2020, Vol. 50
促性腺激素释放激素(Gonadotropin-releasing hormone, GnRH)是一种神经肽类激素，是性激素合成与性腺发育的关键内分泌调控因子[1]。在鱼类和其它脊椎动物中，GnRH通过刺激垂体促性腺激素(Gonadotropin, GtH)的产生从而调节性腺类固醇激素的合成与释放，促进性腺发育成熟[2]，然而目前对贝类GnRH的调控机制了解甚少。近年来，在几种贝类体内均发现了GnRH多肽的存在，GnRH基因在虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)和长牡蛎(Crassostrea gigas)的神经组织中高度表达，且与脊椎动物GnRH基因相比具有较高的同源性和结构相似性[3-5]。此外，Rodet等在长牡蛎体内克隆到了GnRH受体基因，并发现该基因主要在雌雄性腺中表达[6]。Treen等研究发现GnRH多肽可刺激体外培养的虾夷扇贝精原细胞分裂[7]。目前在软体动物中尚未发现GtH同源基因的存在，Kah等[8]推测GnRH的作用方式可能随动物神经系统的进化而演变，在神经系统较为简单的无脊椎动物中，GnRH可能通过直接作用于性腺发挥其生殖调控作用，目前这一观点仍有待于进一步证实。
脊椎动物通过“GnRH-GTHs-性激素合成通路”调控性腺发育，性激素由孕烯醇酮通过Δ4和Δ5两种主要途径合成，这两条途径都涉及细胞色素P450c17(CYP17)以及3β-羟类固醇脱氢酶(3β-hydroxysteroid dehydrogenase，3β-HSD)和17β-羟基类固醇脱氢酶(17β-hydroxysteroid dehydrogenase, 17β-HSD)[9]。在双壳动物体内，性激素(雌二醇、睾酮和孕酮等)已经被广泛的鉴定和量化，许多研究通过对双壳贝类性腺组织中类固醇激素代谢、生化变化的研究，提出双壳贝类体内性激素的主要合成途径与脊椎动物类似，且类固醇合成酶对性激素的生物合成至关重要，其中，CYP17、3β -HSD和17β-HSD是关键的性激素合成酶[10-13]。脊椎动物中CYP17、3β-HSD和17β-HSD在转录水平由GnRH、GtH通过其受体激活。然而在软体动物中这3种酶基因表达调控的相关研究尚未见报道。本文在前期克隆了菲律宾蛤仔(Ruditapes phili-ppinarum)rp-GnRH全长cDNA序列的基础上，设计并筛选了特异性干扰GnRH mRNA表达的dsRNA，旨在通过RNAi技术，研究菲律宾蛤仔rp-GnRH基因沉默对性腺中性激素合成相关基因表达的影响，进而探讨GnRH在菲律宾蛤仔生殖内分泌调控中的作用。
1 材料与方法 1.1 dsRNA制备采用体外合成法制备GnRH及绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein)的dsRNA用于干扰实验。根据菲律宾蛤仔GnRH基因序列信息(GenBank KF891317)和RNAi引物设计原则设计了两组不同的引物，并分别在每组引物的正义链和反义链的5’末端添加T7序列(见表 1)，以蛤仔脏神经节cDNA为模板，PCR扩增特异序列。根据绿色荧光蛋白(EGFP-C1，Clontech)序列信息设计RNAi引物，用以从EGFP-C1中扩增特异序列。
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表 1 RNAi dsRNA合成引物 Table 1 Primers used for dsRNA synthetize |
用TIANgel Midi Purification Kit(TIANGEN)纯化PCR产物，按照T7 RiboMAXTM Express RNAi System(Promega)试剂盒说明书的方法，体外合成用于干扰GnRH表达的dsRNA及EGFP-dsRNA(阴性对照)，并用不含RNase的DNaseⅠ(Takara)消化模板DNA。将获得的dsRNA以1%琼脂糖凝胶电泳分析其大小和纯度，用核酸蛋白仪(Ultrospec 2100)测定合成的dsRNA浓度和OD值，OD260/OD280为1.84~2.16。
1.2 GnRH-dsRNA筛选及不同时间作用下的干扰效率菲律宾蛤仔于2017年11月采自青岛市红岛养殖场，壳长(3.4±0.3) cm，性腺发育处于休止期。实验前于实验室暂养一周，定期换水和投喂螺旋藻粉。将菲律宾蛤仔随机分为4组：空白对照组(PBS组)、阴性对照组(EGFP-dsRNA组)和2个GnRH干扰组(GnRH-ds1组、GnRH-ds2组)，每组3个平行，每个平行注射3个个体。将体外转录合成的dsRNA溶解于灭菌的PBS缓冲液中，用注射器从菲律宾蛤仔双壳铰合部注入血腔中，其中空白对照组每个个体注射50 μL灭菌的PBS，阴性对照组和2个GnRH干扰组每个个体分别注射50 μL(10 μg/50 μL)的EGFP-dsRNA、GnRH-ds1和GnRH-ds2。参考王晓安等[14]，菲律宾蛤仔脏神经节位于后闭壳肌膜上，在注射后的0、24、48和72 h用镊子取脏神经节提取总RNA，用RT-qPCR法测定GnRH的表达水平，计算干扰率。
1.3 不同浓度GnRH-dsRNA的干扰率挑选36只健康的蛤仔，随机分为4组，根据GnRH基因干扰链筛选结果，参考合浦珠母贝(Pinctada fucata)[15]目的基因dsRNA的浓度设定，设定空白对照组(注射50 μL灭菌的PBS)、阴性对照组(注射50 μL 20 μg/50 μL EGFP-dsRNA)、GnRH-ds1低浓度组(注射50 μL20 μg/50 μL GnRH-ds1)和GnRH-ds1高浓度组(注射50 μL 30 μg/50 μL GnRH-ds1)，于48 h后用镊子取脏神经节提取总RNA，用RT-qPCR法测定GnRH的表达水平，计算干扰率。
1.4 GnRH干扰对性腺发育相关基因的表达研究将菲律宾蛤仔随机分为3组，包括空白对照组(PBS)、阴性对照组(EGFP-dsRNA)和GnRH-ds1组。空白对照组每个个体注射50 μL灭菌的PBS缓冲液，阴性对照组每个个体注射50 μL EGFP-dsRNA，RNAi组每个个体分别注射50μL筛选出的30 μg/50 μL GnRH-ds1。于48 h后取性腺组织提取总RNA，用RT-qPCR法测定性激素合成相关基因的表达。
1.5 基因表达的RT-qPCR分析根据RNAiso Plus(TaKaRa，大连)说明书分别提取脏神经节、性腺总RNA。每一样品取1 μg总RNA，按照PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa，大连)试剂盒说明书反转录合成cDNA，以cDNA为模版，进行实时荧光定量PCR反应用于检测rp-GnRH及性激素合成相关基因表达量, 所用引物见表 2。以18s rRNA为内参基因，荧光定量数据分析采用2－ΔΔCt法。用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)，采用Tukey’s多重比较检验差异显著性，以p < 0.05作为差异显著标准。
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表 2 荧光定量引物 Table 2 Primer sequences used in RT-qPCR |
注射后的0、24、48和72 h，提取脏神经节检测GnRH的相对表达量。结果表明，PBS组与阴性对照组(EGFP-dsRNA)相比，GnRH的表达量无显著性差异(p＞0.05)。在注射后48 h，两个干扰组GnRH的表达量出现显著下降(p < 0.05)，其中GnRH-ds1注射组GnRH表达量干扰率为63.3%，GnRH-ds2注射组干扰效率为38.9%(见图 1)。
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图 1 dsRNA注射对菲律宾蛤仔脏神经节GnRH基因表达的影响 Fig. 1 The effect of dsRNA injection on the expression level of GnRH mRNA in R.philippinarum visceral ganglion |
根据2.1中GnRH的干扰效果，选择GnRH-ds1进行注射，设置浓度梯度为20 μg/50 μL和30 μg/50 μL，于48 h取样检测抑制效果。结果表明，注射后48 h，PBS组与阴性对照组相比，GnRH基因表达量无显著性差异(p>0.05)。高浓度(30 μg/50 μL)GnRH-ds1注射组的干扰率为73.3%，低浓度(20 μg/50 μL)注射组的干扰率为54.3%(见图 2)。
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图 2 不同浓度dsRNA注射对菲律宾蛤仔脏神经节GnRH基因表达的影响 Fig. 2 The effect of injection different concentrations of dsRNA on the GnRH mRNA expression level in R.philippinarum visceral ganglion |
如图 3所示，注射dsRNA 48 h后，GnRH干扰组的菲律宾蛤仔性腺中17β-HSD和CYP17的基因表达较空白对照组、阴性对照组显著性下降(p < 0.05)，而3β-HSD基因表达量没有出现显著变化(p>0.05)。与PBS对照组相比，GnRH干扰组中17β-HSD及CYP17基因的表达量分别下降了86.3%、84.9%；与阴性对照组相比，17β-HSD及CYP17基因表达量分别下降了78.6%、81.3%。
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图 3 不同处理组3β-HSD、17β-HSD和CYP17基因的相对表达量 Fig. 3 The expression levels of 3β-HSD、17β-HSD and CYP17 mRNA in different treatment groups |
目前，RNAi作为一种简单、高效、特异性沉默同源目标基因的敲减工具, 为动物基因功能的研究提供了新的思路和方法。Fabioux等体外合成了牡蛎性腺基因Oyvlg的RNA干扰链(Oyvlg-dsRNA)，将其注射到牡蛎性腺中成功引起不育现象，首次证明双壳贝类体内注射dsRNA的有效性[16]。这项技术在日本合浦珠母贝、三角帆蚌、栉孔扇贝等双壳贝类中也均有应用报道[15, 17-18]。RNAi在生物体内具有一定的时效性，多数研究表明RNAi持续的时间为2~4 d。对甲壳动物的研究发现在南美白对虾(Litopenaeus vannamei)和克氏原螯虾(Procambarus clarkii)中，注射目的基因dsRNA干扰链后48 h即可达到有效干扰效果[19-20]。Feng等探究栉孔扇贝Cf-dmrt-like mRNA基因功能时dsRNA注射后72 h Cf-dmrt-like表达量显著性降低[18]。本研究结果显示，GnRH-ds1干扰链注射后48 h显著下降，在注射后72 h，GnRH基因的表达量开始回升(见图 1)。在RNAi实验中，dsRNA处理后目的基因mRNA表达水平下降70%被认为干扰有效[21]。已有研究表明在RNAi实验中dsRNA的有效注射浓度有所区别：如李颖翔等设计的长牡蛎Toll样受体(Toll-like receptor)的dsRNA的有效注射浓度为100 μg/100 μL[22]。Fang等以合浦珠母贝为研究对象，设计了3种不同浓度的dsRNA用以抑制5个与贝壳矿化有关的基因的表达，结果显示高浓度组(160 μg/100 μL dsRNA)对目的基因的抑制率显著高于低浓度组(40 μg/100 μL或80 μg/100 μL)[15]。本研究结果显示向菲律宾蛤仔血腔中注射10 μg/50 μL GnRH-ds1和ds2即可抑制GnRH的表达(抑制率分别为63.3%和38.9%)，但尚未达到有效抑制率，而注射30 μg/50 μL GnRH-ds1 48 h后GnRH的抑制率达73.31%, 说明脏神经节中GnRH的mRNA表达被有效抑制。由此可见，本实验中对GnRH基因的干扰效果也主要受到dsRNA注射浓度的影响有关，30 μg/50 μL为GnRH-ds1注射48 h的有效浓度。
脊椎动物中促性腺激素释放激素(GnRH)是性激素合成与性腺发育的关键神经内分泌调控因子。对硬骨鱼类的研究发现，体内注射GnRH短期内可诱导垂体GTHs合成，同时注射GnRH和多巴胺拮抗剂可促进多数种类的性腺发育成熟[23-24]。目前关于软体动物GnRH功能的研究较少：Lisa等研究发现人工合成的真蛸(Octopus vulgaris)GnRH多肽可促进离体培养的真蛸卵巢和精巢组织中孕酮、睾酮和雌二醇含量显著升高[25-26]；Nakamura等采用人工合成的GnRH离体孵育虾夷扇贝(P. yessoensis)的精巢，发现可促进精原细胞分裂[27]；Song等发现菲律宾蛤仔脏神经节rpGnRH基因表达在性腺发育过程中具有明显的变化规律，其相对表达量与血液中孕酮、睾酮的含量具有显著正相关性[5]。这些研究结果均体现了GnRH在软体动物的性腺发育与性激素合成中可能具有重要作用。脊椎动物中性激素合成关键酶CYP17、3β-HSD及17β-HSD等基因在转录水平受到GnRH和GtHs的调控[10]，但是贝类中GnRH对性激素合成酶基因表达的影响尚未见报道。在本实验中，处于性腺发育休止期的菲律宾蛤仔的GnRH表达被抑制时，两种关键的性激素合成酶CYP17与17β-HSD的基因表达均显著下调，间接证实了双壳贝类中GnRH对其性激素合成的调控作用。另一方面，有研究表明，菲律宾蛤仔在性腺发育时期血淋巴中性激素水平(孕酮、睾酮和雌二醇)的含量及变化均存在雌雄差异[5]，但是GnRH功能在软体动物中的性别差异研究尚未见报道。本实验中的受试菲律宾蛤仔处于性腺发育休止期，因此在本研究中未区分GnRH表达抑制对不同性别菲律宾蛤仔的影响，在今后的实验中将测试GnRH表达抑制对不同发育阶段、不同性别的菲律宾蛤仔性激素合成、主要性激素含量的影响，为查明GnRH在不同发育阶段和不同性别菲律宾蛤仔中的功能提供依据。
目前研究发现贝类体内的性激素合成途径与脊椎动物类似，主要由CYP17、3β和17β-HSDs等性激素合成关键酶介导完成[11-13]。Thitiphuree等研究表明CYP17、3β-HSD和17β-HSD在虾夷扇贝的外周和性腺组织中普遍表达，并且3β-HSD和17β-HSD基因的mRNA表达与性腺成熟度有关[28]。CYP17同时具有17α-羟化酶和17，20-裂解酶的两种活性，参与脊椎动物中孕烯醇酮和孕酮的17-羟化、催化17-羟孕酮转化为雄烯二酮和17-羟孕烯醇酮转化为去氢表雄酮(DHEA)。Mu等研究许氏平鲉发现，性腺中CYP17a1的表达与血清中睾酮浓度密切相关[29]。研究表明在斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)和日本鳗鲡(Anguilla japonica)卵泡发育过程中, CYP17的含量变化极为显著[30-31]。早在1973年，De等利用使用氚和氧化标记的前体，在紫贻贝中发现了CYP17酶活性，随后Carreau等利用同样的方法在乌贼(Sepia officinalis L.)性腺中也发现CYP17酶活性[32]。Thitiphuree等在虾夷扇贝性腺中克隆到了一种CYP17的cDNA全长，与脊椎动物氨基酸序列相比具有较高的保守性，并且虾夷扇贝CYP17 mRNA的表达水平在配子早期分化阶段较高，在性腺成熟中期、后期受到抑制，说明CYP17在贝类的性腺发育过程中具有重要的作用[28]。在脊椎动物中，17β-HSD主要功能是参与性激素的代谢，通过调节细胞内甾体类激素水平从而在生殖系统中发挥重要作用。它可以将脱氢表雄酮转化为雄烯二酮，并能将雌酮转化为雌二醇。对贝类的研究表明，长牡蛎和虾夷扇贝的雌性性腺中均可检测到雌二醇和17β-HSD酶活性，且雌二醇的含量随性腺成熟升高，而排卵后17β-HSD的酶活性与早期性腺分化阶段相比明显降低[33]。Liu等通过实验证明栉孔扇贝中的17β-HSD能有效地将17β-雌二醇转化为雌酮，并可催化睾酮向雄烯二酮的转化。此外，栉孔扇贝雌雄性腺17β-HSD的表达量随配子发育而增加，在生长期和成熟期雄性性腺17β-HSD的表达量显著高于雌性性腺[34]。Zhou等研究证实九孔鲍(Haliotis diversicolor supertexta)中17β-HSD可以催化雌酮转化为雌二醇，并且在成熟期性腺内17β-HSD mRNA表达量显著升高，在产卵后显著性下降[35]。这些研究表明17β-HSD在贝类性类固醇激素的合成中发挥重要作用，进而调节贝类性腺发育。本研究结果显示，当GnRH表达被抑制时，CYP17、17β-HSD mRNA的表达均显著下降，由此我们推测在性腺发育处于休止期的菲律宾蛤仔中，CYP17、17β-HSD基因表达可能在转录水平受到GnRH的调控。
3β-HSD作为动物体内大多数性激素生物合成的关键酶，在睾酮生物合成中起限速酶的作用。Thitiphuree等通过RACE技术获得了虾夷扇贝(Mizuhopecten yessoensis)性腺组织3β-HSD的cDNA全长，研究发现当扇贝性成熟出现大量生殖细胞时，3β-HSD的表达量最高[28]，说明3β-HSD在贝类性腺发育中也可能具有重要作用。Lin等通过GnRH体外培养大鼠睾丸间质细胞发现，GnRH可促进细胞中3β-HSD的表达进而促进睾酮的分泌[36]。Chianese等研究发现蛙(Rana esculenta)体内内源性大麻素通过与大麻素受体(Cannabinoid receptor，CB1)结合抑制下丘脑GnRH分泌及GtH的释放从而降低了蛙睾丸中3β-HSD的表达进而影响睾酮的生成[37]。本研究结果显示当GnRH被干扰时，菲律宾蛤仔性腺内3β-HSD的表达并没有发生显著变化。在脊椎动物中，3β-HSD可能受多种其他因素调节，如卵巢内ghrelin的表达参与抑制3β-HSD活性，降低性激素生成[38]。此外，3β-HSD主要表达于精巢间质细胞、精原细胞、颗粒细胞以及精子中参与睾酮的合成，其中精巢间质细胞是雄激素合成的主要场所，且仅在减数分裂时期发挥上述功能[39]。由此，我们推测菲律宾蛤仔雌雄性腺内3β-HSD的表达调控可能与其所处的性腺发育时期有关。
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