酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是一种低等单细胞真核生物，具有安全、生长繁殖快、培养简单、遗传操作便捷等特点，广泛应用于酿造、食品、医药等领域，一直是基础和应用研究的重要对象。酿酒酵母系统是最早发展起来用于表达异源蛋白的真核表达系统，第一个商品化的重组疫苗—乙肝疫苗即来自酿酒酵母，随后陆续有很多外源基因在该系统中成功表达^{[1, 2]}。

影响外源基因在宿主内表达有多方面因素，包括启动子效率、宿主遗传特性、外源基因拷贝数及稳定性、培养条件等。近年来，利用基因工程方法和诱变育种来提高酿酒酵母表达蛋白能力、代谢产物等的研究进展较快。Miura S等人利用亚硝基胍诱变1 株 L-乳酸产生菌，突变株的乳酸产量超过90 g/L，达原始菌株产量的2倍^[3]。张丽杰等以酿酒酵母 HY01 为出发菌，选用2 种低毒性化学诱变剂5-BU 和盐酸平阳霉素，在确定最佳配比的基础上，通过联用这2 种诱变剂进行复合诱变，获得了一定数量的正突变株，其中产能提高最高的1株发酵物中海藻糖含量达到16%，比出发菌株提高了10%^[4]。

启动子(promoter)位于结构基因5'端上游区，是RNA聚合酶的结合区。启动子区的结构影响其与RNA聚合酶的亲和力，进而影响基因的转录表达效率。通过对启动子改造，筛选强启动子，是提高宿主重组蛋白表达水平的一种重要的方法^[5]。Partow S等都通过筛选、构建强启动子实现了重组蛋白的高效表达^{[6, 7]}。

pHR酿酒酵母表达系统是本实验室前期研究中基于酵母2μ质粒构建的一种新型酿酒酵母表达系统^{[8, 9]}。与传统的以抗生素抗性基因作为筛选标记的酵母表达载体不同，除需表达的外源基因外，pHR表达载体所有元件序列均来自酿酒酵母自身，不携带抗药基因序列和任何大肠杆菌基因序列，以酿酒酵母Leu2基因作为营养筛选标记。外源基因表达质粒只能在酵母细胞内生存。外源基因通过同源重组方式克隆于表达载体上，通用性好、效率高。该系统以酿酒酵母Y16为宿主，表达载体为 pHR-P_TEF-A，其启动子元件P_TEF为酿酒酵母翻译延伸因子EF-1a基因的启动子。本研究通过诱变剂处理和易错PCR技术分别对宿主Y16和启动子P_TEF进行突变改造，构建pHR-N酿酒酵母表达系统，提高其生产重组蛋白的能力。 1 材料与方法 1.1 菌株和质粒

大肠杆菌E.coli DH5α；酵母菌：S.cerevisiae S1502B (MATa ura3-52 leu2-3,112 trp1-289 his3-Δ)，简称Y16。大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒YEP353(ATCC number 37725)。酿酒酵母表达载体pHR-P_TEF-A由本实验室构建。 1.2 主要试剂与仪器

KOD Plus Neo高保真DNA聚合酶，限制性内切酶、T4 DNA连接酶购于TaKaRa。质粒提取试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒购于Axygen。甲基磺酸乙酯(Ethylmethyl sulfone,EMS)、X-Gal 和ONPG(o-Nitrophenyl-β-D-Galactopyranoside)购于Sigma。易错PCR试剂盒购于北京天恩泽生物技术公司。PCR扩增仪(Applied Biosystems)；流式细胞仪(BD)；分光光度仪(尤尼柯UV-2000)。 1.3 方 法 1.3.1 引物设计

所用引物由上海桑尼生物科技有限公司合成(表 1)。

PCR获得的P_TEF序列经酶切后克隆于YEP353载体。突变改造的P_TEF、人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)基因或绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因分别经酶切后克隆于酿酒酵母表达载体pHR-P_TEF-A。大肠杆菌转化采用42℃ 热激方法，酿酒酵母转化采用LiAC化学法^[10]。分子生物学操作方法参考《分子克隆实验指南》(1996年第二版)和《酵母遗传学方法实验指南》(2000年第一版)。 1.3.3 易错PCR突变^{[11, 12]}

按照易错PCR试剂盒说明书进行操作，反应总体系为60μl，PCR程序设定如下：

挑取少许YEPD固体培养基上的酿酒酵母Y16，接入新鲜YEPD液体培养中，30℃培养后，离心，无菌水洗涤2次，1ml PBS悬浮，加入40 μl EMS溶液，30℃温浴处理一定时间；离心收获菌体，5% 硫代硫酸钠溶液 1ml 洗涤2次，得到的酵母菌体用于转化筛选。 1.3.5 突变筛选方法1.3.5 .1 初筛

(1)启动子突变初筛^[15]

YEP353载体携带LacZ报告基因，通过检测LacZ基因产物β-半乳糖苷酶(β-galactosidase，β-gal)的活性，能够反映LacZ前多克隆位点克隆的启动子的转录效率。经易错PCR突变后的启动子P_TEF连接到质粒YEP353上，构建YEP353- P_TEF-mutant质粒，连接产物转化Y16，涂布于选择性SD固体培养基上，30℃培养2~3天获得酵母转化子。随后转化子转接于含有X-Gal的固体培养基上，30℃继续培养，根据菌落蓝斑出现时间和颜色深浅(与对照酵母比较)筛选候选阳性克隆。

(2)诱变酵母菌株初筛

质粒YEP353-P_TEF转化经EMS诱变处理的Y16菌体，涂布于选择性SD固体培养基上，30℃培养2~3天后获得转化子克隆，候选阳性克隆筛选方法同上所述。

(3)复筛^{[16, 17]}

对于初筛获得的候选阳性克隆进行复筛，确认其可靠性。采用的方法为ONPG法。重组酵母中表达的β-gal能够将ONPG解为半乳糖和黄色的邻-硝基苯酚(ONP)。将酵母克隆接入选择性SD液体培养基中30℃摇床培养24 h；按10%(V/V)接入1ml YEPD培养基中，培养48h，测OD₆₀₀值；取100 μl菌液离心去上清，用1ml Z-Buffer洗一次；再用800μl Z-Buffer悬浮，置于－80℃，反复冻融3~4次；加入200μl ONPG反应一段时间，加入400μl 1mol/L NaCO₃ 终止反应；离心，取上清分光光度计测OD420。β-gal酶活性= (OD₄₂₀×1000)/(OD₆₀₀×V(ml)×T(min)) 2 结果 2.1 宿主酿酒酵母Y16诱变改造

选择YEPD中培养10h后的Y16酵母细胞，利用EMS进行诱变处理，测定EMS处理不同时间菌株的死亡率(结果略)。EMS最佳诱变条件为：PBS(pH=7.2)溶液中，EMS浓度40μl/ml，处理55min，Y16菌株死亡率为70%~80%。收集EMS诱变处理后存活的Y16酵母，继续培养待用。

质粒YEP353-P_TEF转化诱变处理后的Y16酵母，获得的转化子分别测定β-gal酶活性，经过筛选鉴定，编号E14和E19的两个转化子β-gal酶活较未处理的Y16转化子(对照)酶活分别提高22.31%和26.53%(表 2)。

将E14和E19在非选择性YEPD培养基中连续传代培养，丢失酵母细胞中YEP353-P_TEF质粒，经表型验证正确后，获得诱变菌株Y16-E14和Y16-E19。为确认菌株发生有利突变，将质粒YEP353-P_TEF分别回转Y16-E14和Y16-E19，检测细胞β-gal酶活性。结果如表 3所示，Y16-E14和Y16-E19菌株产生β-gal酶活性分别比未改造的Y16菌株高73.53%和55.60%，由此获得了两株有利于重组β-gal酶表达的诱变酵母菌株Y16-E14和Y16-E19。

以启动子P_TEF序列为模板，以P_TEF-F1/P_TEF-R1为引物进行易错PCR，PCR产物经BamHⅠ/HindⅢ酶切后，克隆于YEP353 载体，重组载体转化酵母Y16。经过初筛和复筛鉴定，发现编号E49-24、N36、N37三个转化子的β-gal酶活性较对照组分别提高了47.09%、46.55%、55.43%。三个转化子中YEP353-P_TEF-mutant质粒抽提出来测序，发现三个质粒P_TEF启动子区均在234位发生突变，即由T变为C(T234C)，将突变启动子命名为P_TEFv1。

为确认突变启动子P_TEFv1的有效性和稳定性，将质粒YEP353-P_TEFv1回转酵母Y16，检测重组酵母β-gal酶活，结果如表 4所示，装配突变启动子P_TEFv1的重组酵母产生的β-gal酶活较对照重组酵母(启动子P_TEF)提高61.47%，说明突变启动子P_TEFv1转录效率明显强于野生型启动子P_TEF。

经过突变改造，我们获得了较P_TEF启动子效率更高的P_TEFv1启动子和有利于重组蛋白表达的诱变改造菌株Y16-E14、Y16-E19。随后将P_TEFv1启动子和Y16-E14菌株应用于改造pHR酿酒酵母表达系统。将P_TEFV1启动子替换酿酒酵母表达载体pHR-P_TEF-A上的P_TEF启动子，以Y16-E14作为宿主细胞，构建胞内表达GFP或分泌表达HSA的重组酵母，评价新构建的pHR-N表达系统的效能(表 5)。

对照组分别为Y16/pHR-P_TEF(YC)和Y16-E14/ pHR-P_TEF(EC). αF，α-Factor信号肽分别利用荧光显微镜和流式细胞仪检测重组酵母表达GFP情况。荧光显微镜观察显示E2组酵母(Y16-E14/pHR-P_TEFv1-GFP)荧光不仅强于E1组(Y16-E14/ pHR-P_TEF-GFP)也明显强于Y1组(Y16/pHR-P_TEF-GFP)或Y2组(Y16/pHR-P_TEFv1-GFP)，说明突变启动子P_TEFv1和诱变改造后的宿主Y16-E14能够增强GFP蛋白表达(图 1)。流式细胞仪对重组酵母荧光强度进行定量检测分析，结果显示E2组酵母荧光强度显著高于其他各组(图 2)，证实突变启动子P_TEFv1和宿主Y16-E14对重组GFP产生的促进作用。

图 1 荧光显微镜检测重组酵母表达GFP情况 Fig. 1 Fluorescence microscope analysis of the recombinant yeasts expressing GFP

图选项

图 2 流式细胞仪检测重组酵母平均荧光强度Fig. 2 Flow cytometry analysis of geometric mean fluorescence intensity of the recombinant yeastsCell number of each test sample is 5×104.*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001

图选项

HSA组重组酵母培养2天后，取培养液上清进行SDS-PAGE分析，结果显示E4组的分泌的HSA量明显多于其他各组(图 3)，说明E4组重组酵母(Y16-E14/pHR-P_TEFv1-αF-HSA)分泌表达HSA能力最强，即改造的Y16-E14宿主和P_TEFV1启动子有助于重组蛋白HSA的分泌表达。

图 3 SDS-PAGE鉴定各重组酵母分泌表达HSA情况Fig. 3 SDS-PAGE analysis of HSA secreted by the recombinant yeasts1：Marker；2： Corotrol YC；3： Corotrol EC；4：Y3；5：Y4；6：E3；7：E4

图选项

YEP353是一种大肠杆菌-酿酒酵母穿梭载体，将启动子克隆于该载体LacZ基因上游的多克隆位点区域，构建的重组载体转化酿酒酵母，通过重组酵母中LacZ基因表达产生的β-半乳糖苷酶(β-gal)活性测定可鉴别YEP353所克隆的启动子在酵母中的效率。本研究中，为了获得较已有的酿酒酵母强启动子P_TEF效率更高的启动子，以P_TEF序列为模板，易错PCR产生突变P_TEF序列。突变启动子克隆于YEP353载体后转化酿酒酵母Y16菌株，获得重组酵母转化子文库。经过含X-Gal培养基平板初筛以及ONPG法复筛鉴定，N36等三个转化子产生的β-gal明显高于启动子未改造的对照酵母。测序后分析发现三个转化子重组YEP353质粒上克隆的突变P_TEF序列完全一致,均仅有一个碱基突变(T234C)。筛选获得的三个突变启动子来自不同批次的易错PCR产物。实验中，虽然为了获得尽可能多的突变启动子，进行了多管多次易错PCR，但每一次PCR的退火温度、延伸时间等程序完全一致，在相同条件下，可能存在偏好突变位点的情况。T234C位点突变显著提高P_TEF启动子的转录效率可能与该位点突变后影响启动子区结构，促进RNA聚合酶与启动子区结合有关，其具体机制有待实验确认。本研究证实通过易错PCR优化酵母启动子是一种行之有效的方法。

宿主也是表达系统需要考虑的重要因素，宿主细胞内生化环境(RNA转录和翻译速率、蛋白质折叠速率、稳定性等)对重组蛋白的产生具有重要影响^{[2, 18]}。诱变、代谢工程等可以通过各种途径改变宿主细胞内环境，进而改善宿主生产重组蛋白的能力。国内外不少研究报道证实了化学诱变剂EMS改造宿主的有效性。为了提高酿酒酵母Y16生产重组蛋白(特别是分泌重组蛋白)的能力，我们采用EMS对Y16进行诱变处理。通过EMS对Y16酵母的处理，筛选获得了表达β-gal能力提高的二株突变酵母Y16-E14、Y16-E19。研究中发现与未诱变的Y16比较，Y16-E14酵母形态发生了明显变化，即Y16-E14酵母细胞个体更大。诱变改造的菌株生理特性是否发生变化、通过何种途径提高重组蛋白表达水平需要后续进一步研究探究。

将原有的pHR酿酒酵母表达载体启动子P_TEF替换为突变启动子P_TEFv1 、宿主酵母Y16替换为Y16-E14，获得预期性能有所改进的pHR-N酵母表达系统。为了解pHR-N酵母表达系统的普适性，我们分别以GFP、HSA为报告基因验证pHR-N系统胞内表达或分泌表达重组蛋白的能力。研究结果显示，相对启动子或宿主单一因素优化，P_TEFv1和Y16-E14协同应用大大提高了重组蛋白胞内表达或分泌表达水平。

通过启动子和宿主两方面的改造，优化后的pHR-N表达系统表达外源基因的能力进一步提升，为拓展新型pHR酿酒酵母表达系统在生物医药领域的应用奠定了良好的基础。