2. 中国海洋大学环境科学与工程学院,山东 青岛 266100
多壁碳纳米管(Multi-walled Carbon Nanotubes,简称MWCNTs)因其独特的一维纳米结构以及优良的力学、电学和化学性能,被广泛地应用于材料工业、电子工业、环保及能源工业、生物医药和催化剂等领域[1-3]。MWCNTs的广泛应用,不可避免地会在生产、使用和废弃过程中释放到环境中去,从而增加了人、动物和植物与MWCNTs的接触机会,其潜在的环境效应和生态风险已经引起了人们的广泛关注。大量关于MWCNTs毒理学的研究结果表明[4-7],MWCNTs能穿过细胞壁和细胞膜进入生命体,进而对人体器官、动物、植物和微生物等产生明显的毒性效应。进入环境中的MWCNTs可通过在土壤、水和空气等环境介质中迁移而进入水环境,最终出现在污水生物处理系统中。Gottschalk等[8-9]模拟了CNTs在污水和污泥中的浓度,预测其浓度在μg/L水平上。同时随着MWCNTs的大规模生产和应用,不可避免地会通过各种途径被释放到环境中,进而导致环境中的MWCNTs浓度不断升高。
鉴于MWCNTs具有较强的生态毒性效应,随着活性污泥中富集的MWCNTs不断增加,可能会对活性污泥中的微生物活性及其群落结构产生影响,进而影响其对污水中有机物、氮和磷等的去除效果。Luongo和Zhang[10]报道了MWCNTs能够抑制活性污泥的呼吸活性,且抑制作用呈明显的浓度-效应关系。Zheng等[11]研究发现,0~100 mg/L MWCNTs的短期暴露对序批式反应器(Sequencing Batch Reactor,简称SBR)的脱氮除磷性能和活性污泥中的微生物活性无明显影响。Hai等[12]发现1和20 mg/L MWCNTs的短期暴露未对SBR的脱氮除磷性能产生影响,然而20 mg/L MWCNTs的长期作用明显抑制了SBR对COD、氮和磷的去除效果。
镀镍碳纳米管(Ni coated multi-walled carbon nanotubes,简称MWCNTs-Ni)是指将原始MWCNTs进行纯化、敏化和活化预处理,然后利用化学镀镍的方法在其表面沉积一层金属镍而制备出的功能化多壁碳纳米管[13]。相较于原始MWCNTs,MWCNTs-Ni在分散性、抗蚀性、电磁性能及微波吸收性能等方面均得到改善,从而大大拓宽了MWCNTs在各领域中的应用[13-14]。高的分散性使得MWCNTs-Ni更易于分散在水环境中,并通过迁移转化最终出现在污水生物处理系统中。然而,关于长期暴露条件下MWCNTs-Ni对污水生物处理系统性能及其微生物群落影响的研究未见报道。根据以往的研究报道[10-12],本研究选用MWCNTs-Ni浓度为10 mg/L,研究了了长期暴露条件下MWCNTs-Ni对SBR性能、微生物酶活性和微生物群落的影响; 通过活性氧(Reactive oxygen species,简称ROS)产生量和乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,简称LDH)释放量的变化情况评价了MWCNTs-Ni的长期暴露对活性污泥的生物毒性。
1 材料与方法 1.1 实验装置及运行条件SBR实验装置如图 1所示。反应器采用有机玻璃材质,有效高度为50 cm,内径为14 cm,有效容积为7.7 L。通过蠕动泵从SBR底部进水,在反应器中部设置出水阀,通过电磁阀控制排水,容积交换率为50%。SBR每日运行3个周期,每个周期8 h,通过时间继电器进行自动调控,具体运行参数如下:进水阶段0.1 h,缺氧阶段2.8 h,好氧阶段3 h,沉淀阶段0.5 h,排水阶段0.1 h,闲置阶段1.5 h。除了沉淀、排水和闲置阶段,磁力搅拌器一直运行,确保污泥和污水充分混合。SBR采用底部曝气方式,空气压缩机通过砂芯曝气头从反应器底部通入空气,并使用气体转子流量计调节曝气量,维持好氧阶段的溶解氧在2 mg/L以上。在好氧阶段结束前,排出一定量的污泥,保证系统的除磷效果,同时使污泥龄保持在20 d左右。
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图 1 SBR示意图 Fig. 1 Schematic diagram of SBR |
SBR的接种污泥取自青岛市李村河污水处理厂二沉池的回流污泥,初始污泥浓度约为3 800 mg/L。SBR进水COD、NH4+-N和磷的浓度约为450、22和5 mg/L,其具体组成成分如下(mg/L):CH3COONa 525.0;NH4Cl 77.5;K2HPO4 15.0;KH2PO4 6.3;NaHCO3 62.5;FeCl3 6H2O 1.68;H3BO3 0.20;CuSO4·5H2O 0.06;KI 0.05;NiSO4·7H2O 0.23;MnCl2·4H2O 0.16;Na2MoO4·2H2O 0.09;ZnSO4·7H2O 0.15;CoCl2·6H2O 0.17和MgSO4 1.3。
1.3 MWCNTs-Ni储备液配制本试验所用的MWCNTs-Ni购于中国科学院成都有机化学有限公司,具体参数如下:纯度>98%,长度50 μm,内径3~5 nm,外径8~15 nm。MWCNTs-Ni储备液的配制方法如下[15]:称取0.5 g MWCNTs-Ni粉末,干燥灭菌后在超净台中冷却,加入1 L经0.22 μm滤膜灭菌的Milli-Q水,用磁力搅拌器搅拌30 min后超声1 h(25 ℃,250 W,40 kHz),随后在25 ℃,150 r·min-1的条件下放置1夜。在每次配制进水前,先将储备液超声1 h以打碎MWCNTs-Ni聚集体。
1.4 分析方法COD、NH4+-N、NO2--N、NO3--N和混合液挥发性悬浮固体浓度(MLVSS)均采用国家规定的标准方法测定[16]。溶解氧和pH分别采用便携式溶解氧仪和PHS-3D酸度计测定。活性污泥比耗氧速率(SOUR)、比氨氧化速率(SAOR)、比亚硝酸盐氧化速率(SNOR)、比亚硝酸盐还原速率(SNIRR)、比硝酸盐还原速率(SNRR)以及脱氢酶(DHA)、氨单加氧酶(AMO)、亚硝酸盐氧化还原酶(NOR)、亚硝酸盐还原酶(NIR)和硝酸盐还原酶(NR)活性的测定参照Ma等[17]报道的方法。活性氧(ROS)和乳酸脱氢酶(LDH)分别通过活性氧检测试剂盒和乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒(碧云天生物技术研究所,江苏)测定。采用16S rDNA高通量测序解析活性污泥中微生物群落的多样性和丰富度。
2 结果与讨论 2.1 MWCNTs-Ni对SBR性能的影响长期暴露条件下MWCNTs-Ni对SBR去除有机物和氮的影响如图 2所示。在进水中未加入MWCNTs-Ni时,SBR经32 d的运行达到稳定状态,出水COD和NH4+-N浓度分别为(39.69±2.95) mg/L和(0.20±0.13) mg/L,去除率稳定在(91.18±0.57)%和(99.10±0.60)%。随后向SBR进水中持续添加10 mg/L的MWCNTs-Ni。SBR出水COD浓度在加入MWCNTs-Ni后的第35~54天升高,最高出水COD浓度为57.29 mg/L,表明10 mg/L MWCNTs-Ni的突然加入对COD去除效果产生了轻微的抑制。随后,SBR出水COD恢复正常,去除率稳定在(91.10±0.52)%,表明10 mg/L MWCNTs-Ni的长期暴露未对SBR去除有机物产生影响。而SBR出水NH4+-N浓度在MWCNTs-Ni作用74 d后逐渐升高,最终在129~148 d时出水NH4+-N浓度增至(13.38±0.34) mg/L,去除率为(39.04±1.61)%,表明MWCNTs-Ni的长期作用明显抑制了SBR对NH4+-N的去除效果。Zheng等[11]和Hai等[12]发现低于100 mg/L MWCNTs的短期暴露未对SBR的脱氮除磷性能产生影响,而长期暴露于20 mg/L的MWCNTs条件下,SBR出水NH4+-N浓度由0.3 mg/L明显增至7.5 mg/L,其原因可能与长期暴露条件下MWCNTs在活性污泥表面的吸附积累有关。同时MWCNTs-Ni的长期暴露过程中可能会释放出Ni2+,从而影响到SBR对NH4+-N的去除效果。在进水中未加入MWCNTs-Ni时,SBR出水NO3--N和NO2--N浓度分别为(4.07±0.13) mg/L和(0.19±0.06) mg/L。SBR出水NO3--N浓度在MWCNTs-Ni加入后逐渐增至(4.99±0.15) mg/L,表明MWCNTs-Ni能够抑制活性污泥的反硝化过程; 随后出水NO3--N浓度迅速降低,在第111~148天时出水NO3--N浓度降至(0.25±0.09) mg/L。SBR出水NO2--N浓度的变化情况与出水NO3--N浓度的变化情况相同,均呈先积累后明显降低的趋势,最终出水NO2--N浓度降至0 mg/L。SBR出水NO3--N和NO2--N浓度变化情况与长期暴露条件下氨氧化过程被抑制有关。
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图 2 MWCNTs-Ni对SBR去除性能的影响 Fig. 2 Effects of MWCNTs-Ni on the SBR performance |
SOUR是指单位质量的微生物在单位时间内的耗氧量,是评价活性污泥中微生物代谢活性的一个重要指标。长期暴露条件下MWCNTs-Ni对活性污泥SOUR的影响如图 3所示。SBR中活性污泥SOUR在第32天、71天、108天和148天时分别为(39.52±1.12)、(37.77±1.53)、(35.64±1.30)和(32.64±1.32) mg O2/(g MLVSS·h),与进水中未加入MWCNTs-Ni时的第32天相比,SOUR在第148天时降低了17.43%(p < 0.05),表明10 mg/L MWCNTs-Ni的长期暴露能够抑制活性污泥中微生物的代谢活性。当SBR运行至第71天时,SBR中活性污泥SAOR和SNOR分别由第32天时的(5.15±0.16)和(4.11±0.15) mg N/(g MLVSS·h)降至(4.48±0.26)和(2.48±0.13) mg) N/(g MLVSS·h)),降低了13.16%和39.68%;而随着SBR运行时间的延长,SAOR和SNOR受到的抑制程度逐渐增加。当SBR运行至第148天时,SAOR和SNOR分别降至(1.22±0.11)和(1.27±0.13) mg N/(g MLVSS·h),降低了76.31%和69.01%(p < 0.05),表明MWCNTs-Ni的长期暴露能够抑制活性污泥中氨氧化菌和亚硝酸盐氧化菌的代谢活性,进而影响SBR对NH4+-N的去除效果。活性污泥SNIRR和SNRR在进水中未加入MWCNTs-Ni时的第32天分别为(13.09±0.49)和(9.84±0.29) mg N/(g MLVSS·h),而随着SBR运行至第148天,SNIRR和SNRR逐渐降至(5.03±0.30)和(2.50±0.30) mg N/(g MLVSS·h),分别降低了61.58%和74.59%(p < 0.05)。上述结果表明MWCNTs-Ni的长期暴露能够对活性污泥中亚硝酸盐还原菌和硝酸盐还原菌的代谢活性产生明显抑制。
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(“*”表示该样品与进水MWCNTs-Ni浓度为0 mg/L时的SOUR和脱氮速率差异性显著(p < 0.05).Asterisks indicate the statistical difference (p < 0.05) from SOUR and nitrogen removal rates at 0 mg/L MWCNTs-Ni.) 图 3 MWCNTs-Ni对活性污泥SOUR和脱氮速率的影响 Fig. 3 Effects of MWCNTs-Ni on the SOUR and nitrogen removal rates of activated sludge |
DHA在有机物降解过程中起关键作用[18],长期暴露条件下MWCNTs-Ni对活性污泥中DHA活性的影响如图 4所示。与进水中未加入MWCNTs-Ni时的第32天相比,活性污泥中DHA活性在第71天时未发生明显变化,而随着SBR继续运行至第148天,DHA由第32天时的(15.26±0.57) mg TF/(g MLVSS·h)降至(11.55±0.57) mg TF/(g MLVSS·h),降低了24.32%(p < 0.05),表明MWCNTs-Ni的长期暴露能够抑制SBR活性污泥中DHA活性。
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(“*”表示该样品与进水MWCNTs-Ni浓度为0 mg/L时的微生物酶活性差异性显著(p < 0.05)。Asterisks indicate the statistical difference (p < 0.05) from the microbial enzymatic activity at 0 mg/L MWCNTs-Ni.) 图 4 MWCNTs-Ni对微生物酶活性的影响 Fig. 4 Effects of MWCNTs-Ni on the microbial enzymatic activity of activated sludge |
AMO和NOR是硝化过程的两种关键酶,而NIR和NR则在反硝化过程起关键作用[19]。随着SBR运行时间的延长,活性污泥中AMO和NOR活性受到的抑制程度逐渐增加,与进水中未加入MWCNTs-Ni时的第32天相比,AMO和NOR在第148天时分别降低了74.64%和73.64%(p < 0.05),表明长期暴露条件下MWCNTs-Ni能够影响活性污泥中的AMO和NOR活性。而NIR和NR活性在第71天时就受到较强的抑制作用,NIR和NR活性分别由第32天时的(7.269±0.224)和(0.323±0.009) μg NO2--N/(min·mg protein)降至(4.600±0.208)和(0.179±0.010) μg NO2--N/(min·mg protein),降低了36.72%和44.42%;当SBR继续运行至第148天时,NIR和NR活性降至(2.595±0.226)和(0.080±0.013) μg NO2--N/(min·mg protein),降低了64.31%和75.21%(p < 0.05)。上述实验结果表明,长期暴露条件下MWCNTs-Ni能够明显抑制活性污泥中的NIR和NR活性。同时,AMO、NOR、NIR和NR活性的变化趋势同SAOR、SNOR、SNIRR和SNRR的变化趋势保持一致,表明MWCNTs-Ni通过影响相关酶活性进而影响活性污泥硝化速率和反硝化速率。
2.4 MWCNTs-Ni对活性污泥的生物毒性影响ROS的产生量和LDH的释放量是反映细胞氧化应激水平和细胞膜完整性的重要指标,因此本实验通过测定活性污泥ROS的产生量和LDH的释放量来评价MWCNTs-Ni的长期暴露对活性污泥的生物毒性影响。如图 5所示,与进水中未加入MWCNTs-Ni时的第32天相比,活性污泥ROS产生量在第71天、108天和148天时分别增加了24.66%、47.53%和67.23%。上述研究结果表明,MWCNTs-Ni(“*”表示该样品与进水MWCNTs-Ni浓度为0 mg/L的样品差异性显著(p < 0.05)。Asterisks indicate statistical differences (p < 0.05) from the ROS production and LDH release at 0 mg/L MWCNTs-Ni)的长期暴露能够诱导ROS产生,过量的ROS会打破细胞氧化过程及抗氧化过程的平衡,从而对活性污泥中的微生物造成氧化性损伤[20-21]。活性污泥LDH的释放量随SBR运行时间的延长而逐渐增加,与进水中未加入MWCNTs-Ni时的第32天相比,LDH的释放量在第148天时增加了65.33%,表明MWCNTs-Ni能够诱导活性污泥中微生物产生严重的细胞膜损伤。
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图 5 MWCNTs-Ni对活性污泥ROS相对产生量和LDH相对释放量的影响 Fig. 5 Effect of MWCNTs-Ni on the relative ROS production and LDH release of activated sludge |
表 1表示不同运行时间条件下微生物群落的丰富度和多样性指数。在第32、71、108和148天时,将测序得到的有效序列以97%的一致性进行OTUs聚类分析,分别获得645、634、584和527个OTUs。SBR中活性污泥样品的Good’s coverage在第32、71、108和148天时为0.999,表明测序结果涵盖了样品中绝大部分物种,能够准确地反映微生物群落丰富度和多样性。Chao1和ACE指数能够表征微生物群落的丰富度,而Shannon和Simpson指数能够表征微生物群落的多样性[22]。Chao1和ACE指数值越大,说明群落丰富度越高; Shannon和Simpson指数值越大,说明群落多样性越高。随着SBR由第32天运行至第148天,Chao1和ACE指数分别从643.7和652.3降至516.6和521.2,Shannon和Simpson指数分别从6.914和0.973降至5.436和0.887,表明MWCNTs-Ni的长期暴露降低了SBR中微生物群落的丰富度和多样性。
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表 1 不同运行时间条件下微生物群落的丰富度和多样性指数 Table 1 Richness and diversity indices of microbial community at different operation times |
图 6表示不同运行时间条件下微生物群落在门和属水平上的分类。在进水中未加入MWCNTs-Ni的第32天,活性污泥微生物群落中丰度最大的菌门Proteobacteria,占总群落的40.91%;其次为Bacteroidetes,占总群落的28.35%。随着SBR逐渐运行至第148天,Bacteroidetes的相对丰度逐渐增至49.17%,显示出较好的MWCNTs-Ni耐受能力; 而Proteobacteria的相对丰度逐渐降至33.71%。Proteobacteria中包含许多与脱氮除磷过程相关的菌属,在氮、磷的去除过程中发挥着重要作用,Proteobacteria相对丰度的降低可能是SBR对氮去除效果降低的原因。此外,Chloroflexi、Ignavibacteriae、Chlorobi、Acidobacteria、Planctomycetes((a)门水平; (b)属水平(a) phyla level and (b) genus levels.)和Actinobacteria等菌门的相对丰度也随MWCNTs-Ni暴露时间的延长而呈降低趋势。当SBR运行至第148天时,亚硝化单胞菌属Nitrosomonas、亚硝化螺菌属Nitrosospira和硝化螺菌属Nitrospira的相对丰度分别由未加入MWCNTs-Ni时的1.19%、0.27%和0.59%降至0.24%、0.09%和0.25%。在污水处理过程中,Nitrosomonas和Nitrosospira是两种主要的氨氧化细菌,能够将氨氮氧化成亚硝氮[23]; 而Nitrospira是一种主要的亚硝酸盐氧化细菌,能够将亚硝氮氧化成硝氮[24]。在不同时间条件下的4个污泥样品中共观察到5种反硝化菌属:Dokdonella、Dechloromonas、Steroidobacter、Devosia和Thermomonas,它们能够在好氧或者厌氧条件下还原硝氮或者亚硝氮[25-29]。当SBR运行至第148天时,Dokdonella、Dechloromonas、Steroidobacter、Devosia和Thermomonas的相对丰度分别从第32天时的3.46%、1.84%、0.71%、0.39%和0.39%降至0.71%、0.25%、0.22%、0.19%和0.11%。上述结果表明,MWCNTs-Ni的长期暴露明显降低了活性污泥中与硝化过程及反硝化过程相关的微生物群落的相对丰度,进而影响到SBR对氮的去除。随着SBR由第32天运行至第148天,Flexibacter、Sediminibacterium、Ignavibacterium、Levilinea、Terrimonas、Methylosinus、Planctomyces和Flavobacterium等菌属的相对丰度逐渐降低; 而Candidatus_Competibacter、Haliscomenobacter、Anaerolinea、Owenweeksia和Lewinella的相对丰度分别从17.33%、9.77%、1.35%、0.43%和0.15%增至23.19%、33.62%、2.14%、2.26%和3.97%,表明MWCNTs-Ni的长期暴露使得活性污泥中的微生物群落结构发生明显变化。
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((a)门水平; (b)属水平。(a) Phyla level; (b) Genus levels.) 图 6 不同运行时间条件下微生物群落在门和属水平上的分类 Fig. 6 Microbial community analysis of activated sludge at different operation times |
(1) 长期暴露条件下10 mg/L的MWCNTs-Ni未对SBR去除有机物产生影响,而NH4+-N的去除率由(99.10±0.60)%明显降至(39.04±1.61)%。
(2) 与进水中未加入MWCNTs-Ni时的第32天相比,活性污泥SOUR和DHA活性在第148天时分别降低了17.43%和24.32%;而脱氮速率和与脱氮相关的微生物酶活性均降低了60%以上,从而导致SBR对氮的去除效果明显降低。
(3) MWCNTs-Ni的长期暴露导致活性污泥ROS产生量和LDH释放量在第148天时分别增加了67.23%和65.33%,表明MWCNTs-Ni的长期暴露能够诱导活性污泥中微生物产生氧化应激和细胞膜损伤。
(4) 高通量测序结果表明长期暴露于10 mg/L的MWCNTs-Ni条件下,活性污泥中与硝化过程相关菌属和与反硝化过程相关菌属的相对丰度明显降低,进而影响到SBR对氮的去除。
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2. College of Environmental Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266100, China