中国生物工程杂志  2015, Vol. 35 Issue (1): 15-20

文章信息

易守会, 王东林, 吴志鹃, 杨文影, 赵启成, 陈晓品
YI Shou-hui, WANG Dong-lin, WU Zhi-juan, YANG Wen-ying, ZHAO Qi-cheng, CHEN Xiao-pin
MUC1对人结肠癌细胞HCT116生物学行为的影响
Effect of MUC1 on Biological Behaviour of Human Colorectal Cancer Cell HCT116
中国生物工程杂志, 2015, 35(1): 15-20
China Biotechnology, 2015, 35(1): 15-20
http://dx.doi.org/10.13523/j.cb.20150102

文章历史

收稿日期：2014-10-24
修回日期：2014-11-27
 Abstract              PDF               Figures               Tables
引用本文 0
易守会, 王东林, 吴志鹃, 杨文影, 赵启成, 陈晓品. MUC1对人结肠癌细胞HCT116生物学行为的影响[J]. 中国生物工程杂志, 2015, 35(1): 15-20.
YI Shou-hui, WANG Dong-lin, WU Zhi-juan, YANG Wen-ying, ZHAO Qi-cheng, CHEN Xiao-pin. Effect of MUC1 on Biological Behaviour of Human Colorectal Cancer Cell HCT116[J]. China Biotechnology, 2015, 35(1): 15-20.
MUC1对人结肠癌细胞HCT116生物学行为的影响
易守会1, 王东林2, 吴志鹃2, 杨文影1, 赵启成2, 陈晓品1     
1. 重庆医科大学附属第一医院 重庆 400010;
2. 重庆市肿瘤医院 重庆 400011
收稿日期:2014-10-24; 修订日期：2014-11-27;
基金项目：国家自然科学基金(81172262),重庆市科委项目(2011BB5120)资助项目.
通讯作者, 电子信箱: cxp640910@163.com
摘要：目的: 观察MUC1对人结肠癌细胞HCT116增殖、侵袭及化疗敏感性的影响。方法:采用MUC1表达阴性的结肠癌细胞株HCT116,通过慢病毒转染、嘌呤霉素筛选、半定量RT-PCR和Western blot鉴定构建稳定表达MUC1的HCT116细胞株;实验分空病毒组和MUC1病毒组;CCK实验和软琼脂克隆形成实验检测两组细胞的增殖能力,Transwell侵袭实验检测两组细胞的侵袭能力;MTT法和流式细胞仪检测两组细胞对奥沙利铂的敏感性,酶底物法检测Caspase-3活性。结果: 获得稳定表达MUC1的HCT116细胞株;两组细胞贴壁生长无差异;与空病毒组相比,MUC1病毒组细胞软克隆形成数增加,穿过小室的细胞数增加(P<0.05);MUC1病毒组细胞对奥沙利铂的敏感性降低,MUC1病毒组Caspase-3活性水平低于空病毒组(P<0.05)。结论: MUC1与结肠癌的非锚定依赖生长、侵袭和化疗敏感性有关。
关键词： MUC1     结肠癌     增殖     侵袭     化疗敏感性    
Effect of MUC1 on Biological Behaviour of Human Colorectal Cancer Cell HCT116
YI Shou-hui1, WANG Dong-lin2, WU Zhi-juan2, YANG Wen-ying1, ZHAO Qi-cheng2, CHEN Xiao-pin1     
1. Department of Oncology, The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400010, China;
2. Department of Oncology, Chongqing Cancer Hospital, Chongqing 400011, China
Abstract:Objective: To investigate the effect of MUC1 on proliferation, invasion and chemosensitivity of human colorectal cancer cell line HCT116. Methods: The HCT116 human colon cancer cells were transfected with lentiviral vectors with and without MUC1, then selected by puromycin. The expression of MUC1 was detected by SqRT-PCR and Western blot. There were two groups in our experiment: MUC1 lentivirus group and control lentivirus group. CCK method and soft agar colony formation method were used to detect cells proliferation, Transwell membrane assay to detect cells invasion, MTT method and flow cytometry to detect cells sensitivity to oxaliplatin and the colorimetric method to detect Caspase-3 activity. Results: HCT116 cell line with stable expression of the MUC1 was acquired. Compared with control lentivirus group, the number of soft agar colonies in MUC1 lentivirus group was increased significantly (P<0.05), the number of invasive cells was increased significantly (P<0.05). Chemosensitivity was decreased in the MUC1 lentivirus group(P<0.05). Caspase-3 activity was significantly low in the MUC1 lentivirus group(P<0.05). Conclusion: MUC1 is related to the anchorage-independent growth, invasion and chemotherapy of colorectal cancer.
Key words: MUC1     Colorectal cancer     Proliferation     Invasion     Chemotherapy sensitivity    

结直肠癌(colorectal carcinoma，CRC)发病率在肿瘤中居第三位，且其发病率逐年升高。在结直肠癌发病早期，90%的患者可通过手术治疗痊愈，但大部分患者在确诊时已是中晚期，虽经手术和放化疗等综合治疗，结果仍预后差并且产生肿瘤耐药[1,2]。

MUC1是一个大分子跨膜糖蛋白，由细胞膜外部分、跨膜部分和膜内部分组成，最先由Shimizu[3]于1982年从人的乳汁中分离得到，编码基因位于lq21。MUC1正常表达于导管上皮细胞管腔面，在上皮来源的肿瘤组织中高表达，异常糖基化，失去极性，分布于整个细胞表面。MUC1的胞外段可作为受体与其配体结合，或作为配体与其受体相互作用，胞内段与多条信号通路相互联系，在肿瘤的增殖、侵袭转移和化疗耐药中起重要作用[4,5]。

MUC1作为一个癌蛋白在乳腺癌的研究中较为深入。为了研究MUC1在结肠癌中的作用，本实验以MUC1表达阴性的人结肠癌细胞株HCT116为主要研究对象，通过慢病毒转染获得稳定表达MUC1的HCT116细胞株，观察MUC1对细胞增殖、侵袭和化疗敏感性的影响。 1 材料与方法 1.1 材料及试剂

人结肠癌细胞株HCT116由本实验室保存。MUC1慢病毒表达载体由上海吉凯基因技术有限公司构建。RPMI1640、DMEM高糖培养基、胎牛血清(美国Hyclone公司)；细胞总蛋白质提取试剂盒(上海贝博公司)、MUC1鼠单克隆抗体(美国Santa Cruz公司)、β-actin鼠单克隆抗体、山羊抗鼠IgG抗体-HRP标记(北京中杉金桥公司)；Trizol试剂、PCR kit试剂盒(日本TaKaRa公司)；Matrigel基质胶(美国BD公司)；MTT、DMSO、Annexin V-PE/7-AAD试剂盒(美国Sigma公司)；CCK试剂盒、Caspase-3活性检测试剂盒(碧云天)。SDS-PAGE蛋白质电泳仪、蛋白质转膜仪(美国Bio-Rad公司)；PCR仪(美国Applied Biosysems公司)；凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)。引物采用软件Primer 5.0设计，由上海生工技术有限公司合成。 1.2 方 法 1.2.1 细胞培养

人结肠癌细胞HCT116在含10%胎牛血清和双抗(100U/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素)的RPMI1640 (1640,Hyclone)培养基中于37℃和5% CO2的孵育箱中培养。 1.2.2 细胞转染

在6孔板里接种2×104个细胞，培养24h后，取MOI值为40将含有MUC1表达片段的慢病毒(LV-MUC1)和空白对照慢病毒(Vector)分别感染HCT116细胞，病毒感染的同时加入5μg/ml的聚凝胺(polybrene)以增加感染效率，感染第二天去除含病毒的培养基更换为完全培养基，48h后加入2μg/ml的嘌呤霉素筛选，以后以1μg/ml的嘌呤霉素维持培养。实验分为MUC1病毒组和空病毒组。 1.2.3 半定量RT-PCR

收集对数生长期的细胞，采用Trizol法提取细胞总RNA，通过半定量RT-PCR分析MUC1 mRNA表达。MUC1上游引物为5′-GCACCGACTACTACCA AGAG-3′，下游引物为5′-AAGGAAATGGC ATCACT-3′，退火温度55℃，扩增片段大小258bp；B-actin上游引物5′-TGACGTGGAC ATCCGCAAAG-3′，下游引物5′-CTGGAAG GTGGACAGCGAGG-3′，退火温度60℃，扩增片段大小205bp。 1.2.4 Western blot实验

提取细胞总蛋白质并定量，调整蛋白质上样量至相同水平进行SDS-PAGE电泳，电泳完毕后，200mA转膜2h之后加5%脱脂奶粉37℃封闭1h；加1∶200稀释的MUC1抗体、1∶1500稀释的β-actin抗体，4℃过夜；TBST洗涤，加1∶2500稀释的二抗，37℃孵育1h，TBST洗涤后ECL发光。 1.2.5 CCK法检测细胞增殖

分别消化MUC1病毒组细胞和空病毒组细胞，按4000个/孔接种于96孔板培养，设置5个时间点(6h、24h、48h、72h和96h)，每个时间点设置5个孔，37℃、5% CO2孵箱中培养至各时间点，CCK法检测450nm吸光度值，实验共重复3次。 1.2.6 软琼脂克隆形成实验

用蒸馏水制备1.2%和0.7%的低溶点琼脂糖液，高压灭菌后，40℃水浴保温。1.2%的琼脂糖与2×DMEM(含有2×抗生素和20%的胎牛血清)按1∶1混匀后，2.5ml/孔加入6孔板，室温下冷却(30min)至凝固，作底层琼脂。分别消化MUC1病毒组细胞和空病毒组细胞，并计数细胞50×104ml－1。底层琼脂冷却后，按1∶1加入0.7%的琼脂糖与2×DMEM培养液，并加入20μl细胞悬液混匀后，1.0ml/孔注入铺有底层琼脂的6孔板，每孔含1×104个细胞。待上层琼脂凝固后，放入37℃、5% CO2孵箱中培养2周后，置于倒置显微镜下观察细胞克隆形成情况，随机选择3个视野进行克隆计数(含有30个细胞以上的集落计为1个克隆)，取其平均值作为克隆的形成数。 1.2.7 Transwell侵袭实验

取50mg/L的matrigel，按1∶8稀释，各室加入100μl，放入37℃培养箱中，凝固后取出，用1640洗两遍。分别消化MUC1病毒组和空病毒组细胞，用1640洗2遍，用1640重悬并计数为50×104/ml，先向每个Transwell小室下室加入600μl含10%胎牛血清的1640培养液,再向每个小室上室加入200μl细胞悬液(1×105 cells)，将板置于37℃、5% CO2孵箱中培养48h,用无菌棉签擦除上室内细胞,用PBS洗两遍，4%多聚甲醛固定30min，0.1%结晶紫染色，于倒置显微镜下选取3个不同视野计数穿过膜的细胞数，并采集图像。 1.2.8 MTT法测奥沙利铂24h IC50

分别消化MUC1病毒组和空病毒组细胞，并计数细胞，按4 000个/孔接种于96孔板培养，待细胞长至70%密度时，加入0μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml和64μg/ml奥沙利铂培养24h，MTT法检测490nm吸光度值。每一浓度设置5个复空，实验重复3次。 1.2.9 流式细胞仪检测细胞凋亡

分别消化MUC1病毒组和空病毒组细胞，并计数细胞，按10×104个/孔接种于6孔板，待细胞长至70%密度时，加奥沙利铂(5μg/ml)培养36h后，按Annexin V-PE/7-AAD试剂盒操作手册进行。重悬细胞于50μl Binding Buffer和5μl 7-AAD混合液中,室温、避光、反应10min，加入450μl Binding Buffer和1μl Annexin V-PE，室温、避光、反应10min，流式细胞仪分析。 1.2.10 Caspase-3活性检测

分别消化MUC1病毒组和空病毒组细胞，并计数细胞，按10×104个/孔接种于6孔板，待细胞长至70%密度时，加奥沙利铂(5μg/ml)培养36h后收集细胞。加100μl裂解液，冰浴15min，4℃16 000转离心15min，收集上清液，按照Caspase-3活性检测试剂盒说明书所示具体步骤操作，用酶标仪检测405nm吸光度值。 1.2.11 统计学处理

使用prism 5.0统计软件对结果进行统计分析，数据用Mean±SEM表示，采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。 2 结 果 2.1 细胞转染

慢病毒转染HCT116细胞后经嘌呤霉素筛选在荧光显微镜下观察转染率达90%以上(图 1)。半定量RT-PCR结果表明MUC1 mRNA在 MUC1病毒组表达，在空病毒组不表达(图 2)。Western blot结果显示，MUC1蛋白在MUC1病毒组表达，在空病毒组不表达(图 2)。

(a) Control lentivirus group white light (b) Control lentivirus group fluorescence (c) MUC1 lentivirus group white light (d) MUC1 lentivirus group fluorescence 图 1 慢病毒转染HCT116细胞的荧光图片(100×) Fig. 1 Fluorescence microscopc mages of HCT116 cells infected with lentivirus(100×)
图选项
1: Control lentivirus group β-actin; 2: Control lentivirus group MUC1; 3: MUC1 lentivirus group β-actin; 4: MUC1 lentivirus group MUC1; 5: Maker 图 2 慢病毒转染HCT116细胞MUC1 mRNA和MUC1蛋白表达 Fig. 2 Expression of MUC1 mRNA and MUC1 protein in HCT116 cells after transfected with lentivirus
图选项
2.2 CCK法检测细胞增殖和软琼脂克隆形成实验

根据各个时间点所测的OD值(450nm)绘制细胞生长曲线。结果表明，MUC1病毒组与空病毒组的细胞增殖无差异(图 3)；软琼脂克隆形成实验显示，与空病毒组相比，MUC1病毒组软琼脂克隆形成能力明显增强[(26.0±2.31) vs (5.67±1.45) (P<0.05)] (图 4)。以上实验表明，MUC1对细胞的贴壁生长无显著影响，但能增强细胞的非锚定依赖生长能力。

图 3 细胞生长曲线 Fig. 3 Cell growth curve
图选项
(a) Control lentivirus group (b) MUC1 lentivirus group(c) Histogram 图 4 软克隆形成实验(40×) Fig. 4 Soft agar colony formation assay (40 ×)
图选项
2.3 MUC1对HCT116侵袭的影响

通过Transwell实验检测MUC1对HCT116细胞侵袭能力的影响。MUC1病毒组穿过小室纤维素膜的细胞数与空病毒组相比有明显差异[(27.3±4.41) vs (81.0±8.14) (P<0.05)](图 5)。

(a) Control lentivirus group (b) MUC1 lentivirus group(c) Histogram 图 5 Transwell实验(200×) Fig. 5 Transwell migration assay (200 ×)
图选项
2.4 MUC1对化疗敏感性的影响

由MTT实验所得OD值采用prism 5.0统计软件计算IC50，两组细胞奥沙利铂作用24h后人IC50分别为：空病毒组IC50为14.27±0.25，MUC1病毒组IC50为26.03±0.20。奥沙利铂(5μg/ml)处理细胞36h后，流式细胞仪检测两组细胞的凋亡，凋亡率分别为26.6±1.22、18.5±1.44(图 6)。以上结果显示，转染MUC1后细胞对奥沙利铂的敏感性降低(P<0.05)。奥沙利铂(5μg/ml)处理细胞36h后，酶底物反应法检测两组细胞的Caspase-3活性，两组细胞的Caspase-3活性(U)分别为16.56±0.73、7.11±0.49(P<0.05) (图 7)。结果显示，MUC1降低结肠癌细胞对奥沙利铂的敏感性与Caspase-3活性相关。

(a) Control lentivirus group (b) MUC1 lentivirus group(c) Histogram 图 6 流式细胞仪检测细胞调亡 Fig. 6 Flow cytometry apoptosis
图选项
图 7 Caspase-3活性 Fig. 7 Caspase-3activity
图选项
3 讨 论

MUC1作为一个癌蛋白与肿瘤的发生、发展及耐药密切相关。为了研究MUC1对人结肠癌细胞HCT116的影响，我们通过慢病毒转染、嘌呤霉素筛选、半定量RT-PCR和Westernb blot鉴定，获得稳定表达MUC1的HCT116细胞株。

CCK法检测细胞增殖结果显示，空病毒组细胞与MUC1病毒组细胞的增殖无差异；软琼脂克隆形成实验结果显示，MUC1病毒组的克隆形成数大于空病毒组。以上实验表明MUC1对HCT116细胞的贴壁生长没有影响，但能显著增强HCT116细胞的非锚定依赖生长能力。Tamada等[6]使用MUC1基因转染ES-2透明腺癌细胞系得到表达MUC1的ES-2细胞系和不表达MUC1的对照细胞系，经过体外和体内实验发现，MUC1对ES-2细胞的体外生长无影响，但是能促进ES-2细胞的体内生长。Li等[7]的研究发现，大鼠3Y1细胞过表达人MUC1能够诱导细胞发生恶性转化，并增加其软琼脂克隆形成能力。

Transwell的实验结果显示，MUC1病毒组穿过小室纤维素膜的细胞数明显多于空病毒组，表明MUC1能增强结肠癌细胞的侵袭能力。研究发现，MUC1与肿瘤的侵袭转移有关，在患者的转移灶和循环肿瘤细胞中发现高水平MUC1的表达[8]。Hom等[9]的研究发现，小鼠乳腺肿瘤细胞DA3转染MUC1后，细胞间质标志物表达水平升高，上皮标志物表达水平降低，细胞通过基质胶的能力增强。Chen等[10]发现，PI3K/Akt/mTOR途径的激活可通过诱导MMP9的表达，降解细胞外基质，利于肿瘤细胞的侵袭和转移。已往的研究表明，MUC1与PI3K→Akt信号通路有关，MUC1-CY20HPM区酪氨酸(Tyr-20)的磷酸化使MUC1-C和PI3Kp85调节亚基的Src同源区2(SH2)结构域相互作用，阻止PI3Kp85亚单位对P110催化亚基的抑制，激活PI3K→Akt信号通路[11,12]。此外，MMP-9的启动子区含有NF-κB的结合位点[13]，MUC1-C与NF-κB信号通路有关，其可以直接和IKKβ-IKKγ复合体相互作用，诱导IκBα降解，释放RelA进入细胞核，从而激活NF-κB信号通路[14]。但是MUC1促进侵袭转移的具体机制还不是很清楚，需要进一步的研究。

转移性结肠癌最主要的治疗方式是化疗，奥沙利铂是转移性结肠癌一线治疗的主要用药，但随着其在临床的运用，耐药问题逐步凸现出来。研究报道，MUC1的过表达阻止基因毒性抗癌药物诱导的细胞凋亡[15,16]。Deng等[17]用siRNA抑制胃癌细胞MUC1表达，使胃癌细胞对曲妥珠单抗的敏感性增加。研究表明，合并使用MUC1-C的胞内段抑制剂GO-201/203和化疗药物，可以增加化疗药物的敏感性，增加肿瘤细胞的凋亡[18]。本研究发现，转染MUC1后，奥沙利铂作用细胞24h后IC50显著升高(P<0.05)；奥沙利铂(5μg/ml)处理细胞36h后，空病毒组细胞的凋亡率约为MUC1病毒组细胞的1.5倍，提示MUC1可降低结肠癌细胞对奥沙利铂的敏感性。以往的研究发现，MUC1阻止药物诱导的DNA损伤导致的细胞凋亡可能通过以下机制：①MUC1-C定位于线粒体外膜，减弱线粒体细胞色素c的释放[19]，MUC1-C直接与Bax相结合阻断Bax激活线粒体凋亡途径的功能[20]；②在细胞质中黏蛋白与c-Abl相结合，阻止c-Abl入核从而抑制细胞凋亡[16]。本研究发现，MUC1可以显著降低奥沙利铂作用细胞后Caspase-3的活性，提示MUC1降低结肠癌细胞对奥沙利铂的敏感性与Caspase-3活性相关。

本实验通过慢病毒转染获得稳定表达MUC1的人结肠癌细胞株HCT116，发现转染MUC1后，细胞的软琼脂克隆形成能力明显增高、侵袭能力增强、对奥沙利铂的化疗敏感性降低。初步探讨MUC1耐药机制发现这可能与Caspase-3的活性相关。但对于引起Caspase-3活性下降的具体机制需要进一步的研究。总的来说，本研究为结肠癌的治疗提供了一个新思路，有可能通过抑制MUC1促进结肠癌细胞凋亡、抑制结肠癌细胞侵袭、提高结肠癌细胞对奥沙利铂的敏感性，从而抑制结肠癌的发展。

参考文献
[1] Jemal A, Bray F, Center M M, et al. Global cancer statistics. CA Cancer J Clin, 2011, 61(2):69-90.
[2] Siegel R, DeSantis C, Virgo K, et al. Cancer treatment and survivorship statistics, 2012. CA Cancer J Clin, 2012, 62(4):220-241.
[3] Shimizu M, Yamauchi K. Isolation and characterization of mucin-like glycoprotein in human milk fat globule membrane. J Biochem, 1982, 91(2):515-524.
[4] Nath S, Mukherjee P. MUC1: a multifaceted oncoprotein with a key role in cancer progression. Trends Mol Med, 2014, 20(6):332-342.
[5] Kufe D W. MUC1-C oncoprotein as a target in breast cancer: activation of signaling pathways and therapeutic approaches. Oncogene, 2013, 32(9):1073-1081.
[6] Tamada Y, Takeuchi H, Suzuki N, et al. Biological and therapeutic significance of MUC1 with sialoglycans in clear cell adenocarcinoma of the ovary. Cancer Sci, 2007, 98(10):1586-1591.
[7] Li Y Q, Liu D, Chen D S, et al. Human DF3/MUC1 carcinoma-associated protein functions as an oncogene. Oncogene, 2003, 22(38):6107-6110.
[8] Horm T M, Schroeder J A. MUC1 and metastatic cancer expression, function and therapeutic targeting. Cell Adhes Migr, 2013, 7(2):187-198.
[9] Horn G, Gaziel A, Wreschner D H, et al. ERK and PI3K regulate different aspects of the epithelial to mesenchymal transition of mammary tumor cells induced by truncated MUC1. Exp Cell Res, 2009, 315(8):1490-1504.
[10] Chen J S, Wang Q, Fu X H, et al. Involvement of PI3K/PTEN/AKT/mTOR pathway in invasion and metastasis in hepatocellular carcinoma: Association with MMP-9. Hepatol Res, 2009, 39(2):177-186.
[11] Raina D, Kharbanda S, Kufe D. The MUC1 oncoprotein activates the anti-apoptotic phosphoinositide 3-kinase/Akt and Bcl-x(L) pathways in rat 3Y1 fibroblasts. J Biol Chem, 2004, 279(20):20607-20612.
[12] Raina D, Kosugi M, Ahmad R, et al. Dependence on the MUC1-C oncoprotein in non-Small cell lung cancer cells. Mol Cancer Ther, 2011, 10(5):806-816.
[13] Kim Y, Kang H, Jang S W, et al. Celastrol inhibits breast cancer cell invasion via suppression of NF-kappa B-mediated matrix metalloproteinase-9 Expression. Cell Physiol Biochem, 2011, 28(2):175-184.
[14] Ahmad R, Raina D, Trivedi V, et al. MUC1 oncoprotein activates the I kappa B kinase beta complex and constitutive NF-kappa B signalling. Nat Cell Biol, 2007, 9(12):U1419-U1146.
[15] Ren J, Agata N, Chen D S, et al. Human MUC1 carcinoma-associated protein confers resistance to genotoxic anticancer agents. Cancer Cell, 2004, 5(2):163-175.
[16] Raina D, Ahmad R, Kumar S, et al. MUC1 oncoprotein blocks nuclear targeting of c-Abl in the apoptotic response to DNA damage. Embo J, 2006, 25(16):3774-3783.
[17] Deng M, Jing D D, Meng X J. Effect of MUC1 siRNA on drug resistance of gastric cancer cells to trastuzumab. Asian Pac J Cancer Prev, 2013, 14(1):127-131.
[18] Raina D, Uchida Y, Kharbanda A, et al. Targeting the MUC1-C oncoprotein downregulates HER2 activation and abrogates trastuzumab resistance in breast cancer cells. Oncogene, 2014, 33(26):3422-3431.
[19] Ren J, Raina D, Chen W, et al. MUC1 oncoprotein functions in activation of fibroblast growth factor receptor signaling. Mol Cancer Res, 2006, 4(11):873-883.
[20] Ahmad R, Alam M, Rajabi H, et al. The MUC1-C oncoprotein binds to the BH3 domain of the pro-apoptotic BAX protein and blocks BAX function. J Biol Chem, 2012, 287(25):20866-20875.