登革热、基孔肯雅热和寨卡病毒病是热带和亚热带地区广泛流行的重要蚊媒传染病，主要由携带登革病毒（Dengue virus，DENV）、基孔肯雅病毒（Chikungunya virus，CHIKV）和寨卡病毒（Zika virus，ZIKV）的白纹伊蚊（Aedes albopictus）或埃及伊蚊（Ae. aegypti）叮咬传播^[1]。景洪市2013年首次暴发登革热本地疫情^[2]以来，除2020－2022年，每年均有登革热本地疫情报道，特别是2019年报告3 303例本地病例^[3-5]，是云南省登革热本地疫情重点地区。目前，景洪市尚未发现存在基孔肯雅热和寨卡病毒病疫情。然而，云南省其他地区有寨卡输入性病例和基孔肯雅热本地病例的相关报道，2019年昭通市报告了云南省首例缅甸输入的寨卡病毒病病例^[6]，同年瑞丽市首次暴发云南省基孔肯雅热本地暴发疫情，共报告本地病例98例^[7]，李楠等^[8]在2020年临沧市沧源县采集的18例就诊发热患者血清中检测到CHIKV中和抗体。考虑到CHIKV、ZIKV与DENV有相似的临床症状及共同的传播媒介，在景洪市等登革热流行地区开展登革热疑似病例实验室诊断或媒介伊蚊感染病原检测时，同时开展DENV、CHIKV和ZIKV的筛查对虫媒病毒性疾病监测、预警和防控具有重要意义。

埃及伊蚊作为登革热传播重要媒介，景洪市2011年^{[5, 9]}首次报道白纹伊蚊和埃及伊蚊同域分布，此后研究发现白纹伊蚊和埃及伊蚊的种群分布不断发生变化，白纹伊蚊的种群优势逐渐被埃及伊蚊取代，其构成比由2016年的75.51%下降至2020年的36.67%^[10]。范建华等^[5]2022年的研究提示景洪市登革热不断暴发流行与该地区埃及伊蚊分布范围不断扩大有一定相关性。早在1981年和1988年，张海林等^[11]在景洪市采集的白纹伊蚊中分离到了DENV和CHIKV，郭晓芳等^[12]在2018年景洪市采集的埃及伊蚊中检测到DENV。伊蚊登革病毒的感染率是影响登革热疫情防控风险高低判定的重要因素之一，在疫情研判和处置中具有重要意义。因此，在2023年景洪市登革热疫情暴发后，我们对当地媒介伊蚊种群构成、伊蚊感染病毒等展开了调查，为登革热防控措施制定、风险研判和疫情溯源提供科学依据，也为其他重要伊蚊传播疾病的防控提供预警信息。

2023年8－12月采用《病媒生物密度监测方法蚊虫》（GB/T 23797－2020）^[13]中的双层叠帐法在景洪市城区开展成蚊应急监测，8－10月采集埃及伊蚊或白纹伊蚊成蚊样本，将捕获的蚊虫冷冻处死，鉴定蚊种、性别并计数^[14]，鉴定完成后保存于RNA Later溶液（Invitrogen，货号：AM7020）中，记录样本采集信息备用。

从RNA Later液中取出伊蚊标本，按采集地点、时间、种类和雌雄进行分组，每组样本置于圆底2.0 ml离心管中，用组织研磨仪制备成蚊悬液。用Ex-DNA/RNA病毒4.0试剂盒（西安天隆科技有限公司，批号：23040610T324），按照试剂盒说明书提取蚊悬液上清病毒RNA。采用寨卡病毒/登革病毒/基孔肯雅病毒三重核酸检测试剂（PCR荧光探针法）（深圳澳东检验检测科技有限公司，批号：A33211）检测DENV、ZIKV和CHIKV感染情况，反应总体积25 µl：扩增反应液16 µl，酶混液2 µl，三重反应液2 µl，模板RNA 5 µl。反应条件：50 ℃反转录，15 min；95 ℃预变性，3 min；95 ℃变性10 s，55 ℃退火35 s（采集荧光信号），72 ℃延伸1 min，共45个循环。判断：阳性对照阈值循环数（cycle threshold，Ct） < 30且出现明显指数增长期，样本Ct值≤37且出现明显指数增长期判断为阳性。检测DENV阳性的样本，继续采用登革病毒（Ⅰ型/Ⅱ型/Ⅲ型/Ⅳ型）四重核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）（深圳澳东检验检测科技有限公司，批号：A37011）进行病毒血清分型，反应总体积25 µl：扩增反应液16 µl，酶混液2 µl，四重反应液2 µl，模板RNA 5 µl。反应条件：50 ℃反转录，15 min；95 ℃预变性，3 min；95 ℃变性5 s，55 ℃退火35 s（采集荧光信号），72 ℃延伸1 min，共45个循环。结果判断：阳性对照Ct值< 30且出现明显指数增长期，样本Ct值≤37且出现明显指数增长期判定为阳性。

使用GoScript™ Reverse Transcription Mix，Random Primers反转录试剂盒[普洛麦格（北京）生物技术有限公司，货号：A2801]对已确定为阳性的RNA样本进行反转录合成得到病毒第一链cDNA，进行DENV-1 E基因序列扩增，目标片段分别为757、710和1 072 bp，引物见表 1。反应PCR扩增试剂为GoTaq^® Master Mixes[普洛麦格（北京）生物技术有限公司，货号：M7122]，反应总体积25 µl，其中cDNA模板2 µl，正、反游引物各1 µl。反应条件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，35个循环；72 ℃ 10 min。取3 µl扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，PCR阳性产物送生工生物工程（上海）股份有限公司进行双向测定。测序结果使用DNAStar 5.01软件下的SeqMan模块进行序列拼接，利用美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）网站的基于局部比对算法的搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）及DNAStar 5.01中的MegAlign进行同源性比较。多序列比对采用MEGA 7软件中的ClustalW模块进行，MEGA 7软件构建Neighbor-Joining进化树，采用Kirmura2-parameter模型，bootstrap值设置为1 000。

表 1 DENV E基因扩增引物 Table 1 Primers used for DENV E gene amplification

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采用Excel 2019和SPSS 26.0软件进行数据整理和统计学分析。率的比较采用χ²检验或Fisher确切概率法，P < 0.05为差异有统计学意义。

2023年8－12月使用双层叠帐法在景洪市累计开展1 447个点次媒介伊蚊成蚊应急监测，平均成蚊密度为0.73~7.75只/（顶·h），其中8月累计监测111点次，平均成蚊密度7.75只/（顶·h），9－10月共监测1 336点次，月平均成蚊密度分别为4.43、1.58、1.22和0.73只/（顶·h）。8月单日成蚊密度最高为21.5只/（顶·h），9－11月分别为17.00、2.59、3.80和1.87只/（顶·h），8月27日蚊密度达到峰值后开始下降，9月20日后维持在较低密度水平波动。见图 1。

图 1 云南省景洪市2023年8－12月登革热疫情期间伊蚊成蚊应急监测 Figure 1 Emergency surveillance of adult Aedes mosquitoes in Jinghong, Yunnan Province, during the dengue fever epidemic season (from August to December, 2023)

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8－10月共采集伊蚊雌蚊730只，其中埃及伊蚊548只（75.07%），白纹伊蚊182只（24.93%）。8月采集伊蚊雌蚊143只，其中埃及伊蚊110只（76.92）%，白纹伊蚊33只（23.08%）；9月采集伊蚊雌蚊369只，埃及伊蚊346只（93.77%），白纹伊蚊23只（6.23%）；10月采集伊蚊雌蚊218只，埃及伊蚊92只（42.20%），白纹伊蚊126只（57.80%）。见表 2。

表 2 云南省景洪市2023年8－10月伊蚊成蚊分布及构成情况 Table 2 Distribution and composition of adult Aedes mosquitoes in Jinghong, Yunnan Province, from August to October, 2023

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730只伊蚊标本按采集时间、地点、种类和雌雄分为76组（白纹伊蚊21组，埃及伊蚊55组）。对76组伊蚊进行DENV、ZIKV和CHIKV核酸检测，结果ZIKV和CHIKV病毒核酸结果均为阴性，共11组（14.47%）样本为DENV阳性。11组阳性样本中，白纹伊蚊阳性2组，感染率为9.52%（2/21），埃及伊蚊阳性样本共9组，感染率为16.36%（9/55），不同种类DENV感染率差异无统计学意义（χ²=0.574，P=0.449）。8－10月伊蚊登革病毒感染率分别为28.57%、20.59%和0，不同月份DENV感染率差异有统计学意义（χ²=8.013，P=0.018）。

对11组DENV阳性样本进行血清分型检测，结果11组样本均为DENV-1型，Ct值为21.86~36.87。对11组DENV-1阳性样本进行E基因序列扩增，成功扩增出4条E基因序列，1条序列来自白纹伊蚊，其余3条来自埃及伊蚊。上述4条序列已提交至NCBI网站，GenBank序列号为PP389945－PP389948。见表 3。

表 3 云南省景洪市伊蚊雌蚊DENV-1阳性样本血清分型及E基因检测结果 Table 3 Serotype and genotype information results by E gene of DENV-1 positive specimens from female Aedes mosquitoes from Jinghong, Yunnan Province

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4条DENV-1 E基因序列核苷酸相似性为100%，与2023年景洪市病例血清样本（23 JH46）核苷酸相似性为100%。进化分析显示4株DENV-1均属于基因Ⅰ型，位于同一进化分支，与23 JH46（2023，景洪）、OR418422.1（2023，广州）、MW559406.1（2019，老挝）和MW793710.1（2019，缅甸）序列同源性最高，核苷酸相似性为99.26%~100%。见图 2。

注：●代表本研究的DENV-1 E基因序列。 图 2 2023年云南省景洪市媒介伊蚊DENV-1 E基因序列进化分析 Figure 2 Phylogenetic analysis of DENV-1 E gene sequence of Aedes vectors in Jinghong, Yunnan Province, 2023

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2023年8－12月应急监测结果提示，通过8－9月景洪市城区多轮次的大规模灭蚊喷洒后，城区伊蚊成蚊得到了有效杀灭，10－11月定期开展城区灭蚊喷洒使成蚊密度控制在较低水平，景洪市登革热疫情在10月后得到了很好的控制，9－12月西双版纳傣族自治州报告病例数不断减少，依次为1 749、1 006、95和4例^[15]。2011年景洪市首次发现埃及伊蚊后，监测数据显示其分布范围正在不断扩大，且埃及伊蚊和白纹伊蚊的种群构成也发生了交替，埃及伊蚊有进一步取代白纹伊蚊成为该地优势蚊种的趋势^{[5, 9-10]}，本次调查结果符合该变化趋势，埃及伊蚊构成比明显高于白纹伊蚊。此外，云南省其他登革热流行地区，如勐腊县、瑞丽市和耿马傣族佤族自治县的登革热流行区域同样发现埃及伊蚊（成蚊种群比例69.3%~80.15%）有逐步取代白纹伊蚊成为优势蚊种的趋势^[16-20]，而这些地区埃及伊蚊幼蚊的分布也远高于白纹伊蚊^[21-22]。埃及伊蚊分布地区的不断扩大，与这些地区登革热的暴发流行密切相关^{[5, 17, 20]}。埃及伊蚊为家栖型蚊种，比白纹伊蚊更加适应城市环境^[23]，因此，城市化进程加剧和旅游业发展带来的城市环境、高居住密度和人口密度为埃及伊蚊种群繁殖提供了更多优势，这可能是景洪市及其他登革热流行地区埃及伊蚊分布范围不断扩大、种群构成不断升高且登革热持续广泛流行的重要原因之一。

此外，对该地区埃及伊蚊和白纹伊蚊种群构成的月差异调查发现，8－10月两者的构成比存在一定差异，8－9月埃及伊蚊种群优势明显，其构成比高达76.92%和93.77%，而10月其种群数量大幅减少，构成比出现低于白纹伊蚊的情况，可能是由于登革热疫情处置过程中持续开展杀灭成蚊和高频率的翻盆倒罐活动，使得埃及伊蚊成蚊数量和幼蚊孳生地急剧减少。此外，有研究发现气温对埃及伊蚊分布的影响要大于白纹伊蚊^[24]，可能也是10月该地埃及伊蚊种群大幅减少的原因之一。

本调查发现2023年景洪市登革热流行季节采集的白纹伊蚊和埃及伊蚊均存在感染DENV的情况，但并未发现其感染ZIKV和CHIKV，这可能与景洪市尚未发生ZIKV和CHIKV流行有关。本研究调查结果显示埃及伊蚊和白纹伊蚊DENV感染率差异无统计学意义，然而有研究发现^[25-26]埃及伊蚊对登革热病毒的易感性要优于白纹伊蚊，提示埃及伊蚊为优势蚊种的地区，媒介感染登革病毒的概率要高于其他地区。对于DENV阳性的样本，通过血清分型检测和E基因进化分析，仅检出1个血清型和1种基因型，为近年来景洪市和云南省主要流行的血清型和基因型，2种伊蚊携带登革病毒与疫情流行期间该地患者血清DENV核苷酸相似性为100%，表明埃及伊蚊和白纹伊蚊为景洪市登革热传播媒介。E基因进化分析显示，2023年景洪市伊蚊媒介携带登革病毒与老挝、缅甸和泰国等东南亚国家流行株在同一进化分支，提示景洪市登革热疫情与东南亚登革热疫情的流行高度相关，应进一步加强境外疫情的监测和报告工作。

综上所述，本次调查表明埃及伊蚊和白纹伊蚊是2023年景洪市登革热疫情传播的重要媒介，埃及伊蚊为优势蚊种，2种伊蚊均检出携带DENV-1，且与引起本地疫情的登革病毒高度同源、与缅甸和老挝等国家流行株关系相近，应加强周边国家登革热输入病例监测工作，持续开展重要媒介虫媒病毒感染情况调查，为登革热等虫媒病毒性疾病防控提供科学依据和预警信息。

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