真菌感染始终是困扰人类健康的一大顽固性疾病。据统计，欧洲70%的疾病患者死于曲霉菌和念珠菌感染^{[1, 2]}，其中15%为造血干细胞移植患者^[3]、20%为呼吸器官移植患者^[4]、60%为肺炎及艾滋病患者^[5]。在美国，血流念珠菌感染者居感染类病患的第4位，而东南亚地区30%的艾滋病患者都有青霉菌感染症状^[6]。究其原因，顽固性真菌感染主要是由于人类对抗生素药物的过度使用而使真菌耐药性增强，特别是在免疫系统损坏的情况下，机体对真菌的抵抗能力降低，而一般抗生素又难以对这些真菌进行有效抑制，从而导致一些真菌性感染持续难愈。因此，寻找一种新的安全有效的抗真菌药物就显得十分重要。米卡芬净和阿尼芬净等棘白霉素类药物作为新型抗真菌药物，以真菌细胞壁为作用靶点，非竞争性抑制β-1,3-D-葡聚糖合成酶的活性^[7]，使细胞壁中葡聚糖含量降低，破坏真菌细胞稳定性，最终使其裂解死亡。临床研究发现，该类药物具有强大的体内抗真菌活性，且不存在交叉耐药性^{[8, 9, 10, 11]}。

棘白霉素类药物是由环状六肽核及脂质侧链连接而成的，属于半合成脂肽。目前，已完成临床实验并成功开发上市的棘白霉素类药物主要有阿尼芬净(anidulafungin)、米卡芬净(micafungin)、卡泊芬净(caspofungin)^{[12, 13, 14, 15]}。前两者具有相同的生产工艺，其工业生产过程均包括三个环节：一是棘白霉素天然产物原料的发酵获取；二是棘白霉素天然产物的脱脂酰化，获得棘白霉素类药物的环状肽核，这是一步生物催化转化反应，由来源于犹他游动放线菌(Actinoplanesutahensis NRRL 12052)的棘白霉素脱酰酶(EchDA)催化；三是棘白霉素类药物环状母核的再酰基侧链化修饰，从而生成最终产品，该步反应是化学合成反应，所用酰基侧链由人工化学法合成。在此过程中，棘白霉素脱酰化是阿尼芬净和米卡芬净生产中的一个关键环节，我国相关制药企业在脱酰化反应中采用A. utahensis野生菌转化的工艺，但野生菌发酵表达的EchDA量不高，催化反应的底物(如米卡芬净的前体FR901379)浓度仅能达到1~2 g/L，严重限制了生产效率，无法满足大规模工业化生产，因此提高这步脱酰化反应的工作效率，必将有助于提高我国芬净类药物的生产水平和市场竞争力。

为了提高棘白霉素脱脂酰侧链的反应效率，提高EchDA的表达水平是关键，最为有效的方法是构建基因工程菌，对此国内外有多项研究^{[16, 17]}。最近，上海医药工业研究院的Shao等^[16]对此进行了研究，把来源于A. utahensis的棘白霉素脱酰酶基因在A. utahensis自身和链霉菌S. lividans TK24和S. albus中进行了过表达。结果表明，该酶在自身菌株中的过表达具有较好的效果，与原始菌相比，对棘白霉素B的转化浓度由0.36 g/L提高到了4.21g/L；在此项研究中，棘白霉素脱酰酶在自身菌株中的表达为胞内表达，对棘白霉素底物的转化采用静息细胞转化。与静息细胞转化相对应的，还有一些工作是对棘白霉素脱酰酶进行了胞外表达，利用发酵上清液对棘白霉素底物进行转化。例如，日本安斯泰来制药公司从Streptomyces sp. No. 6907中筛选获得一种棘白霉素脱酰酶，并把该酶在S.lividans1326中进行了分泌型异源过表达，与原始菌相比，酶活提高了250倍^[17]。

EchDA是一种异源二聚体，由同一段基因(echda)编码的大小两个亚基构成。来源于A. utahensis NRRL 12052的EchDA是最先被发现并已用于工业生产的一种脱酰酶，其大亚基为63 kDa，小亚基18~20 kDa，活性不受辅酶因子、金属螯合剂等的影响，该酶可作用于多种棘白霉素类天然产物，目前在医药工业上主要用于阿尼芬净(底物是棘白霉素B)和米卡芬净(底物是FR901379)的生产^{[18, 19]}。

本研究针对来源于A. utahensis NRRL 12052的棘白霉素脱酰酶，拟开发一种能够在S. lividans TK24中高效异源表达的基因工程菌，并对基因工程菌的发酵进行小试及中试放大研究，考察、优化发酵参数，希望有助于我国阿尼芬净和米卡芬净工业生产技术的提高。为了表征基因工程菌的活性，本研究统一以米卡芬净前体FR901379仅为底物，对棘白霉素脱酰酶的活性进行测定和表征。 1 材料与方法 1.1 材 料 1.1.1 菌株和试剂

犹他游动放线菌(A. utahensis NRRL 12052)、变铅青链霉菌(S.lividans TK24)和表达载体pNW-S1由本实验室保藏；大肠杆菌 DH5α购自天根生化科技有限公司；限制性内切核酸酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、蛋白质Marker及DNA Marker均购自TaKaRa公司；DNA纯化、胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒均来自Omega试剂公司；引物由上海桑尼生物科技有限公司合成；IPTG购自Sigma；其他试剂均为国产或进口分析纯产品。 1.1.2 培养基

大肠杆菌采用LB培养基进行培养，犹他游动放线菌和变铅青链霉菌采用蛋白胨培养基(TBS)进行培养。R2YE培养基用于链霉菌转化培养，合成V号培养基用于链霉菌的斜面培养。

LB培养基(L)：蛋白胨 10 g，Yeast Extract 5 g，氯化钠 10 g，调节pH至7.0。固体培养基需加2%琼脂粉。

TBS种子培养基(L)：蛋白胨10 g，酵母粉10 g，葡萄糖10 g，NaCl 0.5 g，KH₂PO₄ 1 g,K₂HPO₄·3H₂O 1.5 g,NaOH调节pH至7.0。

TBS发酵培养基(L)：蛋白胨 10 g，酵母粉10 g，葡萄糖7 g，NaCl 0.5 g，KH₂PO₄ 1g，K₂HPO₄·3H₂O 1.5 g，NaOH调节pH至7.0。

R2YE培养基(%)：硫酸钾0.025，Peptone 0.4，葡萄糖1.0，蔗糖10.3，Yeast Extract 0.4，Tryptone 0.2，琼脂粉2.4。使用前加入微离子溶液0.2 ml，Tris-HCl(0.25 mol/L，pH 7.2) 10.0 ml，磷酸二氢钾(0.5%) 1.0 ml，氢氧化钠 (1 mol/L) 0.5 ml，氯化钙(3.68%) 8.0 ml，pH nature。

微离子溶液(%): 硼酸钠0.001，氯化锌0.004，氯化铁0.02，氯化铜0.001，(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 0.001，氯化锰0.001。

合成V号培养基(%): 可溶性淀粉2.0，牛肉膏0.1，磷酸氢二钾0.05，氯化钠 0. 05，硫酸亚铁0. 001，硝酸钾0.1，硫酸镁0.05,琼脂2.4，调节为pH 7.0~7.2。 1.2 方 法 1.2.1 EchDA表达载体的构建

采用T.H.Al-Samarrai所描述的提取基因组的方法，从A. utahensis NRRL 12052中获取基因组DNA^[20]，根据NCBI中已有的放线菌EchDA的保守序列，设计引物，上游引物5′- gggaattccatatggtgacgtcctcgtacatgcg-3′，下游引物5′- attgaattctcagcgtccccgctgtgccacc-3′，以A. utahensis NRRL 12052基因组DNA为模板，通过PCR获取EchDA的编码基因echda。通过EcoRI/NdeI酶切，用T4 DNA连接酶连入同样酶切的pNW-S1载体(以P_lac为启动子，IPTG诱导型)，构建重组载体pNW-S11。将重组载体转化大肠杆菌DH5α，挑取单菌落进行PCR和酶切验证，由桑尼生物公司测序，测序结果与NCBI中EchDA的基因序列进行比对分析。

从NCBI中获取组成型启动子P_ermE^*和P_Sau3A的基因序列，由桑尼生物公司人工合成，合成时在基因的两端引入XbaI和SpeI酶切位点，在质粒pNW-S11的P_lac启动子和echda之间存在XbaI和SpeI两个单酶切位点，因此通过XbaI/SpeI酶切，用T4连接酶可分别把PermE^*和PSau3A引入pNW-S11中，依次得到重组载体pNW-S12(含P_lac-P_ermE^*-echda表达盒)和pNW-S13(含P_lac-P_Sau3A-echda表达盒)，转化大肠杆菌DH5α，挑取单菌落进行PCR和酶切验证，并由桑尼生物公司测序，测序结果正确后保存备用。 1.2.2 EchDA基因工程菌的构建与发酵培养

将重组载体pNW-S11、pNW-S12和pNW-S13以原生质体转化的方法导入S. lividans TK24，在R2YE培养平板上培养12 h后加盖阿泊拉霉素100 μg/ml，置于28℃继续培养4天，挑取单菌落，PCR验证后保存备用。验证正确的基因工程菌，于30 ml TBS(阿泊拉霉素100 μg/ml)培养基中先进行一级种子培养，加入适量无菌玻璃珠防止菌丝体结球，28℃、220 r/min振荡培养3天后，再以10%的接种量继续接种于TBS培养基中进行二级种子培养，28℃、220 r/min振荡培养2天后，以7%的接种量接种于TBS培养基中进行发酵，加入IPTG进行诱导，28℃、220 r/min振荡培养60 h。 1.2.3 EchDA对米卡芬净合成中间体FR901379的转化

酶活单位：在30℃、pH 5.5的条件下，每分钟水解FR901379生成1 μmol米卡芬净前体FR179642所需酶量定义为1个酶活力单位(U/ml)。

将发酵液离心(8 000 r/min、10 min)后取发酵上清液2.5 ml，加入底物FR901379 2.5 ml(终浓度为15 mg/ml)进行转化反应(30℃、200 r/min)，用磷酸和NaOH调节pH为5.5，反应30 min后取100 μl，加入少量磷酸终止反应，加水稀释10倍后测酶活。每隔2 h取其100 μl用水稀释40倍后检测产物及底物浓度，计算底物的摩尔转化率。 1.2.4 最佳反应条件的测定

转化温度为30℃时，测定酶活和底物摩尔转化率随pH(4.5~8)的变化曲线，得到最佳酶反应pH。反应pH为5.5时，测定酶活和底物摩尔转化率随温度(20~40℃)的变化曲线，得到最佳反应温度。 1.2.5 转化反应的HPLC分析

取反应液用水稀释后混匀，振荡使沉淀充分溶解，12 000 r/min离心10 min，取出上清液进行HPLC分析。Agilent1100 型高效液相色谱仪，依利特Hypersil ODS2 5 μm 4.6 mm×250 mm色谱柱，柱温25℃。采用DAD紫外检测器，检测波长为210 nm；流动相为A：0.5%磷酸二氢钠；B：乙腈-甲醇(70∶30)；流速：1 ml/min；进样量：10 μl。梯度洗脱。产物检测条件：0~5 min A∶B＝97∶3，5~8 min A∶B＝97∶3~50∶50，8~12 min A∶B＝50∶50~97∶3,12~20 min A∶B=97∶3；底物检测条件0~4 min A∶B＝50∶50，4~10 min A∶B＝50∶50~20∶80，10~16 min A∶B＝20∶80~50∶50,16~22 min A∶B=50∶50。 1.2.6 诱导剂的浓度梯度实验

基因工程菌株经过二级种子培养后，以10%的接种量接种于TBS发酵培养基，同时加入诱导剂IPTG。携带诱导型启动子的工程菌株诱导剂的浓度梯度为0 mmol/L、0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.3 mmol/L、0.35 mmol/L、0.4 mmol/L、0.45 mmol/L、0.5 mmol/L，同时携带诱导型和组成型启动子的工程菌株诱导剂的终浓度依次为0 mmol/L、0.02 mmol/L、0.04 mmol/L、0.06 mmol/L、0.08 mmol/L、0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.3 mmol/L、0.4 mmol/L、0.5 mmol/L、0.6 mmol/L，诱导发酵60 h后，离心收集发酵上清液，测定不同诱导剂浓度下的表达量及酶活。 1.2.7 EchDA基因工程菌的发酵中试放大

一级摇瓶种子培养3天后，以10%的接种量接种于30 L发酵罐，培养基20 L，进行二级种子培养，调节pH 至7.0、接种量为10%、通气量1∶1(V/min)、搅拌转速为200 r/min。2天后，接入300 L发酵罐，培养基200 L，加入诱导剂IPTG使其终浓度为5 mg/ L，通气量1∶1(V/min)，搅拌转速为200 r/min，28℃培养48h，同时监控溶氧、pH等发酵参数随时间的变化曲线。 2 结 果 2.1 Echda基因的扩增、克隆及鉴定

以A. utahensis NRRL 12052的基因组为模板，PCR得到扩增片段2.4 kb(图 1a)，与已报道的基因大小一致。将其插入到链霉菌表达载体pNW-S1的EcoRI和NdeI酶切位点之间，获得重组载体pNW-S11。转化DH5α后，挑取阳性克隆进行菌落PCR验证(图 1b)，结果与目的片段的理论值一致。提取pNW-S11质粒送测序，测序结果与已报道的echda(BD226911)序列同源性为99%，可以确定克隆得到的片段为EchDA的编码基因。

图 1 EchDA编码基因echda的克隆 Fig. 1 Gene clone of echinocandindeacylase(a) PCR product of A. utahensis NRRL 12052 genome (b) PCR verification of pNW-S11 (c) PCR verification of the echinocandindeacylase gene from transformed S. lividans TK24

图选项

利用原生质体转化法将重组载体pNW-S11导入S. lividans TK24，挑取阿泊拉霉素抗性克隆接种于TBS液体培养基中，28℃振荡培养3天，抽提基因组进行PCR验证。结果如图 1(c)所示。扩增产物大小为2.4 kb左右，随后对PCR产物进行测序验证，与质粒pNW-S11中的目的基因序列进行比对，同源性为100%，表明EchDA表达基因echda成功导入变铅青链霉菌中。将得到的阳性转化子克隆命名为ZNW-S11。 2.3 EchDA在变铅青链霉菌中的诱导表达

将基因工程菌株ZNW-S11接种于30 ml TSB中(250 ml摇瓶)进行发酵培养，加入0.5 mmol/L的IPTG进行诱导，60 h后取发酵上清液进行SDS-PAGE凝胶电泳分析，以带有空载体pNW-S1的工程菌株ZNW-S1作为对照。如图 2(a)所示，基因工程菌株ZNW-S11的发酵上清液中在63 kDa附近有明显条带，18~20 kDa附近的条带依稀可见。EchDA由一段基因echda编码，但表达后会切割成大小两个肽段，大肽段约63 kDa、小肽段18~20 kDa，这两个肽段构成大小两个亚基并嵌合在一起时才能成为活性EchDA，由于小亚基分子质量较小，在图 2(a)所示的蛋白质胶中显示并不清晰，为了清晰显示小亚基，通过硫酸铵沉淀法对EchDA的发酵液进行浓缩，蛋白质电泳图如图 2(b)所示，可以看出发酵液经过浓缩后在18~20 kDa处有一条较明显的蛋白质条带。图 2表明EchDA在ZNW-S11中成功获得了异源分泌表达。

图 2 基因工程菌ZNW-S11的蛋白表达情况Fig. 2 Protein expression of genetic engineering strains ZNW-S11(a) M: Marker; 1: ZNW-S1; 2: ZNW-S11 without IPTG; 3: ZNW-S11 withIPTG (b) con: The culture supernatant of ZNW-S11 with IPTG；1~4: The concentrated supernatant of con by ammonium sulfate precipitation

图选项

为了评估ZNW-S11异源分泌表达的EchDA是否具有工业应用价值，以米卡芬净的合成前体FR901379为底物，对分泌表达的EchDA进行测活分析。离心收集ZNW-S11的发酵上清液，向其中投加FR901379至终浓度为15 g/L，利用高效液相色谱仪对产物进行检测，结果如图 3所示，转化体系中的产物和FR901379脱除脂酰侧链标品(FR179642)具有一致的保留时间(4.4 min)，这说明来源于A. utahensis NRRL 12052的EchDA在S. lividans TK24中得到了活性分泌表达。

图 3 ZNW-S11发酵上清液转化FR901379为FR179642的HPLC图谱Fig. 3 HPLC analysis of the conversion of FR901379 to FR179642 by the fermentation supernatant of ZNW-S11(a) FR901379 conversion by the fermentationsupernatant of ZNW-S11 (b) Standard FR179642

图选项

测活表明，在摇瓶发酵水平上，ZNW-S11的发酵液活性在40 h前快速增长，48 h左右达到高峰，并可维持到72 h左右。由于采用的是IPTG诱导性启动子来表达EchDA，因此目标蛋白的表达活性直接依赖于IPTG的添加浓度。图 4表明，在诱导剂浓度为0~0.5 mmol/L时，工程菌株ZNW-S11的蛋白质表达量及酶活随诱导剂浓度的增加而增加，当IPTG浓度为0.5 mmol/L时，蛋白质表达量为365 mg/L，酶活为102 U/L，远高于A. utahensis NRRL 12052约14 U/L的活性水平。

实验表明，当ZNW-S11发酵结束，离心去菌体后，底物可以直接投入发酵上清液中，当底物投料浓度为12 g/L时，ZNW-S11在24 h时内可对其进行100%的转化，这明显优于国内当前的工艺水平(投料时1~2g/L，反应24h，转化率接近100%)。EchDA在A. utahensis NRRL 12052中为胞内表达，工业上只能收集利用该菌的菌体在缓冲系统中进行静息细胞转化，而本研究使EchDA在基因工程菌ZNW-S11中分泌表达，发酵液离心后的发酵上清液可直接用于生产，相对于A. utahensis NRRL 12052的静息细胞转化工艺，明显减化了生产过程。

图 4 ZNW-S11在不同IPTG诱导剂量下EchDA的酶活表达Fig. 4 EchDA activity of ZNW-S11 induced by different IPTG concentration

图选项

在上述工作的基础上，为了进一步增强基因工程菌对EchDA的表达能力，同时降低EchDA过量表达对IPTG诱导剂的需求，达到降低生产成本提高生产可行性的目的，本研究尝试采用组成型表达启动子加诱导型启动子杂合启动的策略来控制基因工程菌中EchDA的表达。红霉素启动子PermE^*和PSau3A启动子是两种可在S. lividans中进行较强表达的组成型启动子^{[16, 21]}。在质粒pNW-S11中的IPTG诱导型启动子Plac和echda之间分别引入这两种启动子，获得了重组质粒pNW-S12与pNW-S13，导入S. lividans TK24后，分别获得基因工程菌ZNW-S12 和ZNW-S13。由于组成型启动子的引入，这两株菌在不加入诱导剂的情况下就可以表达EchDA，有明显的EchDA活性(图 5)，且ZNW-S13的表达量高于ZNW-S12，即PSau3A启动子的效率高于PermE^*启动子，其中ZNW-S13在不加诱导剂的情况下，发酵上清液中的酶活可达到48 U/L，而在不加诱导剂的情况下，ZNW-S11似有EchDA的本底表达，但活性测定的结果表明，这种情况下EchDA的活性十分微弱，处于检测误差范围之内。

图 5 基因工程菌蛋白质表达电泳图Fig. 5 SDS-PAGE of genetic engineering strainsM: Maker; 1: ZNW-S12; 2: ZNW-S13; 3: ZNW-S11 without IPTG

图选项

为了验证这种诱导型加组成型杂合启动子是否有助于提高EchDA的表达量，并减少对IPTG诱导剂的需求，以ZNW-S13为研究对象，分析了不同诱导剂剂量对EchDA表达的影响，结果如图 6所示，工程菌株ZNW-S13在诱导剂的浓度为0~0.5 mmol/L时，发酵上清液中EchDA的酶活先增加后减少，当诱导剂浓度为0.1 mmol/L时，酶活达到最高，因此，诱导剂的最佳浓度为0.1 mmol/L。在该诱导条件下，发酵上清液中蛋白质表达量达到473 mg/L，酶活可达到124.9 U/L左右；转化实验表明，此时发酵上清液可投加15 g/L的底物FR901379，在24 h内，底物的摩尔转化率达到100%。上述实验结果显示，菌株ZNW-S13与ZNW-S11相比(图 4)，组成型启动子的加入改变了诱导型启动子P_lac与诱导剂的作用关系，诱导剂的剂量与目标蛋白表达量的关系有明显的不同。诱导型加组成型杂合启动子的策略一方面显著降低了对诱导剂的需求剂量(从0.5 mmol/L下降到0.1 mmol/L)，另一方面也明显增加了EchDA的表达量(由102 U/L提高到了124.9 U/L)。

图 6 ZNW-S13在不同诱导剂量下EchDA的酶活表达Fig. 6 EchDA activity of ZNW-S13 induced by different IPTG concentration

图选项

本研究在S. lividans TK24中对EchDA进行了异源分泌型表达，对棘白霉素的脱酰化采用基因工程菌的发酵上清液，这不同于当前国内工业生产中普遍采用的A. utahensis NRRL 12052的静息细胞转化工艺，因此需要对发酵上清液反应体系的反应条件进行分析优化。鉴于反应温度和反应pH是两个最重要的条件，本研究主要对这两个参数进行了分析确定。

用磷酸和氢氧化钠调节反应体系的pH，测定ZNW-S13发酵上清液中FR901379脱酰化反应的最适反应pH，结果如图 7(a)所示，在底物投料浓度为10 g/L、pH为5.5时，24 h内底物的摩尔转化率最高达到100%，但当pH低于或高于5.5时，底物的转化率显著下降，这表明最适的反应pH为5.5。

图 7 EchDA的最适作用温度及最适作用pHFig. 7 Optimal reaction temperatureand pH of EchDA(a) pH course of the biotransformation reaction at 30℃ with 10 g/L FR901379 (b) Temperature course of the biotransformation reaction at pH 5.5 with 15 g/L FR901379

图选项

分别在20℃、30℃、37℃条件下分析FR901379的脱酰化反应，每隔2h取样检测产物，产物生成量随时间的变化曲线如图 7(b)所示，底物投料浓度为15 g/L时，在反应初期，温度越高，反应速率越快。但在37℃条件下，在8 h左右产物浓度达到高峰，随后产物在反应体系中的浓度会快速下降，从液相色谱可发现在产物浓度快速下降的同时，出现一个快速增长的副产物峰，这表明生成的产物不稳定，转化为另一种物质，这与棘白霉素类物质结构不稳定、在较高温度下易分解的性质相符。因此，37℃左右的温度虽然有利于底物的快速转化，但不利于反应产物的积累，所以应采用较低的温度条件。20℃和30℃条件下的反应表明，20℃条件下的反应速率明显低于30℃条件下的反应速率，30℃条件下15 g/L的底物可在24 h内100%转化，而20℃对底物的最高转化能力仅为30℃的50%左右，显然较低温度条件下不利于反应的进行，所以确定30℃是一个较适合的反应温度条件，这与A. utahensis NRRL 12052静息细胞转化工艺的温度条件相一致，原因主要是受限于棘白霉素类物质的不稳定性。此外，图 7(b)也表明，随着时间的延长，无论是在20℃条件下还是在30℃条件下，产物浓度均会出现下降的现象，但相对于37℃条件下，这种产物不稳定的现象较为轻微。高效液相分析表明，在30℃条件下，在反应24 h之内，产物较为稳定，无明显副产物生成，这表明30℃可作为工业生产中的反应条件，但同时也提示在工业生产中，可适当降低投料浓度，尽量控制在24 h之内完成反应，并尽快提取产物。 2.7 ZNW-S13的发酵中试研究

为了推动基因工程菌ZNW-S13的工业应用开发，在300 L发酵罐上对其进行了发酵中试放大。菌株ZNW-S13经过二级种子培养后，依次从摇瓶发酵、30 L发酵罐、300 L发酵罐逐级放大培养，经多次发酵罐控制参数的优化，在300 L发酵罐上实现了ZNW-S13的稳定放大，控制参数如下：发酵温度28℃，转速160 r/min，通气量1 m³/h，发酵时间40 h。每隔6h取样进行蛋白质电泳分析及酶活检测，EchDA大亚基的蛋白质表达量如图 8所示，发酵20 h后该蛋白质开始有明显积累，40 h后基本无变化。

酶活及发酵参数随发酵时间的变化曲线如图 9所示，溶氧量在发酵6 h时急剧降低，pH则呈现先降再升的趋势，发酵完成时最高达到8.0，最高酶活可达到80 U/L，与摇瓶的最高酶活125 U/L左右还有较大差距，因此还需继续优化发酵条件。

图 8 300 L发酵罐中ZNW-S13表达EchDA的蛋白质电泳分析Fig. 8 SDA-PAGE of the EchDA expressed by ZNW-S13 in 300 L bioreactor

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图 9 300 L发酵罐中ZNW-S13表达EchDA的发酵参数及酶活的时间变化曲线Fig. 9 Time course of the fermentation parameters of ZNW-S13 and the activity of EchDA in 300 L bioreactor

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EchDA催化棘白霉素脱酰化是阿尼芬净和米卡芬净等棘白霉素类药物生产的一个关键环节，EchDA来源于高GC含量的A. utahensis，很难在大肠杆菌、酵母等常规表达系统中高活性表达，本研究将同为高GC含量的放线菌S. lividans TK24作为表达宿主平台，构建了高效分泌表达EchDA的基因工程菌ZNW-S11，直接利用发酵上清液催化棘白霉素脱酰化反应，有助于改变目前国内工业普遍应用的A. utahensis静息细胞转化工艺，减化了生产过程，提高了生产效率。

为了进一步增强基因工程菌对EchDA的表达能力，同时降低EchDA过量表达对IPTG诱导剂的需求，本研究采用组成型表达启动子加诱导型启动子杂合启动的策略来调控基因工程菌中EchDA的表达。在上述pNW-S11质粒中的诱导型启动子P_lac和echda之间分别引入组成型表达启动子P_ermE^*和P_Sau3A，构建了基因工程菌ZNW-S12和ZNW-S13。其中带有P_Lac-P_Sau3A启动子的基因工程菌株ZNW-S13改变了诱导型启动子P_lac与诱导剂的作用关系，在0.1 mmol/L低浓度IPTG诱导剂条件下，发酵上清液中目的蛋白质表达量为473 mg/L，酶活可达到124.9 U/L左右，实现了15 g/L的FR901379底物100%转化，远高于当前国内的工业化水平，有助于改良当前棘白霉素类抗生素的生产工艺，达到了降低生产成本、提高生产可行性的目的。