据世界卫生组织统计：全球约有30亿人患有不同程度的贫血，每年因贫血引致各类疾病而死亡的人数高达上千万^[1]。中国患贫血的人口概率远高于西方国家，在患贫血的人群中，女性明显高于男性，老年人和儿童高于中青年。促红细胞生成素(Erythropoietin，EPO)是由人体肾脏和肝脏分泌的一种糖蛋白激素，90%由肾脏的间质或近端小管的特殊细胞生成，10%在肝脏的Kuper氏细胞产生^[2]。EPO前体由193个氨基酸组成;成熟EPO切除信号肽后含有166个氨基酸，分子量约34.4kDa，含蛋白60%，碳水化合物40%^[3]。根据碳水化合物含量的不同可以把天然存在的EPO分成两种类型：α型(34%)和β型(26%)。两种类型的EPO在生物学特性，抗原性及临床应用效果上均相同。

目前，促红细胞生成素(Erythropoietin,EPO)已广泛应用于临床上各种贫血的治疗，包括由慢性肾衰、多发性骨髓瘤、骨髓异常增殖综合症和艾滋病引起的贫血，其中对肾衰、尿毒症所伴随贫血的治疗最有效^[4]。此外，EPO对肿瘤相关性贫血、早产儿和孕产妇贫血、围手术期减少异源性输血等方面也有良好的疗效。多年来的研究发现EPO除了具备作为激素的基本功能外，它还有其他多种生理功能，例如：促进造血细胞前体增生分化、代谢应激时保护神经元和促进肠粘膜发育等。随着研究的不断深入和临床试验的开展，EPO必将在更多领域发挥更大的作用。由于EPO在体内的半衰期比较短，病人可能每周需要2～3次用药，这样可能给病人带来诸多不便^[5]，因此不少公司在研制长效EPO，其中最成功的是美国Amgen公司研制的长效贫血治疗药新红细胞生成刺激蛋白(New Erythropoietin Stimulating Protein，NESP)，它是一种高糖基化的rhEPO类似物，具有与rhEPO相似的作用机制^[5]。NESP含5个N端糖链和比rhEPO高2倍的唾液酸残基，从而达到较好的代谢稳定性和3倍于rhEP的半衰期，因此可减少给药次数^[6]。

本研究在现有技术的基础上，采用新红细胞生成刺激蛋白(NESP)的策略，突变了天然EPO的5个氨基酸残基，分别是Ala30Asn,His32Thr,Pro87Val,Trp88Asn,Pro90Thr。与天然EPO相比，增加了30和88位的N糖基化位点。另一方面，通过NESP和IgG2的铰链区、CH2和CH3基因的连接，并突变部分位点，从而形成了一种融合蛋白。我们命名该融合蛋白为New Erythropoietin Stimulating Protein Fc fragment from IgG2，简称NESP-Fc。实验表明，该融合蛋白具有与天然EPO同样的生物活性，体内外实验也表明，与对照EPO相比，该融合蛋白的生物半衰期显著延长，因此它具有长效的能力。NESP-Fc在细胞和动物模型中效果显著，有可能用于临床。本文中的NESP-Fc具有原创性，已经申请了国家专利，并获得了授权，专利公开号是CN101870735 B^[7]。

内切酶HindIII、EcoRI和T4 DNA连接酶购自英国NEB公司，蛋氨酸亚氨基代砜(MSX)和丙酸钠 (Valproic acid)购自美国Sigma公司，脂质体Lipofectamine^TM2000、PRMI 1640培养基、无血清培养基CD CHO medium、CD EfficientFeed^TM C (Feed C)、HT、蛋白胨 (peptone)和谷氨酰胺(Gln)购自Life Technologies公司，HiTrap MabSelectSuRe 1ml纯化柱为GE公司产品，人原巨核细胞型白血病细胞(UT-7)购自中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心，CHO-K1细胞购自ATCC,对照重组人的EPO购自沈阳三生制药股份有限公司，CCK-8试剂盒购自日本株式会社同仁化学研究所，抗EPO的抗体来自美国Abcam公司。实验动物BALB/c小鼠和SD大鼠均购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

为了提高蛋白的表达产量，根据CHO表达的偏性密码子表，对新红细胞生成刺激蛋白(NESP)和IgG2编码的DNA序列进行优化，减少稀有密码子含量，并保证所编码的蛋白氨基酸残基保持不变^[8]。同时，为了保证蛋白的高效分泌表达，选择适于抗体类蛋白表达的轻链κ信号肽，序列为“METDTLLLWVLLLWVPGSTG”,作为融合蛋白的信号肽序列，并在起始密码子“ATG”前加入有利于蛋白表达的Kozak序列“CGCCACC”，并将IgG2中的Val234和Gly237突变为Ala。因涉及多个碱基的突变，故采用人工合成全序列，委托北京奥科生物技术有限责任公司对表达蛋白的cDNA进行全合成(序列略)。

上游引物：5′-CCCAAGCTTCCGCCACCATGGAGAC-3′,下划线部分为HindIII酶切位点下游引物：5′-CCGGAATTCTTACTTTCCAGGAGACAGGGACAGG-3′,下划线部分为EcoRI酶切位点，由北京奥科生物技术有限责任公司合成。采用PCR的方法对NESP-Fc的cDNA进行扩增，扩增条件为：95℃预变性5min,以94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸2min，扩增30个循环，再以72℃延伸10min，PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，将目的条带切下，用DNA回收试剂盒(北京天根生化科技有限公司产品)回收扩增产物。纯化的PCR产物和载体pH用HindIII和EcoRI双酶切后，分别用DNA试剂盒回收纯化酶切产物，在T4 DNA连接酶作用下16℃连接过夜，将连接产物转化DH5α感受态细胞，在LB(氨苄青霉素抗性)培养基中筛选培养，HindIII和EcoRI双酶切鉴定阳性克隆，提取正确克隆的质粒送上海英杰生物技术有限公司测序。

利用脂质体Lipofectamine^TM2000，将含有NESP-Fc的质粒转染CHO-K1细胞，利用MSX进行系列筛选，扩增，ELISA筛选高表达克隆，然后挑取表达量高的单克隆进行无血清驯化和悬浮培养驯化。

选择驯化后的高表达细胞株，在250ml细胞培养瓶中进行培养条件的初步优化，基础培养基为Invitrogen公司CD CHO medium。在批培养过程适时补料，包括CD EfficientFeed^TM C (Feed C),HT、谷氨酰胺(Gln)、丙戊酸钠(valproic acid)、蛋白胨(peptone)等。分别于第6d,8d,10d和12d收集上清，用液相色谱法测定融合蛋白表达量。

用10个床体积pH7.4的PBS溶液平衡HiTrap MabSelectSuRe 1ml柱，流速为0.5ml/min；将60ml上述上清液用0.45μm滤膜过滤后上样，流速为0.5ml/min；用pH7.4的PBS溶液洗5～10个床体积,流速为0.5ml/min；用100mmol/L柠檬酸缓冲液(pH4.0)洗脱，流速为0.5ml/min，收集洗脱峰。透析置换纯化样品中的洗脱液，透析3h，中间需要更换缓冲液一次，透析实验缓冲液为pH7的磷酸缓冲液，冻存备用。

SDS-PAGE和免疫印迹方法参考文献^[9]，还原电泳和非还原电泳的区别是还原电泳的加样液中含有1%的巯基乙醇，而非还原的加样液中则没有。

UT-7细胞悬浮培养于含10%胎牛血清PRMI 1640培养基中，37℃，5% CO₂中培养，于96孔培养板中加入UT-7细胞1×10⁴/孔。分别转染不同浓度的EPO和NESP-Fc融合蛋白，每个稀释度做3个复孔，37℃，5% CO₂中培养。对照组培养基为不含EPO的10% FBS的PRMI 1640。直至对照组(不含EPO)细胞全部死亡(凋亡)结束培养。每孔加入10μl CCK-8，37℃培养2.5h后测450nm处吸光度，参比波长630nm，将浓度对数与吸光值(OD)作图。

近交系雌性BALB/c小鼠，按体重分组，每组4只，静脉给药。EPO给药组：40IU/鼠，给药前及给药后分别于1~7d，每日取血；NESP-Fc融合蛋白组：低剂量，40IU/鼠；中剂量，200IU/鼠；高剂量，400IU/鼠。给药后分别于1~12d，每日取血。计算网织红细胞数对红细胞总数的比值(Ret%)。药品稀释液为含0.1%牛血清白蛋白的生理盐水，过滤除菌。

SD大鼠，3只/组，分2组，EPO组和NESP-Fc融合蛋白组，分别给药750IU/kg。给药前采空白阴性血，给药后分别于5min、30min、1h、4h、6h、8h、12h、24h、48h、96h、168h、240h和288h取血，分离血清，用Elisa方法检测血清中的残留NESP-Fc的含量。

NESP-Fc融合蛋白载体的构建见图 1a。以北京奥科生物技术有限责任公司合成的NESP-Fc融合蛋白cDNA为模板，PCR扩增获得NESP-Fc融合蛋白基因序列，其大小约为1 250bp(图 1b)。片段回收后，经HindIII和EcoRI双酶切与同样酶切处理的载体PHL连接。转化大肠杆菌DH5α，经菌落PCR筛选出阳性克隆。提取质粒DNA,HindIII和EcoRI双酶切后，可从重组质粒中切出分子量约1 250bp的片段(图 1c)，表明目的片段已成功克隆至表达载体pHL上。测序结果与设计的序列完全一致。

图 1 NESP-Fc表达载体的构建 Fig. 1 Construction of NESP-Fc vector (a) A schematic of the vector construction (b) PCR production of NESP-Fc 1: NESP-Fc gene; 2:DL2000 DNA marker (c) Analysis of recombinant vector 1: DL2000 DNA marker; 2: Vector digested with HindIII-EcoRI

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将含NESP-Fc融合蛋白编码基因的表达质粒(pHL)转染CHO-K1细胞后，首先用25μmol/L的MSX筛选阳性克隆，然后对混合克隆用400μmol/L的MSX进行加压扩增，用有限稀释法分离单克隆，并利用夹心ELISA对单克隆的表达水平进行鉴定，结果显示，单克隆的表达水平可以高达30~50 pcd (pg/cell/day)。挑取表达水平最高的3株单克隆，按照常规方法进行无血清驯化和悬浮培养驯化。

取驯化后表达水平最高的克隆进行培养条件的优化，结果显示，在测试的几种培养条件下，该细胞株在250ml摇瓶中的表达水平(10~12天)可以达到1.4g/L(图 2),达到生产要求。

图 2 NESP-Fc细胞株培养条件优化Fig. 2 Optimization of culture conditions The protein concentration was determined by HPLC

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利用ProteinA亲和层析的方法对表达的NESP-Fc融合蛋白进行了纯化，取纯化后的融合蛋白进行蛋白质电泳和免疫印迹分析，结果显示融合蛋白还原条件下分子量为65kDa左右，在非还原条件下为130kDa左右(图 3)，推测是融合蛋白形成了二聚体。

图 3 NESP-Fc纯化产物电泳和分析Fig. 3 SDS-PAGE and Western blotting analyses of NESP-Fc (a) SDS-PAGE (b) Anti-EPO antibody Western blotting 1: Reduced NESP-Fc; 2: Protein marker; 3: Non-reduced NESP-Fc

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UT-7细胞株是一种EPO生长依赖型的细胞，本文采用CCK-8试剂盒通过检测在不同浓度EPO或融合蛋白作用下的UT-7细胞生长情况，检测该融合蛋白的体外生物学活性。检测结果表明NESP-Fc可以刺激UT-7细胞的生长，阳性重组人的EPO对照EC₅₀为1.432ng/ml,约合66.4pmol/L(图 4a)，NESP-Fc的EC₅₀值为7.58ng/ml,按照单体的分子量为65kDa计，约合115pmol/L(图 4b)。由此可见NESP-Fc的生物学活性与重组人的EPO相似，没有较大的降低，因此分子改造是比较成功的。

图 4 NESP-Fc在UT-7细胞上的生物学活性检测Fig. 4 The biological activity assay of NESP-Fc on UT-7 cells (a) Dose-response curve of positive control group (b) Dose-response curve of NESP-Fc

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EPO可以刺激小鼠体内网织红细胞的生成。本文采用近交系雌性BALB/c小鼠，静脉注射给药，通过对高、中、低三个不同剂量组小鼠的周围血网织红细胞计数，从而测定NESP-Fc融合蛋白的体内活性。实验结果表明，NESP-Fc融合蛋白能显著促进网织红细胞的增殖。在相同剂量下，NESP-Fc在促进网织红细胞增殖时与对照组EPO相比更具有长效性。另外，高、中、低三个不同剂量组的结果表明NESP-Fc融合蛋白在促进网织红细胞增殖时具有明显的量效关系，剂量越高，促进网织红细胞增殖的效果越好(图 5)。

图 5 NESP-Fc融合蛋白对体内网织红细胞生成的作用Fig. 5 The action of NESP-Fc on the reticulocyte in vivo

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采用SD大鼠，静脉注射给药，检测了药物在大鼠体内的半衰期。表 1中1#、2#、3#为NESP-Fc融合蛋白给药组大鼠，4#、5#、6#为对照组EPO给药组。大鼠检测结果表明，融合蛋白在大鼠体内的半衰期显著延长，其检测t_1/2平均值为53h；对照重组人的EPOt_1/2平均值为9.78h，与文献报道的相近^[6]。文献报道：NESP在大鼠体内的半衰期是25.3h^[6]；而rhEPO-Fc的半衰期是40h左右^[10]。因此，我们构建的NESP-Fc半衰期比以上几种的半衰期更长，可能更具临床应用价值。

前文所述，由于EPO的半衰期较短，病人每2~3天就要给药一次。这对病人，特别是那些临床上没有其他病症的人带来诸多不便。由此有不少药厂和科研机构研制长效EPO。EPO的PEG化是现在常用的延长EPO半衰期的一种方式，也取得了一定的成功。但是PEG化会导致EPO的结构改变，由此会引起EPO性质(包括特异性)发生改变，从而引起一些机体反应。其他的方法如将EPO与人的血清白蛋白相连，或者是IgG-Fc相连等等；还有的是将EPO或者NESP通过短的linker蛋白或者化学方法连接起来。以上这些方法都在一定程度上提高了EPO的半衰期，但每种方法都有一定的局限性。而本文中将NESP与IgG4的Fc融合的方法尚未见文献报道。

IgG的Fc片段常被用来与活性蛋白连接构成融合蛋白，可以提高活性蛋白在体内的半衰期，从而达到长效的目的^{[11, 12]}。IgG依其在血清中浓度的高低，分为4个亚类，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。我们的NESP-Fc融合蛋白选用IgG2的恒定区，是因为IgG2不易与FcγRI、FcγRII和FcγRIII结合，从而降低了可能引起的抗体依赖的细胞毒作用(ADCC)和补体依赖的细胞毒作用(CDC)。同时，还将IgG2中的Val234和Gly237突变为Ala(氨基酸编号参照Kabat数据库)，进一步降低CH2可能具有的丝裂原活性，保证了融合蛋白具有较低的毒副作用^[13]。

糖基对EPO的生物学活性、水溶性、热稳定性及生物合成均有较大的影响。糖基化发生在特定的氨基酸残基序列上，分为两类：N-连接糖基化，寡糖通过与蛋白质的天冬氨酸的自由基NH₂连接到特征序列Asn-X-Ser/Thr(X代表任何一种氨基酸)中的天冬酰胺上；O-连接糖基化是将糖链转移到多肽链的丝氨酸、苏氨酸或羟赖氨酸的羟基的氧原子上^[14]。EPO含有4个糖基化位点，其中3个N端糖链(Asn24,38,83)和1个O端糖链(Ser126)。EPO的糖基化程度很高，并有2个二硫键连接。美国Amgen公司研制NESP含有5个N端糖链和1个O端糖链，其N端糖基化位点发生在24,30,38,83和88位。糖基化极大地增加了蛋白的分子量，实验结果显示所表达的NESP-Fc融合蛋白分子量高达200kDa，并且以二聚体的形式存在。

本文中的NESP与IgG4的Fc融合和糖基化位点的增加为延长药物半衰期打下了基础。大鼠体内的半衰期研究结果也显示，该NESP-Fc融合蛋白具有更长的半衰期。 NESP在大鼠体内半衰期长达53个小时。经体内外药效学活性检测，该NESP-Fc融合蛋白能明显促进UT-7细胞的生长，与阳性对照EPO相比，EC₅₀十分相近，改造过程NESP的生物学活性保持良好；而且NESP-Fc融合蛋白能促进小鼠体内网织红细胞的增殖，并且与对照EPO相比，两者药学效果非常相似。因此我们对NESP的改造是成功的，以上各项实验为NESP-Fc的进一步研究提供了强有力的基础。研究结果表明，已优化的融合蛋白细胞株表达量高达1.42g/L，符合工业生产的要求，为工业上NESP-Fc的批量生产提供了条件。

综上所述，本研究的NESP-Fc融合蛋白是一种长效EPO,它的生物学活性良好。本研究为NESP-Fc的临床注册申请和产业化奠定了良好的基础。如进一步研究，有望成为临床上治疗贫血的药物。