青藏高原，被誉为“地球第三极”和“世界屋脊”，是世界上最高的的独特自然地理单元，是我国重要的生态安全屏障^[1]。海北藏族自治州（海北州）位于青藏高原东北部地区，具有典型的高原大陆性气候，光照充足、干湿季分明，拥有丰富的草地资源，适于喜马拉雅旱獭（Marmota himalayana）等小型兽类生存^[2]。小型兽类与人类生活关系密切，有近90%的种类可携带200多种病原体，通过直接接触或吸血节肢动物叮咬传播，引起包括巴尔通体病、鼠疫和钩端螺旋体病等在内的多种人兽共患病，严重威胁人类健康^[3-4]。其中，高原鼠兔（Ochotona curzoniae）隶属于兔形目鼠兔科鼠兔属，广泛分布于高寒地带，是青藏高原地区常见的植食性小型兽类，对维持高寒草地生态系统的稳定性有着重要的作用^[5]。

海北州以往关于高原鼠兔等小型兽类致病微生物的调查研究主要集中于鼠疫耶尔森菌（Yersinia pestis）^[6]，但对《全国病媒生物病原学监测方案（试行）》（中疾控传发〔2020〕13号）中规定的土拉弗朗西斯菌（Francisella tularensis，Ft）、恙虫病东方体（Oriential tsutsugamushi，Ot）、巴尔通体（Bartonella spp.，Bar）、问号钩端螺旋体（Leptospira interrogans，Lep）、地方性斑疹伤寒立克次体（Rickettsia typhi，Rt）、嗜吞噬细胞无形体（Anaplasma phagocytophilum，Ap）、汉坦病毒（Hantavirus，HV）和大别班达病毒（Dabie bandavirus，DBV）8种致病微生物感染流行情况的系统性监测研究尚未见报道。Ft、Ot、Bar、Lep、Rt、Ap、DBV和HV可分别引起土拉热、恙虫病、巴尔通体病、钩端螺旋体病、地方性斑疹伤寒、人粒细胞无形体病、发热伴血小板减少综合征和肾综合征出血热。这些传染病在我国均有报道，传播速度快、危害性大，对公共卫生安全可造成严重影响。近年来海北州高原草甸环境中高原鼠兔数量泛滥，特别是每年8月活动更为频繁，增加了上述鼠源疾病的传播风险^[7]。因此，摸清高原鼠兔8种致病微生物携带情况，对海北州境内鼠源疾病风险评估和监测预警具有重要意义。

本研究对2020年8月在海北州海晏、祁连、刚察县和门源回族自治县（门源县）4个县的14个采样点捕获的高原鼠兔开展上述8种致病微生物的调查，采用多重实时荧光定量PCR（quantitative real-time fluorescence PCR，qPCR）或多重反转录实时定量PCR（reverse transcription qPCR，RT-qPCR）方法检测Ft、Ot、Bar、Lep、Rt、Ap、DBV和HV，了解海北州高原鼠兔8种致病微生物的携带情况，为海北州鼠传疾病防控及风险评估提供数据支持。

2020年8月，在海北州海晏、祁连、刚察和门源4个县的14个采样点（共计34 068.44 km²），用鼠夹和鼠笼法捕获高原鼠兔，编号并登记，采集肝、脾、肾和肺组织标本，于-80 ℃超低温冰箱中冻存待检。

无菌条件下，按照体积比1∶1∶1∶2的比例剪取肝、脾、肾和肺组织共25~30 mg，置于装有20~30粒研磨珠和200 μl磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）的研磨管中。应用RZ-Gr96高通量研磨仪（北京国科融智生物公司）进行机械研磨，程序设置为：1 600 r/min研磨30 s，暂停10 s，循环3次。研磨结束后，短暂离心（相对离心力约为850 g），吸取上层组织液，应用病毒DNA/RNA提取试剂盒（4.0）（西安天隆科技有限公司，货号：T035）提取核酸，ND-1000分光光度计（美国Thermo公司）测定核酸浓度和质量。

查阅相关文献^{[3, 8]}，并优化实验步骤后，使用双重qPCR方法对提取的核酸分别进行Ft和Ot、Bar和Lep、Rt和Ap 6种致病微生物的检测，试剂盒均使用Taq Pro HS Universal U⁺ Probe Master Mix（南京诺唯赞生物科技股份有限公司，货号：QN114-01）；反应体系为20 μl，包括模板3 μl，2× Taq pro HS universal U⁺ probe Master Mix 10 μl，正、反向引物各0.4 μl（终浓度0.2 μmol/L），探针0.2 μl（终浓度0.1 μmol/L），无菌水补齐；反应程序为：37 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s，45次循环。按照《全国病媒生物病原学监测方案（试行）》（中疾控传发〔2020〕13号），采用双重RT-qPCR检测HV的HTNV型和SEOV型，三重RT-qPCR检测DBV的L、M和S基因，试剂盒均使用HiScript Ⅱ One Step qRT-PCR Probe Kit（南京诺唯赞生物科技股份有限公司，货号：Q222-01）；反应体系为25 μl，包括2× one step Q Probe Mix 12.5 μl、正反向引物各0.5 μl（终浓度0.2 μmol/L）、探针0.3 μl（终浓度0.12 μmol/L）和1 μl One Step Q Probe Enzyme mix，无菌水补齐；反应程序为：50 ℃ 30 min；95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s、60 ℃ 45 s，40次循环。使用的qPCR仪为CFX96荧光定量PCR仪（美国BIO-RED公司）。

应用SPSS 26.0软件进行统计分析，采用χ²检验和Fisher确切概率法。P < 0.05为差异有统计学意义。

14个采样点共捕获237只高原鼠兔，其中，雌性105只（44.30%，105/237），雄性132只（55.70%，132/237），体表携带有蚤和革螨寄生虫的个体有77只，总寄生虫携带率为32.49%（77/237）。采样点生境均为草甸草原。捕获高原鼠兔最多的前5个采样点从高到低依次是阿柔乡草达板（38°4′31″N，100°23′56 ″E）、默勒老日根筋隆口（37°49′12″N，100°45′18″E）、央隆监测点（38°41′19″N，98°37′52 ″E）、甘子河乡察拉滩鸿湖芦（37°19′42″N，100°40′41″E）和俄堡黄草沟（38°2′52″N，100°38′39″E），分别占18.99%（45/237）、13.08%（31/237）、13.08%（31/237）、12.66%（30/237）和10.97%（26/237）。

对237份高原鼠兔组织标本核酸进行8种致病微生物检测，除Bar（6.75%，16/237）和Lep（2.11%，5/237）有检出外，Ap、Ot、Ft、Rt、DBV和HV 6种病原体均未检出，病原体总检出率为8.44%（20/237），不同致病微生物阳性检出率差异有统计学意义（χ²=87.011，P < 0.001），见表 1。其中，1只在祁连县草甸草原捕获的高原鼠兔同时检出了Bar和Lep，病原体复合感染率为0.42%（1/237）。Bar和Lep检出阳性的高原鼠兔标本采样点分布见图 1。

表 1 2020年8月海北州高原鼠兔8种致病微生物携带情况 Table 1 Carriage of eight pathogenic microorganisms in Ochotona curzoniae in Haibei Tibetan Autonomous Prefecture, August 2020

表选项

注：A为问号钩端螺旋体检出阳性采样点及阳性检出率；B为巴尔通体检出阳性采样点及阳性检出率。饼图下方的数值为阳性检出率（%）（检出阳性数量/检测数量）。 图 1 2020年8月海北藏族自治州高原鼠兔问号钩端螺旋体和巴尔通体检出阳性个体的采样点分布 Figure 1 Distribution of sampling sites of individuals positive for Leptospira interrogans and Bartonella spp. in Ochotona curzoniae in Haibei Tibetan Autonomous Prefecture, August 2020

图选项

Bar感染阳性的高原鼠兔分布在海宴县和祁连县，其中海晏县阳性个体1只，检出率为2.44%（1/41），祁连县阳性个体15只，检出率为8.24%（15/182），而门源和刚察2个县未检出Bar阳性标本，不同采样区域的Bar检出率不同，但差异无统计学意义（χ²=2.867，P=0.449）；Lep感染阳性的高原鼠兔均分布在祁连县，检出率为2.74%（5/182），不同采样区域的Lep检出率差异无统计学意义（χ²=1.544，P=0.696）。

在祁连县默勒镇老日根、俄堡黄草沟、央隆监测点、阿柔乡草达板和俄堡沙窝头5个采样点分别有3、4、4、3和1只Bar阳性高原鼠兔个体检出，而海宴县仅在甘子河乡察拉滩鸿湖芦采样点有1例阳性个体检出，祁连县不同采样点的高原鼠兔Bar检出率差异有统计学意义（χ²=43.971，P < 0.001），而海宴县不同采样点的高原鼠兔Bar检出率差异无统计学意义（χ²=0.376，P=1.000）。高原鼠兔Lep阳性个体仅在祁连县的央隆乡热水沟、阿柔乡草达板、俄堡黄草沟和央隆监测点4个采样点有检出，检出个体数量分别为1、2、1和1只，祁连县不同采样点的高原鼠兔Lep检出率不同，但差异无统计学意义（χ²=4.575，P=0.733）。

雄性高原鼠兔的病原体感染率最高，感染率为9.85%（13/132），其中Bar和Lep感染率分别为8.33%（11/132）和1.52%（2/132）；雌性高原鼠兔的病原体感染率为7.62%（8/105），其中Bar和Lep感染率分别为4.76%（5/105）和2.86%（3/105）。不同性别高原鼠兔间Bar的检出率差异无统计学意义（χ²=1.185，P=0.310），Lep检出率亦差异无统计学意义（χ²=0.400，P=0.664）。雄性鼠兔中Bar和Lep检出率差异有统计学意义（χ²=6.553，P=0.019），而雌性动物中Bar和Lep检出率差异无统计学意义（χ²=0.520，P=0.721）。

青藏高原因其独特的地理位置和自然环境，孕育了丰富的动物和植物资源。高原鼠兔作为青藏高原的优势小型兽类，具有适应性强、繁殖能力快和分布广等特点，主要栖息于草甸草原生态环境中^{[5, 9]}。高原鼠兔可携带多种鼠传病原体，近年来其数量的激增，不仅增加人类与它们接触的机会，也可能增加鼠传病原体传播的风险，一旦鼠源疾病流行，将严重威胁人类的生命健康。

本次调查首次采用多重qPCR和RT-qPCR方法对海北州海晏、祁连、刚察和门源4个县的高原鼠兔进行8种致病微生物的系统性调查与研究。该方法能够在同一个反应体系中同时检测多种目标病原体序列，相较于传统微生物学检测和单重qPCR/RT-qPCR方法，具有更高的灵敏度和特异性，检测速度更快，操作更简单，能显著提高检测效率并减少核酸和试剂的使用^{[3, 10]}。在本次调查中，高原鼠兔仅检出Bar和Lep，其中Bar检出率最高，并存在这2种病原体同时检出的现象。这表明Bar和Lep在海北州高原鼠兔种群中自然存在，并可能存在流行的情况。混合感染现象在小型兽类中并不少见，如在黑龙江漠河口岸^[11]和江苏无锡^[12]等地的监测中也有报道。混合感染可能增加病原体传播概率，从而使人类接触受感染动物后发生鼠源疾病的风险增加，对人类健康构成潜在威胁^[3]。Bar呈全球性分布，通过吸血节肢动物叮咬或动物抓挠传播，可引起人类卡瑞恩病、战壕热、猫抓病和心内膜炎等疾病^[13]。在海南藏族自治州（海南州）的喜马拉雅旱獭寄生蚤中，Bar感染率高达15.71%^[14]，由于海南州毗邻海北州，存在传播至海北州引起小型兽类感染Bar的可能性。钩端螺旋体病由Lep引起，主要分布于我国的长江流域，人类通过接触受污染的疫水或疫土而感染^[3]。海北州有青海湖内陆水系12条，近20年来，青海湖流域平均降雨量呈增加趋势，特别是在汛期（6－9月）时，连续降水易引发包括洪涝、泥石流在内的突发地质灾害^[15]。灾害发生后，Lep宿主动物的栖息地和人类生活环境发生变化，相互间的直接和间接接触机会变多，从而增加该传染病的传播风险。因此，海北州应将巴尔通体病和钩端螺旋体病作为鼠源疾病防控的重点之一。

国内关于鼠兔属动物携带Bar、Lep、Ap、Ot、Ft、Rt、DBV和HV 8种致病微生物的调查研究报告较少。目前，仅在四川省松潘县高原鼠兔^[16]、云南省藏鼠兔（O. thibetana）^[17]、黑龙江逊克县火山熔岩地区东北鼠兔（O. hyperborea）^[18]以及内蒙古自治区达乌尔鼠兔（O. dauurica）^[19]等种群中有Bar、Lep、Ap和HV的阳性检出报告，而其余4种病原体在鼠兔属动物中尚未有阳性感染个体检出。在本次调查中，未检测到Ap、Ot、Ft、Rt、DBV和HV 6种致病微生物，可能与采样点生境和采样月份单一有关。此外，本研究在高原鼠兔中检出Lep阳性个体，而程红兵等^[20]的研究则显示阴性结果，这种差异可能与2个因素有关：一是本研究的标本量较大，可能增加了检测到Lep阳性个体的概率；二是本研究仅关注于特定的草甸草原环境，而程红兵等^[20]的研究涉及多种不同的生境类型，可能影响了病原体的分布和检出率。

综上，本次调查选取8种致病微生物，分析了海北州高原鼠兔8种致病微生物基本的流行情况，调查发现Bar和Lep在高原鼠兔中有感染，且以Bar感染为主，提示今后开展鼠疫等病原体监测的同时，应加强其他致病微生物的监测和预防，警惕当地相关鼠源疾病的传播。

利益冲突  无