全球乳酸需求量每年都在增长，而且有研究发现乳酸每年的平均产量约0.68亿kg并呈现每年10%~15%的增长趋势^[1]。由L-乳酸经聚合形成的聚乳酸因其可塑性、生物可降解性和生物可相容性在医学和环保中应用相当广泛^{[2, 3]}。乳酸可通过化学方法合成或以微生物发酵途径获得。通过化石燃料以化学合成手段获得的乳酸是外消旋的，因此目前L-乳酸的生产几乎都是通过发酵途径实现^[4]。但是这种以淀粉或精炼的糖为原料生产乳酸的成本过高，以低廉的木质纤维素原料替代糖和淀粉是至关重要的。

现阶段，对木质纤维素原料发酵产乳酸的研究主要集中在原料预处理新工艺的开发^[5]、发酵方式及工艺的优化^{[6, 7]}等方面。从另外一个角度来看，如果从工艺源头找到合适的木质纤维原料，将非常有利于后续的预处理及发酵过程，无疑也可大大提高木质纤维素转化乳酸的效率。废纸在制浆造纸过程中由于脱除了大部分木质素，纤维素结构在一定程度上被破坏^[8]，有利于纤维素酶酶解，可以作为木质纤维素转化乳酸的良好原料来源。Budhavaran等^[9]以纸浆为原料，接种凝结芽孢杆菌进行同步糖化发酵，乳酸产量达到92g/L，转化率为77%。Park等^[10]以办公用纸为原料，接种米根霉发酵4天，产生49.1g/L乳酸，乳酸转化率为0.59g/g。

目前，利用木质纤维素原料发酵产乳酸的菌株主要集中在Bacillus coagulans^[11]、Lactobacillus rhamnosus^[12]、Rhizopus oryzae^[13]等菌株。这些产乳酸微生物一般戊糖利用率较低，从而无法有效利用来源于纤维素生物质水解过程中产生的戊糖(主要是木糖)。这是木质纤维素转化乳酸效率过低的主要原因。一株稳定的产L-乳酸的重组大肠杆菌E. coli WL204由本实验室构建获得^[14]。该菌株可以利用葡萄糖为底物，也可以有效利用木糖生产L-乳酸。本研究通过对废纸的组成成分、稀酸预处理及酶处理后水解液组分的分析，利用E. coli WL204发酵水解液，探究大肠杆菌以木质纤维素为原料发酵生产乳酸的特性。

菌株：重组大肠杆菌E.coli WL204 由湖北工业大学教育部重点实验室构建及保存，其为E.coli SZ470^[15]中丙酮酸甲酸裂解酶基因(pflB)、D-乳酸脱氢酶基因(ldhA)、乙酸激酶基因(ackA)、乙醇脱氢酶基因(adhE)、延胡索酸酶基因(frdBC)的缺失菌，同时通过染色体插入技术引入外源乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici) L-乳酸脱氢酶基因(ldhL)。

废纸为废弃报纸，经碎纸机粉碎至0.2cm×1.4cm，烘干至恒重备用。

纤维素酶购于苏柯汉生物工程有限公司，4℃保存，使用前进行酶活力检测。除色谱检测时所用甲醇等试剂为色谱纯外，本研究所采用的其他化学试剂均为市售分析纯。

在不同固液比(1∶6~1∶14)(m/V)，不同硫酸浓度(0.1~0.5mol/L)、不同预处理时间(0.5~3h)下优化预处理条件。预处理完后，用NaOH调酸解液pH至4.8±0.1，加入30FPU/g底物纤维素酶，在50℃、150r/min条件下酶解60h，8 000r/min离心去残渣得水解液。

用Ca(OH)₂ 调水解液pH至10.5，90℃水浴30min，用6mol/L HCl回调pH至中性。

将产L-乳酸菌株E. coli WL204从－80℃甘油管取出，在含2%木糖的LB(10g/L蛋白胨、5g/L酵母粉、5g/L NaCl和15g/L琼脂粉)平板上活化数代，挑取单菌落接种到LB液体培养基中，定时取样，在波长600nm处测OD。培养基中碳源分别为水解液及与水解液相同含量的糖。

挑取活化好的E.coli WL204单菌落接种到500ml锥形瓶中，其中装有200ml 废纸水解液的LB培养液，于37℃、150r/min下培养约10h，使得OD₆₀₀为1.5左右。

发酵罐发酵试验是在装液量为4L的7L发酵罐(Sartorius Stedim Biotech GmbH 37070,Germany)中完成。将所得到的水解液于115℃灭菌20min后作为发酵培养基碳源。向灭菌后的水解液中添加灭过菌高浓度的蛋白胨和酵母粉至其终浓度分别为10g/L和5g/L。将上述过夜培养的种子液以10%(V/V)的接种量接种至发酵培养基发酵。发酵过程中用3mol/L Ca(OH)₂控制其pH为7.0，温度在37℃，转速为150r/min。每隔一段时间取样测发酵液中产物及底物含量。

废纸中纤维素、木质素和半纤维素的含量根据美国可再生能源实验室(NREL)所提供的方法^[16]进行检测。

废纸水解液中总还原糖均采用3,5-二硝基水杨酸法，即DNS法测定。

葡萄糖、木糖、乙酸、甲酸及糠醛和5-羟甲基糠醛(5-HMF)的含量采用高效液相色谱法(HPLC)测定。采用色谱仪为Agilent 1200配BioRad HPX 87H 柱，以4mmol/L H₂SO₄作为流动相，流动相流速为0.5ml/min，柱温设定40℃。 糖类和有机酸类检测配备示差折光检测器，醛类检测采用277nm紫外检测器。

废纸经干燥后测定纤维素、半纤维素、木质素三大组分含量，结果如表 1所示。较稻草秸秆、玉米秸秆等木制纤维物质，废纸在制浆造纸过程中已经脱去了大部分半纤维素和木质素，其中纤维素含量最多^[17]，达60%以上。木质纤维物质中的半纤维素在高温下经稀酸作用可分解为木糖、阿拉伯糖等单糖，同时在高温下稀酸可以进一步打散纤维素的结晶结构，更有利于纤维素酶酶解。废纸中含有14%左右的半纤维素，稀酸预处理可以有效水解废纸中的半纤维素，提高其糖化率。

稀酸预处理可以高效释放半纤维素中的五碳糖，且可以产生更多的无定型纤维素使其结晶度上升，有利于纤维素酶与纤维素结合。废纸在121℃条件下预处理后酶解，考察不同硫酸浓度、不同固液比、不同预处理时间对废纸糖化效果的影响。

废纸在固液比为1∶10，不同硫酸浓度(0.1~0.5mol/L)及121℃条件下预处理1h时，随着硫酸浓度的增加，水解液中总还原糖、葡萄糖、木糖浓度不断变大(表 2)。水解液中总还原糖在硫酸浓度为0.3mol/L与0.4mol/L时无显著性差异，从节约成本的角度看，硫酸在0.3mol/L时为最适预处理浓度。

废纸在硫酸浓度为0.3mol/L，不同固液比(1∶6~1∶14)(m/V)及121℃条件下预处理1h时，在固液比为1∶8时可以得到最高还原糖，为(44.01±0.74)g/L(表 3)。固液比(1∶6)过高，液体流动性差，不利于纤维素酶酶解。固液比为1∶10时废纸的水解率为38.38%，虽然高于1∶8时的水解率35.20%，但水解液中总还原糖、葡萄糖、木糖浓度过低，不利于后续发酵。

废纸在硫酸浓度为0.3mol/L、固液比1∶8(m/V)及121℃条件下预处理不同时间(0.5~3h)时，随着预处理时间的延长，总还原糖浓度不断提高，如表 4所示，在2h时到达最大值，在3h时有一定程度的减少，这可能是由于酸解所产生的部分木糖在长时间的高温条件下转化为糠醛等物质。总还原糖在1.5h与2h时无显著性差异(P<0.05)，故1.5h为最适预处理时间。

废纸在高温下经稀酸预处理后，会产生糠醛、羟甲基糠醛等有害物质，严重抑制大肠杆菌的生长。废纸在0.2mol/L H₂SO₄、固液比为1∶8(m/V)的条件下于121℃处理1.5h后，酶解得水解液，用Ca(OH)₂调pH至10.5，90℃水浴30min，可有效脱除糠醛、羟甲基糠醛。回调pH至7.0，取样测糠醛、羟甲基糠醛含量，结果如图 1所示，废纸水解液中糠醛、HMF脱除率分别为60.58%、28.73%。

图 1 水解液脱毒前后糠醛、5-HMF的浓度变化 Fig. 1 The concentration variability of Furfural and HMF after detoxification

图选项

以LB培养基为对照，考察了水解液脱毒前与脱毒后对E. coli WL204菌体生长的影响，生长曲线如图 2所示。E. coli WL204在LB培养基中约6 h进入对数期，24 h进入稳定期后，OD达最大值3.67。未脱毒水解液中大量的糠醛、羟甲基糠醛等抑制剂对E. coli WL204菌体生长抑制较强烈，在前12 h菌体生长缓慢，此后菌体开始生长，在36 h时OD达到2.61。在脱毒水解液中，由于还存在少量的抑制剂，E. coli WL204延滞期较LB培养基延长约2 h，24 h进入稳定期后OD达到3.41。黄蜂^[18]研究了糠醛对E.coli SZ470发酵的影响，发现在糠醛浓度为0.6 g/L时对菌体生长有25%的抑制作用。废纸水解液经脱毒后糠醛浓度为0.16 g/L，对E. coli WL204菌体生长仅有7%的抑制作用，故水解液脱毒后可以用于发酵。

图 2 E. coli WL204生长曲线 (▲：LB；●：脱毒水解液；▇：未脱毒水解液) Fig. 2 Growth curve of E. coli WL204 ▲：LB；●：after detoxification；▇：before detoxification

图选项

在7L发酵罐中研究了E.coli WL204利用废纸原料水解液发酵产乳酸过程中葡萄糖、木糖利用情况及乳酸产量，结果如图 3所示。

图 3 E. coli WL204利用废纸水解液发酵产L-乳酸 (■：葡萄糖；〇：木糖；▲：乳酸；*：乙酸) Fig. 3 Lactic acid fermentation and consumption of sugars from wastepaper by E. coli WL204■:Glucose; 〇:Xylose; ▲: Lactic acid; *: Acetic acid by-product

图选项

在发酵初始阶段(0~12h)，葡萄糖消耗速率为0.69g/(L·h)，这可能是因为水解液中的少量副产物的存在，延长了E. coli WL204适应环境的过程，导致了其耗糖速率偏低。Gutiérrez等^[19]从大肠杆菌工程菌E.coli LY 01中提取出糠醛还原酶，这种酶可将糠醛还原成毒性较小的糠醇，但这个过程是需要消耗NADH，这说明具有糠醛还原酶的大肠杆菌本身具有一定糠醛耐受性能力而且还是一个缓慢的适应过程。在12~24h阶段，E.coli WL204进入产酸高峰期，水解液发酵产乳酸含量大幅度增加。随着发酵的进行，乳酸生产速率下降，乙酸不断积累，呈缓慢上升趋势，琥珀酸、甲酸含量较少，均低于1g/L。

与葡萄糖相比，大多产乳酸微生物无法有效利用来源于纤维素生物质预处理和水解过程中的戊糖(主要是木糖)。在前期研究中，E. coil WL204在LB培养基中可以利用70g/L木糖生产62g/L乳酸。由图 2可见，葡萄糖在36h时基本耗完，然后开始利用发酵液中的木糖，木糖利用率为76.74%，说明E.coli WL204能很好利用木质纤维素水解液中的木糖。

微生物利用不同底物发酵生产乳酸是未来趋势。木质纤维素作为最丰富的非粮可再生资源，是乳酸发酵的潜在底物。目前，很少有研究关注以大肠杆菌为出发菌株来实现纤维素生物质到乳酸的转化。在一些研究中，大肠杆菌通过基因工程手段被改造来生产乳酸，但是它们几乎不具备同时利用葡萄糖和木糖来生产乳酸的能力。Mazumdar等^[20]利用大肠杆菌，以含葡萄糖和甘露醇为主的海藻水解液为底物分批补料发酵，最终产生37.7g/L L-乳酸。Wang等^[21]以Escherichia coli WYZ-L为发酵菌株，甘蔗糖蜜和玉米浆为底物发酵产生75g/L L-乳酸。在这些研究中，所用的可再生原料几乎不含木糖，且所用大肠杆菌菌株也不具备木糖代谢能力。全球光合作用产生的植物生物质中木质纤维素占60%~80%，而木质纤维素水解液中木糖占有较高比例。本研究中，经过基因改造和驯化的大肠杆菌E.coli WL204，在7L发酵罐中可以利用废纸水解液中的葡萄糖和木糖生产38.91g/L的L-乳酸，糖酸转化率为79 %。

废纸中纤维素、半纤维素、木质素含量分别为(62.87±0.96)%、(14.60±0.5)%、(19.72±1.04)%。在固液比为1∶8、硫酸浓度为0.3mol/L，121℃条件下预处理1.5h后，用NaOH调酸解液pH至4.8±0.1，加入30FPU/g底物纤维素酶，在50℃、150r/min条件下酶解60h，得到的水解液中总还原糖、葡萄糖、木糖浓度分别为(50.19±1.12)g/L、(34.17±0.33)g/L、(14.88±0.31)g/L。水解液脱毒后，以E.coli WL204为发酵菌株发酵72h，乳酸产量为38.91g/L，乳酸生产强度为0.54g/(L·h)。在此条件下，每100g废纸可以产生31g乳酸。从五碳糖利用角度看，E.coli WL204可以充分有效利用木质纤维素水解液中的木糖，能较大程度将木质纤维素转化为乳酸。