2018, Vol. 48
牡蛎是世界性广布种类，是我国乃至世界最重要的海产经济贝类之一。2016年中国牡蛎养殖产量达483万t，居世界首位[1]。长牡蛎(Crassostrea gigas)又称太平洋牡蛎，是我国北方沿海最主要的养殖种类。在北方海域长牡蛎的繁殖期在每年的5~8月，此时体内大部分营养用于繁殖后代，体内糖原大量消耗，软体部重量急剧减少，口感差，不宜供应市场。因此，牡蛎养殖业亟需引进优良牡蛎新品种来供应夏季市场。
岩牡蛎(Crassostrea nippona)，又称夏牡蛎，属珍珠贝目(Pterioida)牡蛎科(Ostreidae)，主要分布在日本、韩国等东亚地区，具有抗病能力强、适应范围广、生长速度快、产量高等特点。岩牡蛎产卵期在8~9月，且有多批次放精产卵的特点，夏季体内糖原含量仍保持在较高水平，味道较好，弥补了长牡蛎夏季产卵不能上市的空缺，深受市场欢迎[2]。
为了丰富我国牡蛎的养殖种类，我们从日本引进岩牡蛎进行人工育苗和良种选育。在引种繁育中发现，岩牡蛎与长牡蛎成体区别明显，但稚贝不易区分。由于牡蛎的外壳可塑性较强和分布区域的重叠性，仅仅依据外部形态学特征鉴定牡蛎种类存在很强的主观因素，这给牡蛎新品种的选育与养殖带来极大困难。因此，迫切需要一种快速有效的鉴别岩牡蛎与长牡蛎的技术方法。
聚合酶链式反应－限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)技术是一种常用的快速简便分析物种组成的方法[3]，与PCR产物测序的序列对比鉴定方法相比，其操作简单、快捷，节约成本。本研究基于岩牡蛎与长牡蛎16S rDNA与COI基因片段开发了一种快速高效的PCR-RFLP鉴定技术，首次从分子生物学水平上鉴别区分这2种重要的经济贝类。
1 材料和方法 1.1 实验材料实验所用的岩牡蛎与长牡蛎取自山东荣成养殖基地。每种牡蛎各取壳高2~3 cm的稚贝18个个体，解剖取闭壳肌，于-80 ℃超低温冰箱保存，用于提取DNA。
1.2 PCR扩增与测序采用常规“酚—氯仿”抽提法提取样品基因组DNA，用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测所提取的DNA质量，并用超微量分光光度计(NanoDrop 2000)测定DNA浓度，最终稀释至50 ng/μL。参照Palumbi等[4]设计的引物(16Sar：5′-CGCCTGTTTATCAAAAACAT-3′，16Sbr：5′-CCGGTCTGAACTCAGATCACGT-3′)，以基因组DNA为模板，扩增岩牡蛎和长牡蛎的16S rDNA片段。根据岩牡蛎(GenBank登录号：HM015198)与长牡蛎(GenBank登录号：AB033687)线粒体COI的相对保守区域，利用Premier 5.0软件设计出一对引物序列(COIY-F：5′-CTATTAGAAATATGCGGTCTG-3′，COIY-R：5′-AACAAAGTAAGTATCGTGAAG-3′)，用于扩增2种牡蛎的COI基因片段。PCR反应体系为10 μL：50 ng DNA，0.25 U Taq DNA聚合酶，1 μL 10× PCR buffer，0.8 μL dNTPs，1 μmol/L上下引物，5.15 μL灭菌超纯水。PCR反应程序为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，56 ℃(16S rDNA)或54 ℃(COI)退火45 s，72 ℃延伸1 min，共32个循环；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。取2 μL PCR产物，经1.5%的琼脂糖凝胶电泳成像检测。随机挑选部分个体的PCR产物送至青岛华大基因生物有限公司进行测序。
1.3 PCR-RFLP分析测序得到的序列，运用软件Clustal W进行序列比对。使用软件BioEdit进行酶切位点的分析，最后选取同一种内切酶Alu Ⅰ对COI与16S rDNA基因片段进行酶切。酶切反应体系为10 μL，包括5 μL的PCR产物，0.5 μL的限制性内切酶Alu Ⅰ(5 U；Takara)，1 μL的10 × buffer酶切缓冲液，3.5 μL的灭菌超纯水。酶切反应体系在37 ℃反应过夜，酶切产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳成像检测。
2 结果与分析 2.1 PCR扩增结果PCR扩增结果如图 1和图 2所示，岩牡蛎和长牡蛎16S rDNA与COI均扩增出一条单一片段，未发现其片段长度多态性。16S rDNA测序得到的片段大小为530 bp(见图 1)，COI测序得到的片段大小为614 bp(见图 2)。
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(1~4：长牡蛎；5~8：岩牡蛎；M：100 bp DNA marker。1~4：C. gigas；5~8：C. nippona；M：100 bp DNA marker.) 图 1 长牡蛎和岩牡蛎16S rDNA片段PCR产物电泳图 Fig. 1 Electrophoretic profile of PCR products of 16S rDNA of C. gigas and C. nippona |
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(1~4：长牡蛎；5~8：岩牡蛎；M：100 bp DNA marker。1~4：C. gigas；5~8：C. nippona；M. 100 bp DNA marker.) 图 2 长牡蛎和岩牡蛎COI片段PCR产物电泳图 Fig. 2 Electrophoretic profile of PCR products of COI of C. gigas and C. nippona |
序列比对及酶切位点分析后发现，在长牡蛎16S rDNA扩增产物中距多核苷酸序列5′端的第457和458位碱基之间的磷酸二酯键为限制性内切酶Alu Ⅰ酶切位点(AGCT)，而岩牡蛎16S rDNA扩增产物有2个Alu Ⅰ酶切位点，分别在370和371碱基之间和406和407碱基之间(见图 3)。在长牡蛎COI扩增产物中距多核苷酸序列5′端的第102和103位碱基间的磷酸二酯键与第576和577位碱基间的磷酸二酯键为内切酶Alu Ⅰ酶切位点，岩牡蛎COI扩增产物只有1个Alu Ⅰ酶切位点，在第378和379碱基之间(见图 4)。
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(下划线标出的为Alu Ⅰ酶切位点。Sites of Alu Ⅰ(AGCT) are underlined with single lines.) 图 3 长牡蛎和岩牡蛎16S rDNA序列比对结果及酶切位点 Fig. 3 Sequence alignment and restriction-site polymorphisms in 16S rDNA sequences of C. gigas and C. nippona |
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(下划线标出的为Alu Ⅰ酶切位点。Sites of Alu Ⅰ(AGCT) are underlined with single lines.) 图 4 长牡蛎和岩牡蛎COI序列比对结果及酶切位点 Fig. 4 Sequence alignment and restriction-site polymorphisms in COI sequences of C. gigas and C. nippona |
限制性内切酶Alu Ⅰ对岩牡蛎和长牡蛎的PCR扩增产物的酶切结果如图 5和6所示，与预期酶切分析结果一致。岩牡蛎16S rDNA片段酶切后得到36、124和370 bp 3个片段，而长牡蛎16S rDNA扩增片段经Alu Ⅰ酶切后得到73和457 2个片段(见图 5)。COI基因片段经Alu Ⅰ酶切后，岩牡蛎产生236和378 2个片段，长牡蛎产生38、102和474 bp 3个片段(见图 6)。虽然有些酶切片段因为太小在琼脂糖凝胶成像中显示模糊，但这并不影响将这2种牡蛎直观地区分开来。
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(1~2：岩牡蛎；3~4：长牡蛎；M：100 bp DNA marker。1~2：C. nippona；3~4：C. gigas；M：100 bp DNA marker.) 图 5 长牡蛎和岩牡蛎16S rDNA酶切结果 Fig. 5 RFLP patterns of 16S rDNA of C. gigas and C. nippona after digestion with Alu Ⅰ |
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(1~2：岩牡蛎；3~4：长牡蛎；M：100 bp DNA marker。1~2: C. nippona；3~4: C. gigas；M：100 bp DNA marker.) 图 6 长牡蛎和岩牡蛎COI酶切结果 Fig. 6 RFLP patterns of COI of C. gigas and C. nippona after digestion with Alu Ⅰ |
岩牡蛎是正在开展全人工繁育的牡蛎养殖新品种，具有较高的经济价值。在引种繁育阶段，牡蛎物种的鉴定十分重要。牡蛎品种出现混杂，会直接影响人工育苗效果。由于牡蛎外部形态特征(如贝壳形状)常随栖息环境的不同而发生很大的改变，依据传统形态分类的方法对其进行物种鉴定存在很大困难。随着科学技术的发展，分子生物学技术的广泛应用解决了此类难题。在以前的研究中，多种分子生物学技术已经应用到牡蛎的物种鉴别中，包括测序[5]，变性梯度凝胶电泳(GDDE)[6]，特异性多重PCR[7]，高分辨率熔解曲线(HRM)[8]等技术。上述方法通常成本较高，或操作繁琐，或设备昂贵，对操作人员技术要求较高。
PCR-RFLP技术是在PCR和DNA序列分析基础上发展产生的RFLP技术，因方法简单、快捷、成本较低，已广泛应用于水产经济物种的分析鉴定。例如，Sumathi等[9]利用PCR-RFLP技术成功鉴定了5种石斑鱼；庄怡等[10]利用PCR-RFLP技术成功鉴定鲫鱼6个不同品系；文菁等[11]利用开发的PCR-RFLP方法成功鉴定了16种经济海参；Pie等[12]利用PCR-RFLP技术快速鉴定了巴西海岸3种重要的养殖牡蛎。
线粒体DNA作为真核细胞的核外遗传因子，结构简单，易于分离，进化速度比核DNA快，已广泛应用于水产动物的种类鉴别中[13-14]。线粒体DNA中，16S rDNA与COI基因片段保守性相对较高，引物可以种间通用，是种类鉴别中常用的基因片段。本研究选用Palumbi等[4]开发的一对通用引物在2种牡蛎中成功扩增出一条530 bp的16S rDNA基因片段，同时设计筛选了一对特异性引物，在岩牡蛎与长牡蛎中成功扩增出一条长614 bp的线粒体COI片段，PCR产物被限制性内切酶Alu Ⅰ酶切后，经琼脂糖凝胶电泳成像显示出大小不同的酶切片段，成功将岩牡蛎与长牡蛎鉴别出来。随机挑选了岩牡蛎与长牡蛎各8个个体进行了测序，测序结果与酶切实验结果一致，未发现酶切位点突变个体，验证了本研究PCR-RFLP鉴定方法的可行性与可靠性。
本研究基于线粒体DNA PCR-RFLP技术开发出的岩牡蛎与长牡蛎鉴定方法操作简单，仅仅需要PCR扩增目的基因片段，经特异性内切酶酶切、电泳后，即可有效鉴别岩牡蛎与长牡蛎。鉴定结果准确可靠，有利于节约成本，提高牡蛎样品的鉴定效率，同时为岩牡蛎养殖新品种的开发提供了技术手段。
4 结语本研究基于岩牡蛎与长牡蛎16S rDNA与COI基因片段开发了一种快速高效的PCR-RFLP鉴定方法。利用通用引物与本研究开发引物扩增2种牡蛎的线粒体16S rDNA与COI基因片段，应用同一种限制性核酸内切酶Alu Ⅰ对PCR产物进行酶切，并对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳。根据酶切图谱可有效鉴别岩牡蛎与长牡蛎。这种简单、可靠、经济的PCR-RFLP鉴定方法，能够为岩牡蛎养殖新品种的开发提供技术支撑。
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