2022, Vol. 52
2. 海水养殖教育部重点实验室中国海洋大学，山东 青岛 266003
长蛸(Octopus minor)广泛分布于中国沿海，是重要的经济蛸类[1]。由于营养价值高、生长周期短(通常为一年)且生长速度快，因此被认为是一种有推广前景的养殖品种。长蛸是肉食性动物，其摄取的大量蛋白类物质最终代谢产物主要是氨，研究发现体质量相当的蛸类氨排泄量是鱼类的2~3倍[2]。长蛸与甲壳类的生活环境类似，都是底栖或表现出掩埋行为的动物，产生的代谢副产物使沉积物中的氨氮水平升高，这可能导致养殖环境中氨氮含量高于养殖水体的安全浓度[3]。养殖水体中的高浓度氨氮是水生动物死亡的原因之一[4-5]。国内外许多研究报道了急性氨氮胁迫对水生动物组织结构的影响，例如张武肖等[6]在研究氨氮胁迫对团头鲂(Megalobrama amblycephala)幼鱼鳃、肝和肾组织结构的影响时，发现不同器官之间损伤程度不同，肝组织损伤最严重，其次是鳃和肾，且随着胁迫时间延长，组织受损增加，难以恢复; 陈思涵等[7]研究了急性氨氮胁迫对虎斑乌贼(Sepia pharaonis)肝脏、鳃和脑组织结构的影响，发现氨氮胁迫浓度相同时，不同组织器官的损伤程度有差异，其中肝脏对氨氮胁迫最敏感，损伤程度最大，其次是鳃和脑组织; Feyjoo等[8]阐述了氨氮对真蛸(Octopus vulgaris)幼体细胞色素的影响，结果显示随着氨浓度的增加，色素细胞在受刺激变暗后又回到透明状态的时间明显减少; Cong等[9]研究了氨氮毒性对菲律宾蛤仔(Ruditapes phili-ppinarum)鳃组织造成的损伤，结果发现与对照组相比实验组的鳃丝被拉伸或折断，鳃丝内部的基底细胞几乎消失。大部分研究内容都包含了鳃组织，因为鳃是很多水生生物排出氨基酸并将其分解代谢产生氨的重要器官，同时存在被动扩散和主动转运，在氨解毒代谢中具有重要作用[10]。此外，文献[11]研究表明，虎斑乌贼(Sepia pharaonis)能在鳃组织的帮助下，将体内有毒的游离氨转换成无毒的谷氨酰胺储存在体内，以用于其他的机体代谢或最终合成尿素排出体外。
氨氮胁迫对水产动物组织结构损害的研究主要集中于鱼类和甲壳类，在头足类中研究甚少，蛸科几乎没有。本文通过对长蛸进行低、中、高3个不同浓度的氨氮胁迫，观察不同浓度的氨氮胁迫对长蛸鳃、肝脏以及肾脏组织学的影响，填补了蛸科动物氨毒性组织学研究方面的空白，为深入研究长蛸氨解毒代谢机制提供了理论依据。
1 材料与方法 1.1 实验材料于山东省荣成市月湖海区采捕野生的、体质健壮的成熟长蛸，长蛸的平均体质量为(180.2±30.5) g，在马山集团育苗厂内暂养。自然海水经沉淀、曝气和消毒后使用。水温为(20.8±0.5)℃, 每天更换的水量约为养殖池水量的1/3。投喂肉球近方蟹1次/d。暂养期间长蛸活力旺盛, 死亡率低于5%。暂养一周后, 将其转移至长×宽×高为67 cm×45 cm×47 cm的方桶中, 每桶放置长蛸8只, 养殖环境和管理方法与养殖池保持一致, 持续充氧, 暂养一周。实验前停食一天, 选择身体健康、活力旺盛的个体随机分组进行实验。
1.2 实验方法参考陈智威等[12]的实验结果, 选择48 h作为胁迫时间，同时从中选取3个适宜浓度(即胁迫48 h长蛸不会完全死亡的浓度)用于实验。本实验设低、中、高3个浓度实验组和1个对照组, 其总氨氮(Total-NH3, TAN)浓度分别为: 87.0 mg/L(低浓度组)、143.5 mg/L(中浓度组)、204.0 mg/L(高浓度组)和0(对照组, 自然海水养殖下氨氮浓度)。使用NH4Cl控制3个实验组的总氨氮浓度，将NH4Cl放入加水的方桶中，搅拌均匀，利用氨氮仪(哈纳HI96715)检测至要求浓度。每个方桶分为一组，每组个体数均为8只，每个浓度组设2个平行重复组。每天检测总氨氮浓度, 维持实验环境的氨氮浓度不变。实验期间，长蛸处于停食状态, 每24 h更换1/2体积的水, 持续充氧，及时捞出死亡的个体，胁迫48 h后取样，每一浓度取样6只。
为减少样品痛苦并严格遵守科研道德程序，在解剖组织之前采用7.5%氯化镁对个体进行麻醉[13-14]。解剖取出鳃、肝脏和肾脏，波恩氏液固定，然后酒精梯度脱水、二甲苯透明、石蜡包埋，连续切片(厚度4~5 μm)，苏木精-伊红(HE)染色(染色步骤参照文献[15])。光镜观察、拍摄，用Photoshop软件测量细胞形态数据，每一浓度组取6张不同个体的片子，计算平均值和标准差。
2 结果87.0 mg/L的氨氮溶液胁迫下，实验初期长蛸活力旺盛，与对照组无差别，游泳能力正常，直至48 h时出现死亡(见表 1)，水体未出现颜色变化和异味; 143.5 mg/L的氨氮溶液胁迫下，实验初期长蛸偶尔出现躁动现象，即突然地窜动，水体颜色未有明显变化，48 h时长蛸出现喷墨现象，开始有长蛸死亡(见表 1)，存活个体卧于方桶底部或蜷缩至角落，几乎不能游动，水体颜色变黄; 204.0 mg/L的氨氮溶液胁迫下，实验初期长蛸就出现躁动不安的情况，大部分长蛸出现急速游泳和喷墨的现象，24 h时长蛸开始死亡，48 h时出现大量死亡(见表 1)，水面浮有泡沫，水体浑浊，带有腥味。
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表 1 氨氮胁迫48 h后不同浓度组的死亡率 Table 1 Mortality of O. minor at 48 h in different concentration of ammonia |
表 1显示，在胁迫24 h时，87.0和143.5 mg/L实验组中均无死亡个体，意味着其氨毒性未积累到一定程度，对长蛸而言可以忍受; 胁迫48 h时，3个浓度的氨溶液中均有长蛸死亡，且随着胁迫浓度的升高而逐渐增加，组织学结果显示氨毒已经对长蛸的组织器官产生了影响(见图 1~3)。
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(A. 对照组; B. 87.0 mg/L胁迫组; C. 143.5 mg/L胁迫组; D. 204.0 mg/L胁迫组。N: 细胞核; NH: 细胞核肿大; CV: 细胞空泡化; K: 细胞核溶解。标尺=20 μm。A. The control group; B. 87.0 mg/L stress group; C. 143.5 mg/L stress group; D. 204.0 mg/L stress group. N: Nuclear; NH: Nuclear hypertrophy; CV: Cellular vacuolation; K: Karyolysis. Scale bar=20 μm. ) 图 1 氨氮胁迫下长蛸鳃的组织切片图 Fig. 1 Details of the gill micrographs in O. minor under the stress of ammonia |
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(A. 对照组; B. 87.0 mg/L胁迫组; C. 143.5 mg/L胁迫组; D. 204.0 mg/L胁迫组。N: 细胞核; HC: 肝小叶; K: 细胞核溶解; CV: 细胞空泡化; HS: 肝血窦; SV: 中央静脉。标尺=20 μm。A. The control group; B. 87.0 mg/L stress group; C. 143.5 mg/L stress group; D. 204.0 mg/L stress group. N: Nuclear; HC: Hepatic contour; K: Karyolysis; CV: Cellular vacuolation; HS: Hepatic sinusoid; SV: Central vein. Scale bar=20 μm. ) 图 2 氨氮胁迫下长蛸肝脏的组织切片图 Fig. 2 Detail of the liver micrographs in O. minor under the stress of ammonia |
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(A. 对照组; B. 87.0 mg/L胁迫组; C. 143.5 mg/L胁迫组; D. 204.0 mg/L胁迫组。N: 细胞核; RT: 肾小管; RC: 肾细胞; IF: 组织液。标尺=20 μm。A. The control group; B. 87.0 mg/L stress group; C. 143.5 mg/L stress group; D. 204.0 mg/L stress group. N: Nuclear; RT: Renal tubules; RC: Renal cells; IF: Interstitial fluid. Scale bar=20 μm. ) 图 3 氨氮胁迫下长蛸肾脏的组织切片图 Fig. 3 Detail of the kidney micrographs in O. minor under the stress of ammonia |
对照组(见图 1A)中鳃组织结构较完整、紧致，鳃细胞排列整齐，无空泡; 低浓度胁迫组(见图 1B)中鳃细胞涨大，细胞核肿胀排列不整齐; 中浓度胁迫组(见图 1C)中鳃细胞具有空泡化结构，可观察到细胞间渗出的组织液; 高浓度胁迫组(见图 1D)中鳃细胞出现大量空泡结构，鳃细胞排列松散，表现出一定程度的损伤。从对照组到高浓度胁迫组，氨氮胁迫浓度依次升高，细胞核直径不断增加，细胞中空泡直径也不断增加(见表 2)。由此可以认为，不同浓度的氨氮溶液对长蛸鳃组织产生了不同程度的影响和破坏，主要表现为细胞核体积增大，排列不整齐，细胞内出现空泡，排列松散，且空泡的数量和直径不断增加。
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表 2 氨氮胁迫下长蛸鳃组织结构形态比较数据 Table 2 Comparative data on the morphology in the gill structure of O. minor under the stress of ammonia |
对照组(见图 2A)中肝组织结构完整，中空部位为中央静脉，围绕中央静脉细胞排列一圈的细胞为中央静脉管壁，对照组图片显示管壁细胞完整、排列整齐; 在低浓度胁迫组(见图 2B)中管壁部分细胞核溶解，逐渐产生空泡化结构; 与对照组相比，中浓度胁迫组(见图 2C)中样品中央静脉管壁细胞核排列松散，但结构依然较完整，其余部位的细胞核有溶解现象; 高浓度胁迫组(见图 2D)与中浓度胁迫组相似，中央静脉管壁细胞排列结构较完整，但组织空泡化较明显。从对照组到高浓度胁迫组，氨氮胁迫浓度依次升高，细胞核直径略有增加，但对照组和低浓度胁迫组、中浓度胁迫组和高浓度胁迫组之间的增加趋势不明显，中央静脉管壁的直径不断增加(见表 3)。以上现象表明，随着胁迫浓度的增加，细胞排列逐渐松散，中央静脉管壁的完整度逐渐降低，导致肝组织的部分结构损坏，这可能是导致长蛸死亡的因素之一。
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表 3 氨氮胁迫下长蛸肝组织结构形态比较数据 Table 3 Comparative data on the morphology in the liver structure of O. minor under the stress of ammonia |
表 1显示，在胁迫24 h时，87.0和143.5 mg/L实验组中均无死亡个体，意味着其氨毒性未积累到一定程度，对长蛸而言可以忍受; 胁迫48 h时，3个浓度的氨溶液中均有长蛸死亡，且随着胁迫浓度的升高而逐渐增加，组织学结果显示氨毒已经对长蛸的组织器官产生了影响(见图 1~3)。
对照组(见图 1A)中鳃组织结构较完整、紧致，鳃细胞排列整齐，无空泡; 低浓度胁迫组(见图 1B)中鳃细胞涨大，细胞核肿胀排列不整齐; 中浓度胁迫组(见图 1C)中鳃细胞具有空泡化结构，可观察到细胞间渗出的组织液; 高浓度胁迫组(见图 1D)中鳃细胞出现大量空泡结构，鳃细胞排列松散，表现出一定程度的损伤。从对照组到高浓度胁迫组，氨氮胁迫浓度依次升高，细胞核直径不断增加，细胞中空泡直径也不断增加(见表 2)。由此可以认为，不同浓度的氨氮溶液对长蛸鳃组织产生了不同程度的影响和破坏，主要表现为细胞核体积增大，排列不整齐，细胞内出现空泡，排列松散，且空泡的数量和直径不断增加。
对照组(见图 2A)中肝组织结构完整，中空部位为中央静脉，围绕中央静脉细胞排列一圈的细胞为中央静脉管壁，对照组图片显示管壁细胞完整、排列整齐; 在低浓度胁迫组(见图 2B)中管壁部分细胞核溶解，逐渐产生空泡化结构; 与对照组相比，中浓度胁迫组(见图 2C)中样品中央静脉管壁细胞核排列松散，但结构依然较完整，其余部位的细胞核有溶解现象; 高浓度胁迫组(见图 2D)与中浓度胁迫组相似，中央静脉管壁细胞排列结构较完整，但组织空泡化较明显。从对照组到高浓度胁迫组，氨氮胁迫浓度依次升高，细胞核直径略有增加，但对照组和低浓度胁迫组、中浓度胁迫组和高浓度胁迫组之间的增加趋势不明显，中央静脉管壁的直径不断增加(见表 3)。以上现象表明，随着胁迫浓度的增加，细胞排列逐渐松散，中央静脉管壁的完整度逐渐降低，导致肝组织的部分结构损坏，这可能是导致长蛸死亡的因素之一。
对照组(见图 3A)的肾组织结构完整，肾小管之间几乎不存在缝隙，肾细胞形状圆润完整，细胞核基本位于细胞中央; 低浓度胁迫组(见图 3B)中肾细胞形状变扁，部分细胞呈破碎状态，细胞核逸出，肾小管之间产生空隙，且组织液渗出，管中央空隙不断增大; 中浓度胁迫组(见图 3C)中肾细胞逐渐拉长、扁平，组织液开始渗出; 高浓度胁迫组(见图 3D)中肾细胞不断缩小，肾小管之间空隙更大，大量组织液渗出，且中央部位产生了更大的空隙。从对照组到高浓度胁迫组，氨氮胁迫浓度依次升高，细胞核直径无明显差异，但肾细胞直径呈降低趋势，同时细胞扩散，肾小管直径不断增加，与对照组相比高浓度组增加值最大(见表 4)。
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表 4 氨氮胁迫下长蛸肾组织结构形态比较数据 Table 4 Comparative data on the morphology in the kidney structure of O. minor under the stress of ammonia |
鳃不仅是水生动物摄取食物、进行呼吸作用的重要器官，在动物体内的渗透调节中也起着重要作用[16-17]。鳃组织病变会影响水生动物摄食、呼吸、排泄以及调节酸碱和离子平衡等生理活动[18]。Zhou等[19]发现氨氮胁迫使草鱼(Ctenopharyngodon idella)鳃细胞核颜色逐渐变浅，鳃细胞内部出现空白，胞核边缘不清，并观察到次级鳃片的水肿和融合; 陈思涵等[7]发现急性氨氮胁迫下虎斑乌贼的鳃组织出现泌氯细胞溶解，上皮细胞核溶解、空泡化、排列紊乱及鳃丝淤血、坏死和脱落的现象。说明氨氮胁迫会破坏水生动物的鳃结构，破坏其上皮细胞核，使其逐渐溶解，产生空泡化。本实验结果显示，鳃细胞核出现溶解，细胞数量变少，从而导致鳃细胞边缘开始模糊(见图 1);氨氮胁迫导致鳃内部细胞核肿胀，细胞空泡化严重，且空泡直径整体呈增加趋势(见表 2)。但表 2显示中浓度胁迫组的空泡平均直径小于其他各组，推测可能是细胞不断溶解后，细胞内液体堆积，导致镜检可见的空泡直径减小(见图 1C)。长蛸鳃组织损伤情况随氨氮胁迫浓度的升高和胁迫时间的延长而增加，且高浓度胁迫组与对照组相比较，鳃组织损伤情况较明显，低、中浓度胁迫组与对照组相比较，鳃组织损伤程度稍小。
肝脏在水生动物的代谢﹑免疫和解毒等方面具有非常重要的作用。在鲤(Cyprinus carpio)幼鱼和罗非鱼(Oreochromis mossambicus)的研究中发现，氨氮经血液运输到肝脏后，利用肝脏中的酶将高毒性的非离子氨通过解毒作用转化为低毒性的尿素释放出来，且损伤后的肝脏也会影响其体内解毒代谢的正常进行[20-21]。陈思涵等[7]研究发现，急性氨氮胁迫后，肉眼可以观察到高浓度组虎斑乌贼肝脏颜色鲜红，出现肿胀、糜烂等现象，镜检发现肝小叶破裂，肝血窦扩张; 郝小凤等[22]对急性氨氮胁迫后的泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)的肝组织进行超微结构观察，发现在高氨氮浓度胁迫后，泥鳅肝脏的细胞核形状异常，细胞空泡化严重，细胞核内容物大量外泄。说明氨氮胁迫会破坏水生动物的肝脏结构，使其颜色改变、内部结构肿胀破裂，导致肝细胞核变形。本实验结果显示，随着氨氮浓度的增加，肝小叶排列逐渐松散，边缘模糊，中央静脉管壁的完整度逐渐降低(见图 2)，肝血窦、中央静脉管壁直径也不断增加(见表 3)。表 3显示，肝细胞核的平均直径略有变化，其中低浓度胁迫组中核直径比对照组小，可能是在氨氮胁迫初期，肝细胞中的抗氧化酶活性提高，为了减轻细胞肿大对肝组织影响，使细胞核直径略有下降，张武肖等[6]实验结果证明抗氧化酶能够降低氨氮胁迫对团头鲂肝组织的毒性作用。与鳃组织结构损伤情况比较发现，同种氨氮浓度胁迫下，肝组织的结构损伤较为明显，可以推测氨毒入侵长蛸体内时，肝组织是受到主要损伤的部位之一。
对于肾脏组织，研究较多的物种主要是鱼类，在头足类中的研究较少见。肾脏是水生动物较常见的排泄器官，利用肾脏的排泄功能，水生动物可以将其新陈代谢产生的物质排出体外，同时肾脏与鳃有着部分相似的功能，即可以调节生物体内离子平衡和渗透压，因此水生动物的肾脏损伤程度可以作为检测环境污染的指标之一[6, 23]。张武肖等[6]研究发现，水中高浓度氨氮使团头鲂幼鱼的肾小球萎缩、坏死，肾小管上皮细胞肿大、空泡化、充血严重。说明氨氮胁迫同样会破坏水生动物的肾脏功能，这在上皮细胞中表现明显，氨氮胁迫下上皮细胞会不断肿大，空泡化严重。本实验中，氨氮对长蛸肾脏产生的主要影响为细胞核逸出，组织液大量渗出(见图 3C、3D)，肾细胞直径明显缩短，肾小管之间产生空隙且直径不断增加(见表 4)。表 4显示不同浓度的氨氮胁迫下，肾细胞核直径变化不显著，但细胞直径逐渐缩短，部分细胞核变为椭圆形，导致低浓度实验组的核直径大于对照组，但在胁迫浓度升高后，细胞开始破裂，细胞核逸出，其形态和直径略有变化，表现为直径缩短。以上现象表明，随着氨氮浓度的升高，肾脏的结构损伤会越发严重，张武肖等[6]也在文章中解释氨氮胁迫后肾脏的自我恢复能力较鳃和肝脏差。
研究发现，氨氮胁迫导致水生动物死亡的原因主要有三种：一是氨氮毒性物质导致肝脏和肾脏的器官病变; 二是氨氮毒性物质扰乱了鳃组织上皮细胞的排列方式，导致鳃细胞中细胞器受损，降低氧气的输送效率，通过影响呼吸作用导致生物死亡; 三是氨氮毒性物质导致脑细胞肿胀破损，从而导致生物死亡[7, 21-22]。根据以上发现，可以推测高浓度氨氮导致长蛸死亡的原因可能是其使长蛸的鳃、肝脏和肾脏产生了不可逆转的病变，从而使得长蛸在调节渗透压、解毒排泄和呼吸作用方面产生障碍，进而对机体造成损害。
4 结论(1) 不同浓度的氨氮胁迫48 h后，长蛸组织器官损伤程度与氨氮胁迫浓度呈正相关，即随着胁迫浓度的升高，组织损伤程度越来越明显。
(2) 肾脏的组织结构损伤程度较大，鳃和肝脏次之。
(3) 随着氨氮胁迫浓度的升高，鳃和肝组织细胞核直径逐渐增大，组织细胞排列逐渐松散，部分细胞核开始溶解，导致空泡化不断加剧，肾组织细胞液外渗。
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2. The Key Laboratory of Mariculture Ocean University of China, Ministry of Education, Qingdao 266003, China