2023, Vol. 53
链状亚历山大藻(Alexandrium pacificum)是引发世界沿海水域赤潮的主要优势甲藻种之一[1]。该物种会产生强烈的神经性贝毒毒素，导致贝类中毒，并对环境、经济和人类健康造成严重的损害，因而已引起世界各国的广泛关注[2]。为了解赤潮发生和维持的机制，人们对甲藻赤潮发生过程中的物理、化学和生态特性进行了大量的研究[3]。越来越多的证据表明，人为输入氮到沿海地区造成的富营养化是导致赤潮发生的主要原因之一[4]。氮(N)是海洋浮游植物生长和繁殖所必需的常量营养素，是蛋白质、核酸、叶绿素和其他大分子的关键组成成分[5]。缺氮会抑制细胞的生长，改变色素组成，减少光合作用能量的获取，降低光合作用效率，增加浮游植物对紫外线的敏感性和它们抵抗光损伤的能力[6]。因此，浮游植物对环境氮限制的反应能力对于其在海洋中的生存至关重要[7]。所以了解甲藻在不同氮浓度下细胞的特异性反应对于理解赤潮的形成机制具有非常重要的意义。早期对甲藻研究表明，氮影响细胞生长、细胞氮和叶绿素a(Chl a)含量以及甲藻毒素的产生[8]。此外，氮限制也被认为是某些甲藻孢囊形成的主要触发因素[9]。在多种甲藻中也观察到了由环境中氮的变化引起的蛋白质表达谱的改变，如在缺氮的米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)中观察到硝酸盐转运、信号转导、氨基酸代谢、DNA修复和溶血素的高表达[10]。因此，深入研究氮限制条件下甲藻对低氮环境的适应机制有助于揭示甲藻水华的形成机制。
组蛋白在甲藻中是一种异常特殊的存在，甲藻中的组蛋白并不像在其他真核生物中一样参与核小体的组装[11]。组蛋白在甲藻中存在的作用和意义到目前为止仍不完全清楚，而在本研究前期发现，在链状亚历山大藻f/2培养条件转录组中存在一些与表观遗传修饰相关基因，如甲基化转移酶，去甲基化酶基因，且在低氮表达谱数据中部分表现出较高的表达水平[12]，而组蛋白修饰已被证明参与植物几乎所有的生长发育过程，包括生物和非生物胁迫，对环境的响应，细胞增殖和分化等[13]，意味着组蛋白甲基化修饰的调控可能对链状亚历山大藻生长或环境响应等具有特殊的意义。
在链状亚历山大藻转录组数据中含有SET结构域的组蛋白赖氨酸甲基转移酶(主要催化H3赖氨酸上的组蛋白修饰)的基因高达16个，组蛋白甲基化修饰是在特定组蛋白甲基转移酶作用下完成的，组蛋白甲基转移酶的存在数量以及表达量变化是影响组蛋白甲基化类型及其修饰水平变化的一类重要因素；其次，在本课题组以往研究中检测了包括K4、K9、K27、K36与K79等多个位点在内的组蛋白H3甲基化修饰及乙酰化和磷酸化在内的各种修饰类型，发现H3K4me3修饰水平较高[14]；最后，因为链状亚历山大藻基因组巨大且复杂，本文作者拟采用亲缘物种基因组来进行后续比对，而在所有已研究的组蛋白修饰中，只有H3K4me3修饰的保守性最高，在采用近缘物种基因组比对时具有较大的优势。综上所述，本研究选择H3K4me3作进一步的研究。而组蛋白H3的4位赖氨酸的三甲基化(H3K4me3)修饰被认为是植物多种生物过程中基因表达的激活因子[15-16]。H3K4me3的其他功能还包括在mRNA前剪接、重组、DNA修复和增强子活性方面的作用[17]。在微藻中，组蛋白修饰的研究主要集中在海洋硅藻和绿藻中，例如在工业产油微藻微拟球藻的研究中发现不同二氧化碳条件下，H3K27me3、H3K27Ac和H3K9me3的修饰不同程度，且这些修饰与碳代谢基因的表达水平密切相关[18]。在莱茵衣藻中发现组蛋白乙酰化修饰与其热激效应有关[19]。然而，以组蛋白修饰为基础的表观遗传学研究在链状亚历山大藻中仍然是缺乏的。
为探究链状亚历山大藻在低氮条件下对环境N胁迫的特异适应性反应机制。本研究利用染色质免疫共沉淀-测序(Chromatin immunoprecipitation-sequencing, ChIP-seq)方法探讨了链状亚历山大藻在氮限制条件下的生理反应和分子机制，比较了链状亚历山大藻在氮缺乏和氮正常条件下的H3K4me3修饰的差异，分析了链状亚历山大藻在氮缺乏条件下相比正常培养条件调控的差异基因。本研究的目的是在表观遗传修饰水平上揭示H3K4me3对链状亚历山大藻缺氮环境的响应方式及具体的调控机制。
1 材料和方法 1.1 藻的培养，处理条件和计数链状亚历山大藻由中国海洋大学海洋生物遗传与育种教育部重点实验室保存。藻细胞在f/2培养基中生长，光暗周期为12 h∶12 h，光照强度30 μmol·m-2·s-1，温度为(20±1) ℃。在培养基中添加终浓度为882 μmol/L氮(NaNO3)生成正常f/2培养基。而在低氮培养基中添加终浓度为88.2 μmol/L氮(NaNO3)(见表 1)。每天在固定时间(17:00—18:00)采集样本，取样前，通过轻摇培养瓶使细胞均匀分布，然后从每个瓶中3个位置吸取样品1 mL，每个位置重复吸取3次。用于细胞计数的样品(1 mL)在2% 鲁戈氏溶液(Lugol′s sdution)中固定。然后在显微镜下的载玻片上进行计数，以制作藻的生长曲线，观察其生长状态，确定采样时间。
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表 1 链状亚历山大藻氮处理条件 Table 1 Nitrogen treatment conditions of A. pacifiicum |
通过Western blot检测正常和低氮处理条件下H3K4me3的修饰水平。通过蔗糖密度梯度离心法提取核蛋白，Bradford蛋白定量试剂盒(供应商：MDBIO Inc, 货号：KT055)进行定量。以β-actin作为内参抗体，用H3K4me3兔源多克隆抗体(供应商：景杰生物，杭州)检测在不同处理条件下的H3K4me3修饰水平。
1.3 ChIP-seq和ChIP荧光定量PCR 1.3.1 染色质免疫共沉淀(ChIP)在无菌条件下(无菌超净工作台及所用物品均经灭菌处理)，将培养至第13天的正常和低氮处理条件下的链状亚历山大藻收集至50 mL离心管中，用1%的甲醛在室温交联30 min，随后用2 mol/L的甘氨酸(终浓度为0.125 mol/L)室温淬灭交联反应5 min。将收集的藻细胞用灭菌水清洗3次去除甲醛并用液氮冷冻，－80 ℃冰箱保存。染色质提取方法按照Valerie Gendrel等[22]方法进行。随后使用非接触式超声仪(Covaris S220 Focused-ultrasonicator, USA)将染色质剪切成200~500 bp的片段。解交联(RNA酶37 ℃孵育半小时去除RNA，加氯化钠，蛋白酶K，65 ℃过夜)并用凝胶电泳(1.5%琼脂糖凝胶)检测超声的效果。采用Abcam ChIP试剂盒(ab117137)和H3K4me3修饰抗体(PTM-613)进行免疫共沉淀(IP)。根据试剂盒说明书进行解交联和DNA纯化步骤。采用Qubit2.0(供应商：Invitrogen，American)定量DNA浓度。随后的建库和测序由武汉IGENEBOOK生物科技有限公司完成。
1.3.2 软件分析过程完成建库后，将高通量测序(Illunima HiSeqTM2000测序平台)得到的原始图像数据文件经碱基识别(Base calling)转化为原始测序序列。随后使用软件fastqc(version: 0.11.5)完成质控处理，并使用软件Trimmo-matic(version: 0.36)进行原始数据的过滤。然后将得到的数据使用BWA软件(version: 0.7.15-r1140)比对到一种共生甲藻(Fugacium kawagutii)基因组。接着通过比对得到基因组的有效序列的信息。最后利用MACS分析软件(version: 2.1.1.20160309)在基因组范围内分析Peak信息并以q < 0.05作为阈值筛选显著性Peak。
为了进一步探讨组蛋白修饰的结合位点特征，理解组蛋白修饰对基因调控的机制，对修饰调控的基因进行GO和KEGG富集分析。首先将GO注释对应的基因数目进行统计，然后按照分子功能(Molecular function)、细胞组分(Cellular component)和生物学过程(Biological process)分类绘图。其次将GO注释对应的基因进行富集分析，按照P < 0.05筛选出显著性富集结果。同样，将KEGG注释对应的基因数目进行统计，然后根据其功能进行分类绘图。最后将KEGG的map号对应的基因进行富集分析，并按照P < 0.05筛选出显著性富集结果。
1.3.3 ChIP荧光定量PCR为了验证ChIP-Seq结果，本文作者从ChIP-Seq结果中随机选取5个H3K4me3差异调控基因进行ChIP荧光定量实验即ChIP-qPCR验证。利用premier 5.0软件设计引物(见表 2)，采用Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix(生产商：翊圣生物技术有限公司)试剂，在20 μL反应体系中进行ChIP-qPCR反应。反应体系包括: Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix(10 μL)，正向和反向引物(10 μmol/L)，DNA(IP和Input, 约1~2 ng)。每个样品进行3个生物重复和3个技术重复。
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表 2 ChIP-qPCR引物 Table 2 ChIP-qPCR primer |
对低氮和正常条件下的链状亚历山大藻进行计数并绘制生长曲线(见图 1)。由图 1可见，在低氮处理条件下，在第9天以后该藻细胞生长速率开始逐渐减慢且细胞数逐渐减少，这表明在第9天开始链状亚历山大藻开始逐渐产生氮胁迫。通过生长曲线确定选取第13天即氮胁迫最大时取样进行后续实验。
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( (LN: 低氮Low nitrogen treatment；CT: 氮正常Nitrogen normal) ) 图 1 链状亚历山大藻低氮和正常条件下生长曲线 Fig. 1 Growth curves of A. pacificum under low nitrogen and control condition |
采用H3K4me3抗体对低氮和正常条件下提取的组蛋白进行杂交，结果如图 2所示，低氮(LN)和正常(CT)条件下的样品均在组蛋白H3(15 kDa)处出现杂交条带，说明低氮和正常条件下均存在H3K4me3的修饰；而相对正常培养条件，H3K4me3修饰水平虽然在低氮条件下相对较低，但也有一定程度的信号，说明H3K4me3的修饰也发挥了一定的调控作用以响应环境氮限制。
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( (LN: 低氮Low nitrogen treatment；CT: 氮正常Nitrogen normal) ) 图 2 链状亚历山大藻低氮和正常条件下H3K4me3修饰水平 Fig. 2 H3K4me3 modification levels of A. pacificum under low nitrogen and normal conditions |
在ChIP-seq测序结果中，每一个样本的Q20质控在97%以上，Q30质控在93%以上，在基因组映射中，本实验在低氮和正常条件下获得有效峰(Peak)的数目分别为7 822和5 573个，且低氮条件下的比对率为34.94%~46.26%；在正常条件下的比对率为35.57%~46.47%。为进一步研究组蛋白修饰的差异，本文作者还分析了低氮和正常条件下H3K4me3调控的差异基因。通过对链状亚历山大藻不同处理条件下的调控基因进行比较分析，以FDR < 0.05且Fold < 0作为差异基因的筛选标准，分别获得在低氮条件和正常条件下差异基因2 564个，其中1 784个基因在低氮条件下被H3K4me3特异调控(见图 3)，说明H3K4me3在低氮和正常条件下具有不同的调控方式，这可能与链状亚历山大藻对氮缺乏环境的特异性适应相关。
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( (LN: 低氮Low nitrogen treatment；CT: 氮正常Nitrogen normal)；CM：CT和LN中调控的共有基因Comon gene regulated in CT and LN ) 图 3 H3K4me3在低氮和正常条件下调控基因数目韦恩图 Fig. 3 Venn diagrams of gene regulated by H3K4me3 under low nitrogen and normal conditions |
进一步采用ChIP-PCR和ChIP-qPCR对ChIP-seq结果进行验证。在ChIP-seq中随机筛选5个基因，包括细胞色素b基因(CB)、ATP合成酶基因(ATP)，18S核糖体RNA基因(18S rRNA)，泛素激活酶E1基因(E1)，16S核糖体RNA基因(16S rRNA)。以免疫前血清免疫样品作为阴性对照(IgG)进行ChIP-qPCR检测。结果表明PCR验证ChIP实验中Input和IP中均富集到明显条带，且IgG中没有富集到(见图 4A)，ChIP-qPCR中相对于阴性对照，各基因均表现出显著富集(见图 4B)，说明本研究获得的ChIP-Seq结果经ChIP-qPCR验证是可信的。
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( (Input: 超声后样品Ultrasonic sample; IP: 免疫沉淀样品Immunoprecipitation sample; CT: 氮正常Nitrogen normal; LN: 低氮Low nitrogen treatment；E: 每个免疫沉淀样品的qPCR反应测出来的CT值转变为表示总input染色质的百分比的值The CT value measured from the qPCR of each immunoprecipitated sample is transformed into a value indicationg the percentage of tatal input chromatin.) ) 图 4 ChIP-PCR(A)和ChIP-qPCR(B)结果 Fig. 4 The result of ChIP-PCR (A) and ChIP-qPCR (B) |
为进一步分析H3K4me3修饰在低氮条件下的特异调控方式，本文作者对低氮与氮正常条件下调控的基因进行了比较分析，在低氮条件下筛选出上调基因进行GO富集分析，并将所有GO富集结果按照p值从小到大排序，取前10个GO富集功能绘制气泡图，发现H3Kme3在链状亚历山大藻低氮处理条件下，显著调控了无机阴离子、磷酸离子和无机溶质的摄取，次级活性物、无机磷酸盐和金属离子等相关的跨膜转运蛋白活性(见图 5)。在这些分子功能中，有一些基因同时兼具有许多其他功能。其中硝酸盐转运体(Nitrate transporter)、ATP合酶α亚单位(ATP synthase subunit alpha)、半乳糖质子转运体(Galactose-proton symporter)、磷酸载体蛋白(Phosphate carrier protein)、极性膜蛋白(Vacuolar membrane protein)、高亲和力镍转运蛋白(High-affinity nickel transport protein)和铵转运蛋白2(Ammonium transporter 2)等在这些生物学过程中被H3K4me3所调控(见表 3)。
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图 5 H3K4me3在低氮相对于正常条件下调控差异基因的GO富集分析 Fig. 5 GO enrichment analysis of differential genes regulated by H3K4me3 under LN compared to CT |
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表 3 低氮相对于正常条件上调基因的GO富集结果(部分) Table 3 GO enrichment results of upregulated genes under low nitrogen compared to normal conditions (part) |
为更全面的理解组蛋白修饰在链状亚历山大藻低氮条件下的调控机制，探讨其对低氮环境响应的生物学过程，我们将与氮正常条件相比，对低氮处理条件下H3K4me3调控的上调基因进行KEGG富集分析，将不同基因在生物体内相互作用从而实现的生物学功能阐明。通过分析，发现植物-病原体相互作用途径(p=0.000 9)、谷胱甘肽代谢途径(p=0.002)被显著富集。除此之外，还富集了抗坏血酸和醛酸的代谢(p=0.02)等途径(见图 6)。其中钙调素(CaM)、钙依赖性蛋白激酶(Calcium-dependent protein kinase，CPK)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(serine/threonine-protein kinase)、热休克蛋白90(heat shock protein 90)和色氨酸2, 3-双加氧酶(tryptophan 2, 3-dioxygenase)等被调控参与植物-病原体相互作用；S-谷胱甘肽转移酶(GST；glutathione S-transferase)、L-抗坏血酸过氧化物酶(L-ascorbate peroxidase)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase)等参与谷胱甘肽代谢途径；抗坏血酸过氧化物酶(L-ascorbate peroxidase)、葡萄糖醛酸转移酶(glucuronosyltransferase)和肌醇加氧酶(inositol oxygenase)等参与抗坏血酸和醛酸的代谢途径(见表 4)。
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图 6 H3K4me3在低氮相对于正常条件下上调基因的KEGG富集分析 Fig. 6 KEGG enrichment analysis of up differential genes regulated by H3K4me3 in LN compared to CT |
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表 4 低氮相对于正常条件下上调基因的KEGG富集结果(部分) Table 4 KEGG enrichment results of upregulated genes under low nitrogen compared to normal conditions (Part) |
表观遗传修饰可通过调控基因的时空表达及表达方式来调控植物的发育过程和各种生理反应，如组蛋白修饰可通过对转录的调节，建立对环境响应、植物生长的时间和空间控制[20]。Thomas等[21]在拟南芥中发现高氮供应中抑制硝酸盐转运基因NRT2.1的表达同H3K27me3积累以及NRT2.1的H3K4me3和H3K36me3水平的降低有关，而在氮胁迫下H3K4me3和H3K36me3标记在NRT2.1中积累，表明在拟南芥中H3K4me3和H3K36me3修饰是主要响应低氮的关键组蛋白修饰。在研究水稻时发现，NGR5基因通过招募PRC2和NGR5对D14和OsSPL14等分蘖抑制基因所在位点进行H3K27me3甲基化修饰, 从而抑制其表达，提高低氮水平下的水稻产量[22]，即表明H3K27me3修饰可通过抑制某些基因的表达提高水稻对低氮的适应性，而在藻类中关于表观遗传修饰如组蛋白修饰在低氮胁迫下的响应机制的研究仍然是缺乏的。
本研究中，通过ChIP-seq实验发现, H3K4me3修饰在低氮条件下调控的基因与正常条件下存在很大的差异，表明H3K4me3在氮限制的环境响应中存在特殊的作用。通过对链状亚历山大藻低氮条件下H3K4me3修饰的研究，有助于了解其对低氮环境的特异适应机制，全方面研究赤潮的发生机制。
3.1 基因组比对方案迄今为止，在预估的800多万种真核生物中，只有不到250种在染色体水平上完成了基因组测序[23]。然而，为了理解某些重要的生物学过程，通常需要来自几个相关物种的信息来确定共同的过程和它们的进化可塑性。例如，在模式生物海胆(Stronglyocentrotus purpuratus)的发育基因调控网络(GRNs)的详细图谱中，需利用海星和海参等亲缘关系较近物种进行比较研究，以解决长期存在的同海胆发育相关的因素[24]。此外，对于H3K4me3修饰，据报道，人类基因组(有效基因组)和恒河猴基因组中H3K4me3峰覆盖了约5.5%的同源序列，占132 294对同源序列[25]。此外，共有79 865对人鼠同源区域存在共同H3K4me3信号[25]。这表明H3K4me3修饰具有高度保守性。在本研究中，链状亚历山大藻基因组庞大(约60 Gb)[26]，且存在高度的基因组冗余(非编码序列高达60%以上)[27]，这使得在现有技术条件下，多数甲藻基因组的完全测序、组装和注释非常困难。其巨大的基因组信息和非编码序列的高占比意味着甲藻中存在巨大且复杂的调控网络，这可能是引发甲藻赤潮暴发的重要因素。而迄今为止，已完成了共生甲藻(Fugacium kawagutii)的完整基因组的组装和注释并已上传其基因组数据[28]，共生甲藻同链状亚历山大藻相近。因此，本文作者利用该共生甲藻(F. kawagutii)基因组完成了其与链状亚历山大藻基因组的匹配过程，一致性为34%~46%，且通过上述各实验证明该方法是可行的。
本文作者首次使用ChIP-seq技术研究链状亚历山大藻H3K4me3修饰对低氮条件的响应机制，实现了对无参考基因组的物种进行表观遗传修饰的研究。需要指出的是，由于缺乏链状亚历山大藻基因组，其中一些基因可能参与了包括低氮适应在内的各种生物学过程但没有被鉴定出来。
3.2 低氮条件下上调基因的GO富集分析离子的跨膜转运过程是细胞获取养分的重要环节，也是植物在组织器官水平上吸收和转运营养物质的基础[29]。离子和有机分子在细胞器之间的运输是由不同类型的转运体介导的。硝酸盐转运体负责感知外界的硝酸盐的浓度以及内源营养的需求，并对其进行吸收、分配、储存和再动员[30]。其次铵转运蛋白2是位于细胞质膜上的可主动吸收NH4+的跨膜转运蛋白，研究表明铵转运蛋白可应对氮饥饿的胁迫，例如低氮处理后拟南芥AtAMT1.1和AtAMT1.3在根系中的表达量明显升高，AtAMT1.1和AtAMT1.3是在根表皮和皮层的细胞膜上表达的，具有可吸收和运输NH4+功能的铵转运蛋白[31]。ATP合酶α亚基主要参与ATP的合成[32]，半乳糖质子转运体、磷酸载体蛋白、极性膜蛋白和高亲和力镍转运蛋白等主要参与乳糖、磷酸盐、金属离子镍等物质的跨膜运输过程，且镍离子参与氧化应急的胁迫反应，是很多酶的辅基[33-35]。结果表明，氮的消耗激活了转运体的活性，有助于细胞吸收各种无机或有机营养物质，从而获取和重新分配资源以维持细胞基本生长所必需的生理机能，有利于甲藻进化出对低氮环境的多种适应策略。
3.3 低氮同正常条件下上调基因的KEGG富集分析的比较在环境响应过程中，对病原菌的防御可能对链状亚历山大藻的生存至关重要。正如以前的报道，在东海原甲藻中观察到一系列微生物防御基因在赤潮期间活跃表达[32]。有研究表明在赤潮衰退阶段，有些藻类微生物可诱导藻类生长抑制，甚至导致藻类死亡和细胞降解，例如蛙弧菌广泛分布于近海洋环境，可进入藻细胞内溶藻[36]。研究发现玫瑰杆菌(Dinoroseobacter shibae)为微小原甲藻(Prorocentrum minimum)生长初期提供维生素B12，促进藻的生长，而大约21 d后，D. shibae与P.minimum之间转化为敌对关系，细菌开始溶藻[37-38]。同时Seung等[39]在研究对赤潮藻血红哈卡藻(Akashiwo sanguinea)与细菌群落的相互作用中发现，在赤潮衰亡阶段，环境中的某些环境因子(PO43-、NO3-、DOC、pH和叶绿素a)均迅速下降，而总细菌丰度迅速增加，表明在低营养环境中藻类面临严重的微生物的侵袭。而在我们的研究中，低氮条件下链状亚历山大藻对病原菌的防御表明，其存在应对外界侵袭的内在防御机制，来促进其形成孢囊以导致下一次赤潮的暴发。据报道，植物利用Ca2+信号作为响应病原菌识别的重要早期信号事件[40]。钙调素(Calmodulin，CaM)是一类钙离子结合的感应器，在此信号转导过程中，通过钙离子诱导的构象变化，将钙离子信号传导到下游靶点，然后与其靶蛋白相互作用[41]。越来越多的证据表明，这些Ca2+感受器参与了植物对病原菌反应的信号级联反应。CaM基因表达失控或功能丧失会导致植物对免疫反应产生强烈的影响，例如，Takabatake等[41]报道了敲除编码CaM的NtCaM13基因后，烟草植株对烟草炭疽病毒(TMV)、细菌性青枯病菌(Ralstonia solanacearum)、真菌病原菌立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)和瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)的敏感性增强。而钙依赖性蛋白激酶在植物抗病信号的传递中发挥重要作用[42]。热休克蛋白是植物在逆境下或发育的特殊时期产生的应激蛋白，它通过分子伴侣机制保护逆境中的细胞，从而提高植物对逆境的忍耐力[43]。热休克蛋白90(HSP90)是真核细胞在生理和应激条件下蛋白稳态的关键调节因子，它可通过影响蛋白质的结构或折叠来调节细胞内的信号转导过程，从而防止蛋白质的热变性和聚集，其还参与DNA修复、发育、免疫反应和神经退行性疾病等[44]。有研究表明HSP90在控制幼苗生长和植物抗病中有着重要作用，例如: 在对小麦的研究中发现TaHsp90.2和TaHsp90.3参与小麦条锈病的防御[45]。丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶则主要在磷酸化的信号转导中发挥重要作用[46]。多项研究表明，色氨酸2, 3-双加氧酶作为犬尿氨酸代谢通路的初始限速酶之一, 可以催化色氨酸转化为犬尿氨酸及下游代谢产物，且参与炎症免疫反应[47]。H3K4me3修饰对这些防御基因的调控表明了藻细胞对病源微生物的防御在低氮条件下具有潜在重要性。
谷胱甘肽是植物生存的重要代谢物。S-谷胱甘肽转移酶是一类多功能代谢酶，在生物体中广泛存在，其主要功能是催化还原型的谷胱甘肽与有害化合物的偶联，增强这些化合物的水溶性，使其能够被快速排出体外从而减少对细胞的损伤[48-49]。同时，马金华等[50]通过对氮限制条件下的链状亚历山大藻进行研究发现，氮限制细胞中还原型谷胱甘肽(GSH)含量下降，由此可见这可能是因为H3K4me3调控S-谷胱甘肽转移酶，催化GSH来应对氮限制下的氧化胁迫所导致的。据报道在昆虫中，S-谷胱甘肽转移酶可通过代谢外源有毒物质(例如植物次生化合物和化学杀虫剂等)、代谢内源激素以及降解触角感受器中的气味分子等来保护细胞免受氧化损伤[51]。另外，据报道逆境胁迫会诱导植物产生过多的活性氧(ROS)，从而引起氧化胁迫并导致生物大分子如蛋白质、脂质和核酸的严重损伤，最终导致细胞死亡[52]。而谷胱甘肽过氧化物酶是一种负责清除机体内产生的H2O2、有机氢过氧化物和脂质过氧化物的含巯基的过氧化物酶，可阻断ROS自由基对机体的进一步损伤[50]。抗坏血酸过氧化物酶亦是降解过氧化氢的关键酶, 可以清除活性氧来降低氧自由基的浓度, 降低细胞的氧化损伤[49]。在以前的研究中发现，谷胱甘肽和抗坏血酸可以直接或间接地通过抗坏血酸-谷胱甘肽循环来解ROS的毒性，而抗坏血酸过氧化物酶是植物抗坏血酸-谷胱甘肽循环中的关键酶之一[53]。对该酶的调控表明链状亚历山大藻主要通过抗坏血酸-谷胱甘肽循环途径来抵御或清除其在低氮胁迫中产生的超氧自由基和活性氧分子的氧化伤害。所以在低氮条件下链状亚历山大藻通过H3K4me3修饰对这些抗氧化应激相关的基因的调控，来应对氮胁迫对藻体造成的影响及应对环境的变化。
3.4 H3K4me3修饰调控蛋白的降解蛋白质被认为是细胞内氮的主要大分子。有时为了维持在氮限制环境下生存所必需的生理功能，细胞通常会选择性降解某些蛋白质来为其生长提供所需氮源[54]。泛素水解蛋白途径是真核细胞选择性降解蛋白质的主要途径[55]。在拟南芥N限制适应突变体中，基因NLA负责编码一种环型泛素连接酶，其功能是调控拟南芥对N限制的适应[56]。最近的一项研究表明，在硅藻假微型海链藻(Thalassiosira pseudonana)中，氮饥饿促进了蛋白质的降解[5]。而细胞内蛋白质的降解途径主要包括自噬和泛素蛋白酶体两种途径[57]。与此相一致的是，本研究中发现在低氮上调差异基因中，H3K4me3修饰调控了泛素介导的蛋白质降解途径(见图 7)。所以在链状亚历山大藻中低氮条件调控蛋白质的降解可能是细胞适应环境氮限制的另一个重要途径。
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图 7 低氮相对于正常条件下H3K4me3调控蛋白的降解 Fig. 7 Protein degradation was regulated by H3K4me3 modification under LN compared to CT |
本研究发现H3K4me3修饰调控氮胁迫的基因主要涉及各物质和离子的跨膜转运、植物-病原菌相互作用、谷胱甘肽代谢、抗坏血酸代谢、泛素介导的蛋白质降解和自噬等途径，而这些途径可以增强外界营养的获取和内部物质离子的转运，抵御氧化应激和病原菌的侵袭，提高蛋白的降解和自噬来解除部分氮限制，这些途径从多层次多方面促进链状亚历山大藻对低氮环境的响应，对阐释赤潮发生机制具有重要意义。
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