心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)是威胁人类健康的主要疾病，尤其是高血压和心力衰竭，仍然是一个严重的公共卫生问题^{[1, 2]}。目前，心血管疾病在欧洲每年造成180万人过早死亡^[3]，且发病率仍在急剧增加，发病年龄也有所提前。Knecht等^[4]在充血性心力衰竭动物模型的研究中发现肾脏Neprilysin蛋白含量增加，表达上调。Neprilysin (NEP,EC 3.4.24 .11 )是Kerr等^[5]于1974年首先从兔肾小管的刷状缘细胞中分离获得，是能水解胰岛素B链的肽酶。NEP属于M13锌金属蛋白酶家族的一员，是一种Ⅱ型整合细胞膜的谷氨酸锌蛋白，广泛分布于内皮细胞、血管平滑肌细胞、心肌细胞、肾脏上皮细胞和纤维母细胞的表面，在肺、肠、肾上腺、脑等器官中也发现有NEP，分布极其广泛。研究表明，NEP对许多在内环境稳态中起重要作用的血管活性肽，如利钠肽(natriuretic peptide，NP)^[6]、肾上腺髓质素，缓激肽(Bradykinin，BK)^[7]等具有降解作用，抑制NEP能增加这些血管活性肽的血浆水平及活性，延缓心力衰竭进展，因此NEP成为治疗心血管疾病的一个重要靶点。

自发现NEP靶点以来，人们已研究设计出多种抑制剂。最初研究的DL-Thiorphan，Phosphoramidon，Candoxatril是单独作用于NEP的有效抑制剂，能够促进尿钠排泄和血管舒张^{[8, 9]}，因其抑制了NEP对血管紧张素Ⅱ(Angiotensin-Ⅱ，Ang-Ⅱ)的降解而没有应用于治疗。基于以上认识，研究人员着手研究NEP和血管紧张素转换酶(ACE)的双重抑制剂，减少Ang-Ⅱ的形成，增加体内NP及BK浓度，发挥血管扩张作用，其代表药为奥帕曲拉(Omapatrilat)。临床研究表明，Omapatrilat的生物利用度良好，有长效的降压作用^[10]，且能改善心力衰竭患者的心功能，但副反应很大，会导致很高的血管性水肿发生率^[11]，因此诺华研究出一类新药LCZ696，是血管紧张素受体-脑啡肽酶双重抑制剂(dual-acting angiotensin receptor neprilysin inhibitors，ARNi)，由血管紧张素受体拮抗剂缬沙坦(valsartan)与NEP抑制剂前药AHU-377以1∶1固定剂量相组合，能更有效地治疗心脏衰竭和高血压^{[12, 13, 14, 15]}，并且能降低血管性水肿的发生率，目前已经顺利完成III期临床试验，预期年内将提交美国上市申请。

NEP作为可靠、有效的心衰和高血压治疗药物的分子靶标，具有重要的药物研发价值。可以预见，以其抑制剂为主要成分的治疗性药物在未来数年间将成为主要的临床选择。但实际上，世界范围内至今仍无靶向NEP的特效药正式获批上市，后续在研的储备品种也较为有限。为发掘我国天然药物资源在治疗心脑血管疾病方面的应用，为NEP靶向抑制剂的研发提供更多后续选项，本研究利用真核表达系统毕赤酵母重组表达具有生物活性的NEP蛋白酶，建立以NEP蛋白酶为靶点的体外高通量药物筛选模型，进一步以本单位天然产物分段组分库为筛选集，开展药物筛选工作并获得了初步的结果。 1 材料与方法 1.1材料及仪器

大肠杆菌DH5α、毕赤酵母表达载体pPICZα-A、毕赤酵母菌X-33均为本实验室保存。Pfu DNA聚合酶、限制性核酸内切酶、T4 DNA连接酶购自Fermentas公司；质粒 DNA 小量提取试剂盒及琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自Bio Flux公司； Fluoroskan Ascent荧光读数仪、LEGEND MACH 1.6R台式冷冻离心机购自Thermo Labsystems公司(芬兰)；DL-Thiorphan购自Sigma公司；电转化仪器购自Eppendorf公司；荧光底物MCA-RPPGFSAFK-Dnp购自吉尔生化有限公司。二甲基亚砜(DMSO)等化学试剂为市售分析纯。

待筛选的天然产物分段组分为本实验室保存。 1.2 方 法 1.2.1 质粒构建

由NCBI检索，确定人源NEP的编码区序列(NM 007289.2)，设计上游引物：5′-GGGGTACCTACGATGATGGTATTTGCAAGTCATC-3′(酶切位点KpnⅠ)，下游引物：5′-AGAAATAGCGGCCGCCCAAACCCGGCACTTC-3′(酶切位点NotⅠ)。用含有合成核苷酸序列的pMD18-T为模板，进行PCR扩增，将扩增得到的PCR产物及载体pPICZα-A同时用KpnⅠ和NotⅠ进行双酶切，分别将酶切产物进行回收，再用T4 DNA连接酶进行酶连，转化至大肠杆菌DH5α感受态，涂布于含有Zeocin抗性的LB低盐培养基的平板上，37℃避光培养。提取重组质粒，经PCR和双酶切鉴定正确后，重组质粒核苷酸序列经金唯智公司检测确认。 1.2.2 蛋白的表达、纯化和鉴定

取10μg测序正确的pPICZα-A-NEP质粒，用限制性内切酶SacⅠ线性化回收后，采用电转化法转化至酵母感受态X-33中，转化产物涂布在含有Zeocin抗性的YPD固体培养基上，30℃避光培养至长出单克隆转化子，挑取单菌落进行PCR鉴定筛选出含有目的基因的转化子。

将上述PCR鉴定为阳性的重组毕赤酵母单菌落接种于YPD培养基中，30℃ 250r/min振荡过夜培养。将菌液全部接种于100ml BMGY培养基，30℃ 250r/min摇床培养至OD₆₀₀ =2.0~6.0。4℃ 3000r/min离心10min收集菌体，弃上清，用诱导培养基BMMY重悬菌体，使OD₆₀₀ =1.0(约200ml)，30℃ 250r/min开始诱导培养。每隔24h向培养基中添加2ml 100％甲醇至终浓度为1.0%，诱导表达96h。

培养后的菌液于4℃ 5500r/min离心20min，收集上清。将上清液流穿Ni²⁺-NTA琼脂糖凝胶柱，使融合蛋白结合到Ni²⁺-NTA琼脂糖凝胶柱上，用含有10mmol/L咪唑的缓冲液(25mmol/L Tris-HCl pH7.5，100mmol/L NaCl，5% 甘油)冲洗去除杂蛋白，用含有100mmol/L咪唑的缓冲液(25mmol/L Tris-HCl pH7.5，100mmol/L NaCl，5% 甘油)洗脱目的蛋白。纯化的目的蛋白通过聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western blot)进行检测。 1.3 药物筛选体系的建立及应用 1.3.1 药物筛选体系的建立

本模型中以MCA-RPPGFSAFK-Dnp作为NEP酶活检测荧光底物。当序列未被切割时，由于淬灭基团对荧光基团有淬灭作用，体系不会发出荧光。加入NEP蛋白后，多肽被切割，荧光基团远离淬灭基团，荧光基团MCA能在320nm的激发光下发射出波长为405nm的荧光。荧光信号值可以用Fluoroskan Ascent荧光读数仪检测到，并通过反应初速度来标定NEP蛋白酶活性以及天然组分的抑制活性。通过对缓冲液组分如pH、盐离子浓度、温度等条件的优化，计算EC₈₀与K_m，确定体系最适缓冲液成分、蛋白浓度和底物浓度。 1.3.2 抑制剂的筛选方法

用95%的DMSO溶解天然组分和底物，浓度分别为50mg/ml和10mmol/L。蛋白溶液稀释至0.5μmol/L。在96孔板中分别加入97μl蛋白溶液和1μl待筛选药物作为实验组，同时设阴性对照和阳性对照，其中阴性对照为等量蛋白溶液、和DMSO，阳性对照为等量蛋白溶液及NEP抑制剂DL-Thiorphan，将实验组和对照组都于37℃孵育10min后加入2μl底物储液，振荡混匀5s，立即检测，加入抑制剂和药物的反应初速率为V_i，加入DMSO的反应初速率为V₀，通过抑制率(Inhibition ratio,Ir)公式Ir=1－×100%计算药物及抑制剂DL-Thiorphan的抑制率。同时采用淬灭率排除假阳性，96孔板中先后分别加入97μl蛋白溶液和2μl底物储液，振荡混匀5s，立即检测，得到最大荧光值Q₁，反应达到平衡后加入1μl待筛选药物，再立即检测得到最大荧光值Q₂，由淬灭率(Quenching ratio,Qr)公式Qr=×100% 计算淬灭率。

将Ir>80%、Qr<40%的活性组分进行梯度稀释，通过测定其半数抑制浓度IC₅₀对其抑制活性进行比较，得到抑制活性最好的活性组分。 2 结 果 2.1 目的基因克隆以及目的蛋白表达纯化

pPICZα-A-NEP重组质粒通过KpnⅠ和NotⅠ双酶切鉴定，插入DNA片段与目的基因实际大小(2097 bp)一致。测序结果表明和NEP胞外区的编码基因序列完全相符。目的蛋白经过亲和层析纯化后，SDS-PAGE及Western blot检测结果如图 1，图中蛋白提纯效果较好，可用于后续药物筛选体系的建立。

图 1 SDS-PAGE分析(a)及Western blot检测(b) Fig. 1 SDS-PAGE (a) and Western blot (b)M: Protein marker; NEP: Purified target protein

图选项

将目的蛋白溶解于不同pH的缓冲液中，加入底物进行检测，并计算酶促反应初速度。根据酶促反应初速度与缓冲液pH作图(图 2)，可知在50mmol/L HEPES(pH 7.2)中，反应初速度最高，酶的活性最好。

图 2 缓冲液及pH对酶活性的影响Fig. 2 Effect of buffer and pH on enzyme activity

图选项

将目的蛋白溶于含有不同浓度NaCl的HEPES缓冲液中，加入底物进行检测，并计算酶促反应初速度。根据酶促反应初速度与NaCl浓度作图(图 3)，可知，反应体系中NaCl浓度为25mmol/L时，反应初速度最高，酶的活性最好。

图 3 NaCl浓度对酶活性的影响Fig. 3 Effect of NaCl on enzyme activity

图选项

将目的蛋白溶于含有不同浓度ZnCl₂的缓冲液[50mmol/L HEPES(pH7.2)，25mmol/L NaCl]，加入底物进行检测，并计算酶促反应初速度。根据酶促反应初速度与ZnCl₂浓度作图(图 4)，可知，缓冲体系中未添加ZnCl₂时，反应初速度最高，酶的活性最好。

图 4 ZnCl2浓度对酶活性的影响Fig. 4 Effect of ZnCl2 on enzyme activity

图选项

将目的蛋白溶于含25mmol/L NaCl的HEPES缓冲液中，分别在4℃、26℃、30℃、37℃、45℃孵育15min，加入底物进行检测，并计算酶促反应初速度。根据酶促反应初速度与温度作图，结果如图 5所示，酶的最适温度为37℃。

图 5 温度对酶活性的影响Fig. 5 Effect of temperature on enzyme activity

图选项

固定底物浓度为200μmol/L，蛋白浓度从10μmol/L进行梯度稀释，共8个梯度，检测后根据最大荧光值与酶浓度对数值作图(图 6)，计算蛋白浓度EC₈₀约为0.08μmol/L。

图 6 滴定蛋白浓度Fig. 6 Determination of protein concentration

图选项

固定蛋白浓度为0.08μmol/L，底物浓度从400μmol/L进行梯度稀释，由米氏方程计算K_m值约为100μmol/L(图 7)，反应体系的动力学参数V_max=3.6μM/s，K_cat/K_m=4.5×10⁵M^-1s^-1。

图 7 Km的测定Fig. 7 Determination of Km

图选项

以NEP蛋白酶为靶标建立的药物筛选体系为：反应体系酶的浓度为0.08 μmol/L，底物浓度为100μmol/L，酶促反应缓冲液为50mmol/L HEPES(pH 7.2)，25mmol/L NaCl，反应温度为37℃。通过计算Z因子对建立的药物筛选体系进行评定。Z因子是信号区间和变异的组合，计算公式可表示为：Z-factor=1－3×(σ_p+σ_n)/|μ_p－μ_n|(σ：标准差；μ：平均值；p：信号；n：背景)。当0.5≤Z＜1时，表示信噪比较大，数据平行性较好，药物筛选体系较为理想。

本研究中Z因子为0.89>0.5，由此可确定建立的药物筛选体系较为理想，可以用来进行药物筛选。 2.3 NEP抑制剂的筛选结果

测定阳性药DL-Thiorphan的IC₅₀为(18.8±0.015)nmol/L(图 8)。

图 8 DL-Thiorphan的抑制曲线Fig. 8 Inhibition curve of DL-ThiorphanIC50=(18.8±0.015) nmol/L,R2=0.9350

图选项

应用建立的药物筛选体系对实验室天然产物组分库进行初步筛选，从中筛选出Ir>80%的活性组分共34种，进一步对其进行排除假阳性的筛选，最后确定Ir>80%，Qr<40%的活性组分有4种，分别是MDCNCL01000232、MDCNCL01000240、MDCNCL01000241、MDCNCL01000242(抑制曲线如图 9)。对这4种活性组分进行浓度梯度的稀释，测定半数抑制浓度IC₅₀对其抑制活性进行比较，详见表 1。最终得到一种抑制活性最好的活性组分MDCNCL01000242，IC₅₀值为(8.31±0.03)μg/ml(图 10)。

图 9 抑制曲线Fig. 9 The reaction process curve

图选项

图 10 MDNCCL01000242的抑制曲线Fig. 10 Inhibition curve of MDNCCL01000242IC50=(8.31±0.03)μg/ml,R2=0.9938

图选项

高通量药物筛选技术是药物研发过程中寻找新药的重要手段^[16]。通过分子结构等信息指导化学合成手段寻找新药的策略，虽然一定程度上规避了高通量药物筛选的盲目性，但受化合物合成能力和化合物本身多样性的限制，实际效率并不突出。天然产物凭借悠久的知识积累和普遍优良的成药性，加之丰富的结构类型和相对丰富的资源储备，使其在医药领域的开发与研究得到了越发普遍的重视。利用高通量药物筛选技术可以提高天然产物样品的利用度和先导化合物的发现速率，并能显著地缩短整个药物筛选的周期，对于提高天然药物后期开发的成功率具有重要的意义^[17]。

NEP蛋白酶能降解多种血管活性肽，是心脑血管疾病治疗中的重要靶点。本研究利用毕赤酵母表达系统，构建表达载体pPICZα-A-NEP，表达载体通过与酵母菌X-33基因组染色体发生同源重组，整合于染色体后实现NEP蛋白的表达。以NEP为靶点，通过优化各种反应条件，包括缓冲液pH、离子强度、温度、酶浓度、底物浓度的依次摸索实验，建立了药物筛选体系，即酶促反应缓冲液为50mmol/L HEPES(pH 7.2)，25mmol/L NaCl，反应温度为37℃，蛋白浓度和底物浓度分别为0.08μmol/L和100μmol/L，通过测定Z因子(Z-factor=0.89>0.5)对体系进行评估可知建立的药物筛选体系较为理想。应用建立的药物筛选体系筛选本单位天然产物分段组分库中1 000种天然产物组分，得到4种抑制率较高的活性组分，均来源于神黄豆的分离提取物，通过对这4种活性组分进行浓度梯度稀释，测定半数抑制浓度IC₅₀，最终发现MDCNCL01000242抑制效果最好。

目前针对NEP蛋白酶抑制剂的筛选试验还在进行中。本研究筛选到的活性成分为神黄豆的分离提取物，神黄豆是豆科决明属乔木植物，产于云南，广西等省区以及中南半岛的深山地林中，可治胃痛、麻疹、水痘、便泌等^[18]。由于实验室天然产物组分库主要是以中药材提取分离后含多种化合物成分的物质组成，作用方式上具有多成分的特性。因此我们需要将已筛选的神黄豆活性组分继续进行分离提取，并将进一步分离提取到的物质进行活性跟踪，直至得到具有药效的最小活性物质组分或单体成分，作为药物研发的先导物。