不耐热肠毒素(Heat-labile enterotoxin，LT)是肠产毒性大肠杆菌(Enterotoxigenic E. coli，ETEC)分泌的一种热不稳定性肠毒素，能引起人畜的严重腹泻，是最好的粘膜免疫佐剂之一^[1,2,3]。LT由1个活性中心A亚单位和5个毒素受体结合位点B亚单位组成，5个完全相同的B亚基在空间形成环状五聚体，LTA位于中央，其C端以非共价键与LTB结合^[4]。

LT作为粘膜免疫佐剂的观点已获得认可，郭学军等^[5]使BALB/c小鼠同时口服靶抗原卵清蛋白(ovalbumin，Ova)和LT后，研究发现小鼠体内产生的抗Ova的IgG抗体和sIgA抗体水平较高，且IgG水平比单独口服Ova后产生的抗体高30倍。此外单独口服Ova的小鼠没有产生粘膜免疫反应，而Ova与LT同时口服后，发生了粘膜免疫反应，表明LT具有粘膜佐剂作用。LT的A亚单位为毒性部分，限制了其作为免疫佐剂在人体上的应用；B亚单位无毒且具有良好的粘膜佐剂活性，从而被广泛研究应用^[6,7,8]。

LTB作为LT的无毒部分，具有良好的粘膜佐剂功效，已在许多基因工程亚单位疫苗中得到应用。Rock等^[9]将LTB与人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonatropin，HCG)β亚基的羧基末端肽进行融合，其表达产物免疫小鼠，产生了识别重组HCGβ亚基或天然HCG的抗体反应，表明LTB具有较好的粘膜佐剂功能。Jobling等^[10]采用LTB基因与肺炎链球菌表面蛋白A(pneumococcal surface protein A，PspA)的基因融合表达产物免疫小鼠，产生了具有免疫活性的重组蛋白。Verweij等^[11]将重组LTB蛋白与流感表面抗原进行混合，通过鼻腔免疫小鼠，发现了高效价的sIgA和IgG抗体，暗示了重组LTB蛋白作为免疫佐剂能够促进机体对蛋白抗原的免疫应答，从而提高抗体产生的水平。

本研究克隆出LTB基因，成功构建了原核表达质粒，通过中试发酵、纯化等技术大量获得高纯度的LTB蛋白，为LTB作为疫苗佐剂研究提供了基础材料。 1 材料与方法 1.1 材 料 1.1.1 菌株及质粒

E.coli DH5α及E.coli BL21(DE3)空白菌株由本实验室提供，LTB-UreB重组质粒由本实验室提供，质粒pMD18-T、pET28a购自宝生物工程(大连)有限公司。 1.1.2 试剂及仪器

质粒DNA提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒均购自AXYGEN公司，限制性内切酶NcoⅠ、XhoⅠ、T4 DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、DNA marker购自宝生物工程(大连)有限公司，Q sepharose High Performance、Sephadex G-25介质购自GE公司，层析柱购自南京大学普阳科学仪器研究院，发酵罐购自上海宝兴生物设备有限公司(罐体积为50L)，管式离心机购自西门子(中国)有限公司。 1.1.3 培养基

Ⅰ、Ⅱ代种子培养基：每升含有10g蛋白胨、5g酵母粉、10g氯化钠，用5mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.4，使用前加入氨苄青霉素至100 μg/ml。

发酵培养基：每升含15.6g磷酸氢二钠、4.3g磷酸二氢钾，1g氯化铵，1g硫酸镁，0.67g氯化钠，3.6g胰蛋白胨，4g酵母粉，6g酸水解酪蛋白，5g葡萄糖，2mg 氯化锌，2.4mg 六水氯化钴，5mg硼酸，4.2mg五水硫酸铜，4mg七水硫酸亚铁，1.6mg四水氯化锰，pH7.4，使用前加入氨苄青霉素至100 μg/ml。

补料培养基：每升含200g葡糖糖、150g酵母粉、150g蛋白胨、18.7g硫酸镁。 1.2 方 法 1.2.1 重组表达载体的构建

以LTB-UreB重组质粒为模板，采用引物5′-CCATGGCTCCTCAGTCTATTA CAGAACTATG-3′和5′-CTCGAGGTTTTCCATACTGATTGCCGCA-3′进行PCR扩增，将PCR产物与pMD18-T载体连接，连接产物转化E.coli DH5α，挑选单克隆，提取质粒，利用NcoⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定正确后，送交生工生物工程(上海)有限公司测序。将鉴定正确的阳性重组质粒与pET28a载体分别用NcoⅠ、XhoⅠ双酶切，采用胶回收试剂盒回收LTB基因片段和pET28a载体片段，以T4 DNA酶8 ℃连接过夜后，转化E.coli BL21(DE3)，挑选单克隆，通过双酶切进行鉴定，将鉴定正确的菌种保存于20%甘油中，－20 ℃冻存。 1.2.2 重组LTB基因工程菌的中试发酵

重组LTB基因工程菌中试发酵分为一代种子培养、二代种子培养和发酵培养三步。将含有重组质粒pET28a-LTB的E.coli BL21(DE3)菌种以1∶100的比例接种于含Kan抗性的LB培养基中，37 ℃、115 r/min摇床培养16h，此为一代种子。按1%的接种量将一代种子接种于含Kan抗性的LB培养基中，37 ℃、250 r/min摇床培养4h，此为二代种子。将二代种子按10%接种量接种于发酵培养基中进行发酵培养。初始发酵条件为：培养基体积25L，温度37 ℃，pH 7.4，发酵罐溶氧60%，搅拌转速200 r/min。随着发酵过程的进行，菌体密度增大、耗氧增加，因此将转数改为级联溶氧控制，以保证发酵液中的溶氧不低于25%。发酵0.5 h后开始补充碳源，添加速度为12 ml/min，6 h补完；发酵1 h后补充氮源，速度为20 ml/min，6.5 h补完。当发酵罐中菌体OD₆₀₀＞30时(约5~6h)，加入终浓度为0.5 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG)开始诱导表达。诱导表达后，每隔1 h取样1次，测定OD₆₀₀，并将留样进行SDS-PAGE实验，以检测目的蛋白表达量。诱导4h后，结束发酵，利用管式离心机20 000 r/min离心收集菌体。 1.2.3 菌体破碎、包涵体蛋白的洗涤及裂解

称取发酵菌体按1∶10(W/V)的比例加入10 mmol/L pH8.5的Tris-HCl 缓冲液，利用高压均质机800bar破菌两次，管式离心机20 000 r/min离心收集沉淀，沉淀即为以包涵体形式表达的重组LTB蛋白。称取包涵体蛋白，按照1∶10(W/V)的比例分别用洗涤液Ⅰ(10 mmol/L Tris-HCl、1% Triton X-100)、洗涤液Ⅱ(12.5 mmol/L Tris-HCl、2 mol/L Urea)洗涤，各重复2次，洗涤条件为：20 ℃搅拌30 min，4 500 r/min离心30 min。将洗涤后的包涵体沉淀用裂解液(50 mmol/L Tris-HCl、8 mol/L Urea)裂解16 h，裂解后，重组LTB包涵体即以可溶性蛋白的形式溶解在裂解液上清中。10 000 g离心60 min，收集上清液，以进行重组LTB蛋白的纯化工作，并利用SDS-PAGE检测裂解液中目的蛋白的纯度。 1.2.4 重组LTB蛋白的纯化

采用Q Sepharose High Performance阴离子交换层析纯化重组LTB蛋白，用平衡液(50 mmol/L Tris-HCl、8 mol/L Urea)平衡Q柱后，将裂解液上清直接上样，线流速为50 cm/h。由于本研究构建载体表达的重组LTB蛋白不与Q柱结合，用平衡液冲柱后，目的蛋白直接从穿透峰中流出，而大部分杂蛋白都与Q柱结合，留在Q柱中，因此，通过分段收集样品可收得纯度较高的目的蛋白。将分段接收的样品进行蛋白电泳检测，发现杂蛋白先从Q柱中流穿，目的蛋白流出较晚，在峰后部收取的样品中目的蛋白的纯度可达到98%。收集的目的蛋白经Sephadex G-25层析脱盐和去除尿素，获得高纯度的、复性的目的蛋白。 1.2.5 免疫双扩散法鉴定重组LTB的蛋白活性配制1.5%的琼脂糖凝胶板，冷却后打孔，在中央孔内加入1μg的兔抗血清，周边孔分别滴加LTB蛋白(1μg、5μg)、阴性对照及空白对照，进行交叉琼脂免疫双扩散实验，以测定重组LTB蛋白的生物活性。 2 结 果 2.1 重组表达载体的构建

以LTB-UreB重组质粒为模板进行PCR扩增，产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定(图 1)。LTB目的基因理论值为330bp，由图 1可知，扩增目的基因片段大小与理论值一致，表明成功克隆出LTB基因。将LTB片段连接到pET28a载体上后，通过NcoⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定，理论值应得到5 230bp的载体和330bp的片段，经琼脂糖凝胶电泳鉴定后发现，结果与理论值相符，表明质粒构建成功(图 2)。

图 1 LTB基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测结果 Fig. 1 Electrophoretic profile of PCR product of LTB 1:Product of PCR; 2: DNA marker DL5000

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图 2 重组质粒pET28a-LTB双酶切琼脂糖凝胶电泳检测结果 Fig. 2 Restriction map of recombinant plasmid pET28a-LTB 1:Recombinat plasmid pET28a-LTB by NcoⅠ,XhoⅠ;2: DNA marker DL5 000

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经研究确定的最佳诱导表达条件为：诱导温度为37 ℃，pH7.4，开始诱导的标准为OD₆₀₀≥30，诱导4h停止。重组菌经IPTG诱导后，分别于诱导0、1、2、3、4 h取样，测定OD₆₀₀，并进行SDS-PAGE检测。OD结果表明，随着诱导时间的延长，OD₆₀₀逐渐升高，诱导4 h时达到最高。SDS-PAGE结果表明(图 3)，重组LTB蛋白分子量为12 kDa，未诱导时，无目的蛋白表达，随着诱导时间的延长，重组LTB蛋白产量持续增加，诱导4 h时达到最高，目的蛋白的表达量占菌体总蛋白的25.4%。

图 3 表达产物的SDS-PAGE检测结果 Fig. 3 SDS-PAGE profile of expressed LTB 1:Protein markers; 2:Before induction(0h);3～6:1,2,3 and 4h after induced by IPTG

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菌体破碎后离心，分别收集沉淀和上清，进行SDS-PAGE检测，结果表明，LTB条带均在沉淀中，上清中没有表达(图 4)，即重组LTB蛋白是以包涵体形式存在，无可溶性表达。将包涵体蛋白洗涤后进行裂解，经SDS-PAGE检测(图 5)，目的蛋白纯度为44.7%，表明四次洗涤过程可去除一部分杂蛋白，起到粗纯的作用。

图 4 菌体破碎后沉淀及上清的SDS-PAGE检测结果 Fig. 4 SDS-PAGE profile of precipitation and broken cell supernatant 1:Cell disruption precipitation; 2: Broken cell supernatant; 3: Protein markers

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图 5 包涵体裂解液SDS-PAGE检测结果 Fig. 5 SDS-PAGE profile of inclusion lysated 1: Protein markers; 2: Inclusion lysated

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经Q Sepharose High Performance层析纯化后，可得到纯度为98%的目的蛋白。SDS-PAGE结果可知(图 6)，在相对分子质量为12 kDa处有一明显的条带，与理论值大小完全相符，表明表达的重组蛋白为LTB蛋白。纯化的目的蛋白经Sephadex G-25层析后，使蛋白复性，SDS-PAGE检测结果表明(图 7)，LTB蛋白纯度为95.7%。

图 6 Q柱纯化样品SDS-PAGE检测结果 Fig. 6 SDS-PAGE profile of Q column-purified 1: Protein markers; 2,3,4,5:Peak flow through the sample at different times

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图 7 G-25层析样品的SDS-PAGE检测结果 Fig. 7 SDS-PAGE profile of G-25 sample 1:Recombinant LTB protein chromatographied by G-25; 2: Protein markers

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将1μg兔抗血清、空白对照、阴性对照和重组LTB蛋白加入到琼脂糖凝胶板中，置于37 ℃孵育48 h后，观察并记录实验结果。实验结果显示，在兔抗血清与重组LTB蛋白之间出现明显的白色沉淀带，而兔抗血清与阴性对照、空白对照之间未出现白色沉淀带(图 8)，表明纯化的重组LTB蛋白具有较强的活性。

图 8 重组LTB蛋白免疫双扩散检测结果果 Fig. 8 The result of protein immune double diffusion of recombinant LTB 1,2:Recombinant LTB;3:Negative control;4:Blank;5: Antiserum of rabbit

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目前多数疫苗通过皮下或肌肉注射接种，无法诱导粘膜产生抗体，而且绝大多数抗原经粘膜免疫时免疫原性较弱，因此开发能够增强疫苗免疫原性的粘膜佐剂变得尤为重要。多项研究表明LTB具有较好的粘膜免疫佐剂作用^[12,13]，且天然LTB和基因工程生产的LTB都有良好的粘膜免疫佐剂功能^[14]。

目前，LTB发酵及诱导表达均采用三角瓶进行，该方法产量低，发酵条件难以控制，无法达到工业化生产要求。本研究构建的pET28a-LTB重组质粒能够高效表达LTB，表达产量可占总蛋白的20%以上。本文利用发酵罐进行发酵培养重组LTB菌种，通过本文中所述的参数及条件控制，在诱导表达后，使目的蛋白表达量达到了总菌体蛋白量的25.4%，解决了因摇瓶发酵产量低的难题，实现了LTB的生产。

蛋白质纯化和复性是基因工程下游工艺，不同的蛋白质由于其理化性质不同，其纯化和复性的条件也不同^[15]。目前LTB纯化主要有两种：一种是采用亲和层析法^[16,17]，另一种是采用离子交换层析加疏水层析法^[1]。然而，前者采用多梯度洗脱法进行纯化且需去除组氨酸标签，而后者则需进行多步纯化才可得到纯度较高的目的蛋白，因此现今人们较多采用的纯化方法生产成本较高，耗时较长，不利于工业化生产。

本研究采用的上述制备方法，使目的蛋白不与Q柱结合，可通过分段接取穿透液的方式进行纯化，不用梯度洗脱即可获得纯度为98%的目的蛋白。将G-25层析复性后的蛋白进行免疫双扩散实验，结果表明本研究中制备的重组LTB蛋白具有良好的免疫活性。本研究中的纯化工艺相对于其他研究中的工艺而言，可达到简捷、高效、省时，节约成本，且不影响目的蛋白的生物学活性的目的，因此，更利于工业化生产，为LTB的产业化奠定了基础。

综上所述，本实验成功构建了LTB基因的高效表达载体，确定了中试发酵生产的工艺条件，建立了更为省时、省事、简便的纯化方法，为LTB的产业化奠定了基础。