2018, Vol. 48
2. 中国合格评定国家认可中心，北京 100062;
3. 东港出入境检验检疫局，辽宁 丹东 118000;
4. 丹东出入境检验检疫局，辽宁 丹东 118000
弗尼斯弧菌(Vibrio furnissii)原名为产气河弧菌(Vibrio fluvialis)，1983年被Brenner重新划分为弧菌属(Vibrio)的一个新种，为革兰阴性稍弯曲或短杆菌，有长于菌体数倍的鞘生极端鞭毛和较细的侧生波状鞭毛，有动力[1]。弗尼斯弧菌是近年来国内外学者公认的新食源性致病菌，对全球公共卫生和食品安全造成潜在威胁，呈暴发流行或散发性急性胃肠炎。此菌存在于海洋，产生肠毒素，为旅游者腹泻的病原菌之一，且会引起浅表创伤感染、菌血症等疾病[2-4]。此外，该菌通过黏附和侵入宿主组织，从宿主中摄取大量营养，分泌多种毒素，从而引起欧洲鳗鱼(Anguilla anguilla)、对虾(Penaeus chinensi)、文蛤(Ruditapes philippinarum)等水产品的弧菌病[5-12]，给水产养殖带来巨大的经济损失。其中弗尼斯弧菌会导致文蛤细胞及组织病变，鳃丝溃烂、肠胃内膜上皮细胞萎缩，甚至引发其暴发性死亡，也是引起对虾发光病、红腿病、败血症等疾病的主要病原之一[12-14]。因此，亟待建立灵敏、快捷、特异的检测技术用于弗尼斯弧菌快速检测。
目前，弗尼斯弧菌的检测以传统的分离培养、生化鉴定为主，但是该方法检测周期较长、费时费力，且需要检测人员具有专业的知识背景，远不能满足疾病的快速诊断和及时治疗。以核酸为检测靶标的分子检测技术具有检测快速、灵敏度高等优点，在病原微生物的诊断和鉴定等领域得到了广泛应用，但应用PCR检测技术进行弗尼斯弧菌的鉴定检测鲜有报道。toxS基因是首次发现于霍乱弧菌(Vibrio cholerae)中的毒力基因，位于toxR基因(作为霍乱弧菌毒素操纵子的转率激活子)的下游以增强toxR基因的调节转录活性[15]。toxS基因除了存在于霍乱弧菌中外，还存在于副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、费歇尔弧菌(Vibrio fischeri)、创伤弧菌(Vibrio vulcificus)和弗尼斯弧菌等弧菌中[16-21]。目前，toxS基因作为一个靶基因进行弧菌属的PCR检测已得到广泛应用[21]，但是针对弗尼斯弧菌的PCR检测尚未进行研究。因此本研究以toxS基因为靶基因，建立高效、特异的PCR检测方法，用于水产品中弗尼斯弧菌的快速检测。
1 材料与方法 1.1 菌株用于本研究的菌株共82株(见表 1)，采用的标准菌株购买于ATCC、CICC、IQCC，其余菌株来自于丹东出入境检验检疫局在实测样品中分离和收集的菌株，以及来自于北京、上海、广东、辽宁等出入境检验检疫局的样品分离株及疾病预防控制中心的临床分离菌株。所有菌株都经生理生化实验和测序进行验证。
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表 1 菌株信息表 Table 1 Information of bacterial strains |
江瑶贝、蚬子肉、冻鸡肉及冻花菜等共384份样品为辽宁省丹东出入境检验检疫局进出口样品及丹东市市场监测样品。
1.3 方法 1.3.1 DNA提取按照宝生物MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0试剂盒操作说明进行DNA提取。
1.3.2 引物及探针弗尼斯弧菌toxS基因的普通PCR引物及实时荧光PCR引物和探针序列见表 2，由Invitrogen公司合成。
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表 2 弗尼斯弧菌普通PCR引物及实时荧光PCR引物和探针序列 Table 2 Primers and probe used in conventional PCR and real-time fluorescence PCR assays |
使用TaKaRa Ex Taq试剂盒，确定普通PCR方法反应体系：模板液2 μL、10×PCR缓冲液2.5 μL、dNTP 0.25 μL、Taq酶0.125 μL、正反向引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL、补充灭菌双蒸水至总体积为25 μL；以上各组分加入至0.2 mL PCR反应管中，混匀，5 000 r/min离心10s。
反应条件：94 ℃预变性4 min，然后94 ℃ 1 min、53~61℃ 1 min、72 ℃ 1 min，35个循环，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。并以弗尼斯弧菌标准菌株ATCC 35016的基因组DNA为模板进行退火温度的优化，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，以条带最亮，特异性最强的PCR产物所对应的温度为最适退火温度。
1.3.4 实时荧光PCR方法使用ABI的Path-IDTM qPCR Master mix Kit试剂盒，确定荧光定量PCR方法反应体系：模板液2 μL、qPCR Maser mix 12.5 μL、正向引物(10 μmol·L-1) 1 μL、反向引物(10 μmol·L-1)1 μL、探针(10 μmol·L-1) 0.3 μL，补充灭菌双蒸水至总体积为25 μL；以上各组分加入至0.2 mL PCR反应管中，混匀，5 000 r/min离心10 s。
反应条件：95 ℃预变性10 min，然后95 ℃ 15 s、52~62 ℃ 1 min，35个循环，每次循环的退火时收集荧光。并以弗尼斯弧菌标准菌株ATCC 35016的基因组DNA(24 CFU/mL)为模板进行退火温度的优化。
1.3.5 特异性实验选取弗尼斯弧菌菌株6株、溶藻弧菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌、麦氏弧菌等弧菌属和肠杆菌科的菌株(共76株)，分别按照普通PCR方法和实时荧光PCR方法进行扩增，以检验2种方法的特异性。
1.3.6 灵敏度实验将弗尼斯弧菌标准菌株于3%氯化钠碱性蛋白胨水中培养18 h左右后，测其麦氏浊度，估计其菌数，然后按10倍递增进行梯度稀释到10-7，取最后4个稀释液的菌液进行平板计数，每个稀释度重复3个，按照相应的方法培养后进行菌落计数取平均值确定其真实的菌密度。将已准确计数的弗尼斯弧菌菌液进行10倍稀，分别采用传统培养方法、普通PCR方法和实时荧光PCR方法进行检测，以确定3种方法的检测灵敏度。
1.3.7 实际样品检测以传统的检测方法(ISO/TS 21872-2[20])为对照方法，对江瑶贝、蚬子肉、冻鸡肉及冻花菜等共384份样品分别进行普通PCR和实时荧光PCR检测，并使用ABI 3500/3500xL基因测序仪对阳性结果的PCR产物进行测序及比对，以检验本方法的效果。
2 结果 2.1 优化结果以弗尼斯弧菌标准菌株ATCC 35016的基因组DNA为模板进行退火温度的优化。结果显示，普通PCR方法的退火温度为59 ℃(见图 1)，荧光定量PCR方法的退火温度为60 ℃(见图 2)。
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(A:1、17：DNA分子量标准；2~4: 55 ℃；5~6：空白对照(55 ℃)；7~9：57 ℃；10~11：空白对照(57 ℃)；12~14：53 ℃退火；15~16：空白对照(53 ℃)。B: 1：Marker DL2000；2~3：59 ℃；4~5：61 ℃；6：空白对照(59 ℃)；7：空白对照(:61℃)。A:1、17：Marker DL2000；2-4: 55 ℃；5-6：Negative control(55 ℃)；7-9：57 ℃；10-11：Negative control(57 ℃)；12-14：53 ℃退火；15-16：Negative control(53 ℃).B: 1：Marker DL2000；2-3：59 ℃；4-5：61 ℃；6：Negative control(59 ℃)；7：Negative control(:61℃).) 图 1 普通PCR退火温度的优化 Fig. 1 Optimization of PCR annealing temperature |
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图 2 实时荧光PCR退火温度的优化 Fig. 2 Optimization of real-time fluorescence PCR annealing temperature |
特异性实验结果显示，普通PCR方法(标准菌株特异性试验结果见图 3，其他分离株特异性试验结果图略)中的6株弗尼斯弧菌均可扩增出150 bp大小的特异性片断，实时荧光PCR方法(见图 4)中的6株弗尼斯弧菌均可扩增出典型的扩增曲线，而采用2种PCR方法对其余70株弧菌及肠杆菌的扩增都呈阴性，表明2种PCR方法的特异性均为100%。
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(1、20：DNA分子量标准；2：弗尼斯弧菌标准菌株(ATCC 35016)；3：弗尼斯标准菌株(IQCC 12301)；4：弗尼斯标准菌株(IQCC 12309)；5：弗尼斯弧菌分离株(病人)；6：弗尼斯弧菌分离株(蚬子肉)7：弗尼斯弧菌分离株(病人)；8：麦氏弧菌标准菌株(ATCC 700040)；9：河弧菌标准菌株(CICC 21612)；10：拟态弧菌标准菌株(CICC 21613)；11：拟态弧菌标准菌株(IQCC 12304)；12：创伤弧菌标准菌株(ATCC27652)；13：哈氏弧菌标准菌株(ATCC35084)；14：霍利斯弧菌标准菌株(ATCC33564)；15：坎氏弧菌分离株(毛蚶)；16：大肠埃希氏菌标准菌株(ATCC 25922)；17：副溶血性弧菌标准菌株(ATCC 17802)；18：志贺氏菌标准菌株(ATCC 12022)；19阴性对照。1、20：Marker DL2000；2：Vibrio furnissii reference strain (ATCC 35016)；3：Vibrio furnissii reference strain(IQCC 12301)；4：Vibrio furnissii reference strain(IQCC 12309)；5：Vibrio furnissii isolated strain(patient)；6：Vibrio furnissii isolated strain(clam meat)7：Vibrio furnissii isolated strain(patient)；8：Vibrio metschnikovii reference strain(ATCC 700040)；9：Vibrio fluvialis reference strain(CICC 21612)；10：Vibrio minicus reference strain(CICC 21613)；11：Vibrio minicus reference strain(IQCC 12304)；12：Vibrio vulcificus reference strain(ATCC27652)；13：Vibrio harveyi reference strain(ATCC35084)；14：Vibrio hollisae reference strain(ATCC33564)；15：Vibrio campbellii isolated strain(Anadara subcrenata)；16：Escherichia coli reference strain(ATCC 25922)；17：Vibrio parahaemolyticus reference strain(ATCC 17802)；18：Shigella spp reference strain(ATCC 12022)；19：Negative control.) 图 3 普通PCR检测方法特异性试验结果 Fig. 3 Specificity test of conventional PCR |
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(1:弗尼斯弧菌标准菌株(ATCC 35016)；2：弗尼斯标准菌株(IQCC 12301)；3：弗尼斯标准菌株(IQCC 12309):4：弗尼斯弧菌分离株(病人)；5：弗尼斯弧菌分离株(蚬子肉)；6：弗尼斯弧菌分离株(病人)。1: Vibrio furnissii reference strain (ATCC 35016)；2：Vibrio furnissii reference strain(IQCC 12301)；3：Vibrio furnissii reference strain(IQCC 12309):4：Vibrio furnissii isolated strain(patient)；5：Vibrio furnissii isolated strain(clam meat)；6：Vibrio furnissii isolated strain(patient).) 图 4 实时荧光PCR检测方法特异性试验结果 Fig. 4 Specificity test of real-time fluorescence PCR |
弗尼斯弧菌的传统培养方法检测灵敏度可达2.4×104CFU/mL，而DNA梯度稀释检测结果(见图 5和6)显示，普通PCR方法和实时荧光PCR检测方法对于弗尼斯弧菌的检测灵敏度分别为2 400和24 CFU/mL，表明实时荧光PCR检测方法的灵敏度是普通PCR检测方法的100倍，而普通PCR方法和实时荧光PCR检测方法的灵敏度分别是传统培养的方法的10和1 000倍。
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(1、17：DNA分子量标准；2、3：2.4×108 CFU/mL；4、5：2.4×107 CFU/mL；6、7：2.4×106 CFU/mL；8、9：2.4×105 CFU/mL；10、11：2.4×104 CFU/mL；12、13：2.4×103 CFU/mL；14、15：2.4×102 CFU/mL；16：阴性对照Negative control.) 图 5 普通PCR灵敏度试验结果 Fig. 5 Sensitivity test of conventional PCR |
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(1：2.4×106 CFU/mL；2：2.4×105 CFU/mL；3：2.4×104 CFU/mL；4：2.4×103 CFU/mL；5：2.4×102 CFU/mL；6：2.4×101 CFU/mL) 图 6 实时荧光PCR灵敏度试验结果 Fig. 6 Sensitivity of real-time fluorescence PCR |
对384份样品的检测结果如表 3所示：在258份水产品中，检出弗尼斯弧菌阳性6份样品，这6份样品分别来自为：牡蛎(1例)、杂色蛤(2例)、虾(1例)、章鱼(1例)、腌蟹子(1例)样品，其余126份动物及植物产品中均未检出弗尼斯弧菌。以上所有检测结果与传统生化培养方法检测结果一致，6株阳性菌株的测序结果(见图 7~12)与Genbank中登录号为：CP002377.1的弗尼斯弧菌一致性为99%~100%，证明本研究所建立2种PCR方法适用于食品中弗尼斯弧菌的检测。
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表 3 食品样品检测结果 Table 3 The results of aquatic products detection |
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图 7 牡蛎样品中弗尼斯弧菌的序列比对结果 Fig. 7 Sequence alignment of Vibrio furnissii in oyster Samples |
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图 8 杂色蛤样品(C1)中弗尼斯弧菌的序列比对结果 Fig. 8 Sequence alignment of Vibrio furnissii in ruditapes philippinarum Samples(C1) |
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图 9 杂色蛤样品(C2)中弗尼斯弧菌的序列比对结果 Fig. 9 Sequence alignment of Vibrio furnissii in ruditapes philippinarum Samples(C2) |
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图 10 虾样品中弗尼斯弧菌的序列比对结果 Fig. 10 Sequence alignment of Vibrio furnissii in shrimp Samples |
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图 11 章鱼样品中弗尼斯弧菌的序列比对结果 Fig. 11 Sequence alignment of Vibrio furnissii in octopus Samples |
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图 12 腌蟹子样品中弗尼斯弧菌的序列比对结 Fig. 12 Sequence alignment of Vibrio furnissii in pickled crab Samples |
弗尼斯弧菌广泛存在于水体中，尤其多见于海产品中，近年来已有许多关于对虾(Penaeus chinensis)[9]、鱿鱼(Squid)[21]、牡蛎(Ostrea gigas thunberg)[22]等水产品中检测出弗尼斯弧菌的报道，其已成为食品安全的一个重大隐患。目前，关于弗尼斯弧菌检测的报道研究中，对于弗尼斯弧菌的检测采均基于传统的分离培养及生化鉴定方法。如马秀芝等[23]采用分离培养法从132份水产品种分离出2株弗尼斯弧菌，梁健等[24]也采用传统方法从方斑东风螺中分离出1株引起方斑东风螺肿吻病的弗尼斯弧菌。传统分离方法不仅耗时耗力，还存在检测结果不准确等问题，不适于弗尼斯弧菌的高通量快速检测。国内外尚还未有弗尼斯弧菌的PCR检测方法的建立与应用的研究。
目前针对弧菌的特异性检测多针对其hly、tl、toxR、toxS等毒力基因。其中toxS基因是膜整合蛋白的编码基因，参与弧菌毒力基因的转运和表达，广泛存在于多种弧菌中。对toxS基因的生物信息学分析发现，toxS基因呈现出较大的种间差异性，种内保守而种间可变的区域可作为种鉴定的良好分子靶位点[25]，以此建立基于弗尼斯弧菌toxs基因的特异性PCR检测方法。
针对PCR检测方法的特异性试验的研究方面，王华丽等[26]对海产品中副溶血弧菌进行了PCR检测方法的建立与评价，采用11株副溶血弧菌和22株其他细菌进行特异性试验检测。姚东瑞等[27]建立的哈氏弧菌的PCR检测方法中，特异性试验采用1株哈氏弧菌及3株非哈氏弧菌进行检测。陈昌国等[28]建立的溶藻弧菌Taqman探针实时荧光PCR方法中采用1株溶藻弧菌的标准菌株及6株其他细菌进行检测。本研究建立的PCR方法在进行特异性试验时采用了6株弗尼斯弧菌及70株其他弧菌、细菌的标准菌株及分离株，远高于上述文献所报道的方法中采用的菌株数量，这使得菌株特异性试验验证结果更准确。
根据文献[26-29]报道的PCR检测方法，普通PCR方法检测弧菌的灵敏度可以达到104 CFU/mL数量级[26-27]，实时荧光PCR方法检测弧菌的灵敏度可以达到102 CFU/mL数量级[28-29]。而本研究建立的普通PCR检测方法灵敏度分为2 400 CFU/mL，检测灵敏度比文献[26-27]报道的PCR检测方法和ISO分离培养方法均高出10倍；本研究建立的实时荧光PCR检测方法的灵敏度为24 CFU/mL，检测灵敏度比ISO分离培养方法高出1 000倍，与文献[28-29]报道的实时荧光PCR检测方法的灵敏度基本一致。对258份食品样品检测结果显示，本研究建立的2种PCR方法与ISO方法的符合率达到100 %。这个结果可能是由于食品样品中弗尼斯弧菌的感染浓度较高，因而使得这3种方法都可以检出弗尼斯弧菌。
4 结语本研究建立了基于PCR技术的弗尼斯弧菌快速检测方法，结果表明，普通PCR检测方法和实时荧光PCR检测方法的引物和探针具有良好的特异性(100 %)，2种方法的灵敏度分别为2 400和24 CFU/mL，实时荧光PCR检测方法的灵敏度是普通PCR检测方法的100倍。采用本研究建立的方法对384份水产品和食品样品的检测结果显示，共有6份样品检出弗尼斯弧菌阳性，其检测结果与ISO方法检测结果及测序结果一致，表明该方法适用于食品中弗尼斯弧菌的检测。
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2. China National Accreditation Center for Conformity Assessment, Beijing 100062, China;
3. Donggang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Dandong 118000, China;
4. Dandong Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Dandong 118000, China