RNA病毒科的肠道病毒与受体的结合可引起病毒粒子结构重排，导致VP4的释放以及VP1 N末端的延长，从而形成病毒A颗粒；该颗粒通过与膜相互作用进一步降解为80S颗粒，并释放RNA基因组^{[21, 22]}。而FMDV病毒与受体相互作用不能导致病毒粒子结构改变，FMDV病毒粒子的改变发生在病毒的内化过程中。在该过程中，病毒粒子降解为12S五聚体亚结构，并通过中间构象利用未知机制促使病毒基因组RNA穿过核内体膜进入细胞质，此过程可能通过病毒VP2的N端疏水性残基与核内体膜的互作来完成^[23]。通过病毒蛋白与Rab4和Rab11共定位，O’Donnell 等^[24]发现当整联蛋白介导FMDV感染时，病毒粒子裂解发生在早期核内体中。病毒在酸性囊泡中的裂解并不是FMDV有效感染的充分条件，还依赖其他的过程，如基因组释放和转移，病毒复制等。然而对于病毒入侵的直接分析和病毒侵入细胞后的反应过程还没有具体的报道，仍需大量研究予以探索。FMDV借助网格蛋白內吞路径入侵宿主细胞是一个复杂的过程，包括信号转导和分子互作等，进一步了解整联蛋白受体介导的网格蛋白內吞路径对研究FMDV的致病机制是必要的。 1.2 硫酸乙酰肝素介导的FMDV入侵路径

大量研究表明利用HS作为受体的病毒利用与整联蛋白结合型病毒不同的入侵方式感染宿主。HS受体介导病毒利用小窝蛋白依赖性內吞路径感染宿主细胞，这条路径依靠HS蛋白聚糖上的部分蛋白聚合物来完成^{[25, 26]}。病毒与HS受体结合后陷入胞膜表面的小窝中，小窝以类似出芽方式向胞浆内陷。在此过程中，病毒促使多个小窝相关蛋白分子的络氨酸残基磷酸化，激活的信号转导引起一系列级联反应，随后包裹病毒的小窝从胞膜上脱离进入胞浆中，称之为小囊，小囊通过膜融合将病毒带入小窝体或早期核内体^[27]。 O’Donnell等^[24]构建了可以同时利用整联蛋白和HS作为受体的基因工程变异株O1Campos (O1C3056R)和只能利用HS作为受体的O1C3056R-KGE变异株，然后通过激光共聚焦显微镜观察病毒的入侵过程，结果表明HS结合的FMDV通过小窝蛋白依赖性內吞路径进入细胞，在此过程中小窝蛋白和核内体相互交流。而且，HS结合型FMDV內吞过程中的移动效率低于整联蛋白结合型病毒依赖的网格蛋白调节的內吞路径，这与已经证明的小窝蛋白调节的內吞路径的动力小于网格蛋白调节的內吞路径的结论一致。此外，与整联蛋白结合型病毒在进入早期核内体时已开始发生裂解不同，HS受体介导的FMDV依赖小窝蛋白內吞路径入侵细胞时，病毒颗粒被从早期核内体进一步转入循环核内体，并在此裂解和释放病毒基因组RNA。另外，O’Donnell等发现HS受体依赖性病毒可与霍乱毒素共定位，而霍乱毒素可转运至高尔基体，所以病毒也可能通过高尔基体进行转移；然而通过布雷菲德菌素A破坏高尔基体并不能抑制整联蛋白受体或HS受体依赖性病毒的复制水平。由此说明，即使病毒通过高尔基体进行转运，也可能是一条终末路径^[24]。这些结果也进一步表明FMDV进入细胞的路径与病毒受体密切相关。 1.3 其他入侵路径

Acebes等^[20]在用药物抑制试验探究C型FMDV所依赖的网格蛋白介导的內吞路径时发现，用NH₄Cl处理导致缺乏功能性网格蛋白后没有进一步抑制病毒的感染，但用刀豆素A处理后感染会降低，这些结果表明C型FMDV入侵这些缺乏功能性网格蛋白的细胞，可能利用了其它一些內吞途径，这些途径可以引导病毒到达可以释放RNA病毒的酸性区域。不过也不能排除网格蛋白被抑制后所观察到FMDV感染可能是由于细胞系统的漏洞而非真正的非网格蛋白依赖现象。而且，大量研究表明，确实存在第三种受体参与FMDV对宿主细胞的吸附和内化^{[16, 17, 28]}。只是对第三受体的研究尚不清楚，因此对第三受体介导的入侵路径也不明确。 2 自噬在FMDV入侵中的作用

正链RNA病毒感染细胞后可导致胞内膜的重排，参与病毒复制复合物的形成。这些膜的来源还不清楚，但是促进胞内自噬现象有利于脊髓灰质炎病毒的复制，表明自噬对一些小RNA病毒的感染是有利的^[29]。自噬是一种细胞调节途径，用于降解和循环利用长寿蛋白和胞内物质，在细胞器的重复利用和应对饥饿条件等方面具有重要作用。近期研究显示，胞内固有细菌和大量正链RNA病毒，如小RNA病毒，可诱导自噬囊泡的形成，并能抑制自噬体的成熟和其与溶酶体的融合^[30]。而在用药物刺激诱导自噬现象后，可增强病毒在组织间的传播和病毒的致病性^[31]，说明自噬在病毒的感染中发挥着重要作用。另外，Berryman等^[32]研究发现，FMDV以整联蛋白或HS作为主要受体时，在感染早期可诱导自噬体，并且很可能发生在入侵细胞时，表明自噬体诱导可能导致病毒与细胞受体的结合。这些研究也暗示自噬囊泡在病毒感染的后期为非细胞裂解性病毒的释放提供路径，这对FMDV持续性感染的建立是必须的。

自噬标记物Atg5和LC3可与脊髓灰质炎病毒复制复合物共定位表明病毒的RNA复制复合物出现在自噬体囊泡内或其附近^[29]。脊髓灰质炎病毒也可改变自噬通路，诱导产生类似细胞自噬体的结构，病毒RNA复制复合体可在上面组装。Wong等^[33]已经证明阻断形成自噬体的信号通路并抑制关键自噬基因可减少柯萨基病毒B3病毒蛋白的表达和降低后期的病毒滴度。而通过分析感染FMDV后自噬标记物与病毒蛋白的共定位，证明LC3可与病毒非结构蛋白2B，2C和3A共定位^[9]。另外，在自噬诱导物雷帕霉素存在的情况下，感染FMDV的牛咽主要上皮细胞和MCF-10A细胞中的病毒量都会增加，清楚地表明FMDV诱导的自噬机制有利于FMDV的复制。自噬分子与FMDV各蛋白共定位的作用和功能还不是很清楚，但已在脊髓灰质炎病毒上证实病毒蛋白2BC可诱导LC3的酯化和单层膜囊泡的形成，而3A蛋白能够抑制自噬相关囊泡通过微管进行移动，从而阻止自噬相关囊泡的成熟^[34]。Berryman等^[32]的研究还发现自噬体可与病毒VP1发生共染。他们推测自噬体可能参与了病毒衣壳的组装或降解。自噬标记物与病毒蛋白的共定位还可能有另一种解释，即病毒引起先天性免疫应答而被自噬系统破坏。这已在多种病毒和细菌中得到证实，包括HSV-1，辛德毕斯病毒，GAS和TB^{[35, 36]}，至于FMDV蛋白与自噬标记物的共定位是否可以诱导宿主的免疫应答仍需进一步探索。自噬可促进病毒在宿主体内复制的特殊机制尚未阐明，不过自噬为病毒复合物的停留提供一种物理平台已在脊髓灰质炎病毒和柯萨基病毒上得到证明。通过其它RNA病毒所获得的事实表明由膜性囊泡组装成的自噬体在FMDV的复制中扮演重要角色。Jackson等^[37]报道当大量Atg12和LC3被SiRNA干扰后，对胞外病毒量的影响比胞内更严重。这可能是自噬机制的减弱降低了感染早期对病毒的融合，或者自噬机制的减弱减少了不溶性病毒的排出，从而导致胞外病毒的大量减少，所以FMDV可能利用自噬机制维持其持续感染。不过FMDV感染诱导自噬系统活动的分子机制，信号通路及对病毒的影响仍需继续探索。 3 FMDV入侵时与宿主的相互作用

小RNA病毒感染细胞时通过不同病毒成分与宿主蛋白的互作来进行信号传导，并逃避宿主的免疫机制，最终完成其在宿主体内的移行和复制。L蛋白被认为是口蹄疫病毒拮抗宿主天然免疫反应最为重要的蛋白，其可以直接裂解多种天然免疫通路的节点分子而发挥免疫抑制作用。也可通过裂解NF-κB蛋白而抑制由NF-κB调控的相关细胞因子和趋化因子的表达，进而极大程度的抑制宿主抗病毒蛋白的表达，促进病毒的复制^[38]。

Gladue等^[39]利用酵母双杂交方法确定与FMDV 2C蛋白互作的宿主蛋白，结果表明，细胞内的Beclin1是宿主内能与2C蛋白相结合的特殊伴侣。Beclin1(自噬基因)是自噬路径的调节者，而自噬路径又可促进口蹄疫病毒的入侵和复制。过表达Beclin1或者另一重要的自噬因子Bcl-2会强烈影响培养细胞中的病毒量。在FMDV感染过程中没有发现溶酶体与包含有病毒蛋白的自噬体发生融合；可是，在FMDV感染细胞时，过表达Beclin1会导致自噬体和溶酶体的融合，这表明2C蛋白会与Beclin1结合以阻止溶酶体和自噬体的融合，从而使病毒得以生存。用反向遗传学证明2C蛋白上氨基酸的修饰对于和Beclin1的相互作用很重要，同时对于病毒的生长也很关键。这些结果表明FMDV 2C蛋白和宿主蛋白Beclin1相互作用对于病毒的复制是必须的。此外，2C蛋白还可与N-myc和STAT蛋白作用，通过诱导细胞调亡，进而调控病毒在细胞内的感染与复制^[40]。

FMDV的3A蛋白具有膜相关性，它被认为是小RNA病毒复制复合体与膜结构结合的锚定蛋白，可与作为小RNA病毒复制标志的内膜系统共同存在^[41]；并且它与病毒诱导的细胞病理效应和阻断宿主细胞内蛋白的分泌有关^[42]。3C蛋白是口蹄疫病毒发挥免疫抑制作用的另一种关键蛋白。3C蛋白能够剪切eIF4G和eIF4A进而发挥拮抗作用。同时，3C蛋白可以裂解NF-κB调节蛋白NEMO(nuclear transcription factor kappa B essential modulator)，并抑制NEMO介导的I型干扰素产生，从而发挥免疫抑制功能，促进病毒复制。3C蛋白还可以通过拮抗JAK-STAT通路发挥免疫抑制作用。近来，Armer等^[43]利用共聚焦免疫荧光显微镜和电镜检测感染FMDV的细胞形态的改变，包括微管分布以及丝状体的改变，结果表明3C蛋白可以束缚γ-tubulin，但不是对整个微管中心区产生破环。FMDV 3C蛋白是仅有的对γ-tubulin从微管中心区缺失以及微管系统丧失完整性负责的蛋白。可能FMDV正是通过3C蛋白束缚微管来抑制自噬相关囊泡的成熟。同时暗示FMDV在宿主细胞内的感染与自噬密切相关。

口蹄疫病毒通过自身的不同蛋白与宿主细胞的各细胞器和分子互作，进而影响或改变细胞的特性以适应病毒自身的生存和复制，其作用方式和分子机制复杂多样，充分了解病毒与宿主细胞各种互作及功能对阐明病毒入侵细胞的机理必不可少。 4 展 望

FMDV借助宿主受体通过不同途径进入宿主细胞后，可通过自身蛋白与宿主蛋白的相互作用逃避宿主免疫机制，抑制宿主蛋白的表达；并利用宿主成分组成自身复制复合物，依靠并改变宿主内部各种机制进行病毒的复制、组装和释放。近年来人们对FMDV与受体互作及受体介导病毒的入侵已进行了大量研究，大大提高了人们对FMDV入侵机制的认识。然而，还有许多关键的问题有待解决，关于不同受体通过不同路径介导口蹄疫病毒入侵的机制研究，病毒RNA基因组向胞质中释放的机制研究，自噬对病毒入侵和复制的影响及作用机制，这些都需要后期大量的试验研究予以解释验证。这些问题的解决，必将为FMDV致病机制的研究提供很好的切入点。