2018, Vol. 48
磷脂酶D(Phospholipase D, PLD)，也叫做磷脂酰胆碱磷脂水解酶(EC 3.1.4.4)，属于磷酸二酯酶超家族中的一员[1]，其主要作用于脂类物质的磷氧键，能够催化两类反应：磷脂的水解和转磷脂化反应，它既能够催化磷酸二酯键的水解，如水解磷脂酰胆碱生成胆碱和磷脂酸，又能催化碱基交换反应的进行，进而合成新型磷脂物质。通常可以利用PLD的转磷脂化反应进行磷脂的改性，从而合成新型的功能性磷脂，譬如磷脂酰甘油(Phosphatidylglycerol, PG)[2]，磷脂酰乙醇胺(Phosphatidylethanolamine, PE)[3]，富含二十二碳六烯酸的磷脂酰丝氨酸(Docosahexaenoic acid-containing phosphatidylserine, DHA-PS)[4]，以及磷脂酰葡萄糖(Phosphatidyl-glucose)[5]等。
迄今为止，PLD在植物(集中在叶子、根、种子等部位)、动物(主要与细胞膜结合，分布在肝脏和脑等器官内)、微生物中均有发现，其中微生物来源较为广泛，已经报道的含有PLD的微生物有链霉菌(Streptomyces)、大肠杆菌(Escherichia coli)、沙门氏杆菌(Bacillus salmonelle)、棒状杆菌(Corynebacterium)、假单胞菌(Pseudomonas)、苍白杆菌(Ochrobactrum)、放线菌(Actinomycetes)、抗辐射不动杆菌(Acinetobacter radioresistens)等[6-8]。
微生物来源的PLD及其在不同宿主中的异源表达，更是当前的一大研究热点，其中使用率最高的就是大肠杆菌[9-11]表达系统，本实验室[12]曾利用大肠杆菌表达系统，对抗辐射不动杆菌(A. radioresistens a2)来源的PLD基因进行异源表达，并进行固定化研究。Chiaki Ogino等[13]利用变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)对肉桂链霉菌(Streptoverticillium cinnamoneum)来源的PLD进行了异源表达，使PLD的表达量大大提高。张莹等[14]第一次使用毕赤酵母(Pichia pastoris)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)表达系统，实现了链霉菌属PLD的异源表达。Liu等[15]也曾用毕赤酵母表达系统对色褐链霉菌(Streptomyces chromofuscus)来源的PLD基因进行异源表达，并用于催化磷脂酰胆碱(PC)合成磷脂酰丝氨酸(PS)。路福平等[16]报道可以使用枯草芽孢杆菌表达系统对PLD进行异源表达。在本研究中，我们选用了重要的原核表达宿主之一——大肠杆菌进行PLD的异源表达。
海洋中富含生物资源，许多具有重要功能活性的酶均来源于海洋，而海洋来源的PLD却鲜少报道[17-18]。本研究对海洋来源的嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia) OUC_Est10进行了基因组测序[19]，经过对测序结果的分析，从中找到1个可能具有磷脂酶D活性的假定基因，并设计全长引物，对此基因进行扩增，与表达载体pET-28a(+)连接，构建重组质粒，导入到E. coli BL21(DE3)并进行表达。通过对S. maltophilia OUC_Est10中的PLD基因进行大肠杆菌异源表达，得到了重组的磷脂酶D-PLDEst10，通过酶联比色法[20]对PLDEst10的水解活力进行测定，并研究了该酶的米氏常数Km和最大反应速率Vmax及pH、温度等对酶活的影响；在水-乙醚双相体系下分别催化PC和DHA-PC转酯合成PS和DHA-PS，并通过薄层层析法和高效液相法对PLDEst10的转酯化酶活进行测定[21]。
1 材料与方法 1.1 菌株与载体S. maltophilia OUC_Est10由本实验室从海洋中筛选并保存[19]。
E. coli DH5α及E. coli BL21(DE3)购自天根生化科技有限公司。
大肠杆菌pET-28a(+)载体，购自全式金公司。
1.2 酶与试剂Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase，购自诺唯赞生物科技有限公司；DNA分子量标准Marker，购自Takara公司；细菌基因组提取试剂盒，快速质粒小提试剂盒，购自天根生化科技有限公司；胶回收试剂盒，购自OMEGA公司；His标签蛋白纯化试剂盒，购自康为世纪生物科技有限公司；其他试剂均为分析纯级别。
1.3 主要溶液配置LB培养基：酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，pH=7.4，121 ℃，灭菌20 min。
ZYP-5052培养基：每25 mL培养基中，加入5 g/L的酵母粉，10 g/L的蛋白胨，50 μL的1 mol/L MgSO4，1.25 mL的20×P (1 mol/L, Na2HPO4，1 mol/L KH2PO4，0.5 mol/L (NH4)2SO4)，121 ℃灭菌20 min，使用时加入0.5 mL的50×5052母液(25%甘油，2.5%葡萄糖，10% α-乳糖)。
水解反应底物：取0.1 g 95% PC溶解在1 mL的乙醚中，再加入9 mL超纯水，在匀浆机作用下1 min形成乳浊状，4 ℃放置保藏，保质期为2周。
转酯反应底物：称取一定量的大豆来源的95% PC，利用乙醚溶解，终浓度为10 mg/mL；称取一定量的鱿鱼中提取的DHA-PC，利用乙醚溶解，终浓度为10 mg/mL。
1.4 实验方法 1.4.1 磷脂酶D基因的PCR扩增及产物纯化利用NCBI数据库与S. maltophilia OUC_Est10基因组序列进行比对分析，发现一段假定的PLD编码序列。按照预测得到的PLD基因开放阅读框(ORF)序列，设计引物Primer F (CCGGAATTCATGAGCCTGCCCAAGCCCCT)与Primer R (CCCAAGCTTCTACAGCTGCGATTCCACCG)，含有EcoRI和HindⅢ两个限制性酶切位点，以提取的S. maltophilia OUC_Est10的基因组DNA为模板，使用高保真的DNA聚合酶，对PLD基因进行PCR扩增。反应体系(50 μL)如下：DNA模板1 μL(终浓度为50 ng)，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1 μL(1 U)，2×Phanta Max Buffer 25 μL(终浓度为2 mmol/L)，前后引物分别为2 μL(终浓度为0.4 μmol/L)，dNTP Mix 1 μL(终浓度为0.2 mmol/L)，ddH2O 18 μL。反应条件为：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸2 min，重复变性到延伸步骤30个循环，75 ℃最终延伸5 min，10 ℃保温。PCR扩增结束后，根据目的产物的扩增效果，采用跑琼脂糖凝胶电泳的方法或者利用PCR产物纯化试剂盒进行产物回收。
1.4.2 PLDEst10-pET-28a(+)重组质粒的构建将PCR扩增得到的目的基因序列和pET-28a(+)质粒，分别用EcoRI和HindⅢ限制性内切酶进行双酶切，连接后转化E. coli DH5α，并通过卡那霉素抗性平板获得重组体的单菌落。经过阳性克隆验证，将阳性克隆子的质粒再转入到大肠杆菌菌株BL21中进行蛋白表达。
1.4.3 酶液制备及纯化将构建的产PLDEst10的E. coli BL21(DE3)接种到ZYP-5052培养基中，20 ℃发酵诱导表达48 h，收集菌体超声破碎，冷冻离心后得到PLDEst10粗酶液，经过0.45 μm滤膜过滤备用。
使用康为世纪生物科技有限公司的His标签蛋白纯化试剂盒，进行PLDEst10粗酶液的纯化，具体操作如下：首先收集菌体后，加入细菌裂解液，利用超声波破碎，冷冻离心，收集上清中的可溶性蛋白，过滤备用。然后组装层析柱，柱平衡结束后即可上蛋白样，控制液体加入速度来控制流速，收集穿透峰。纯化过程使用15倍柱体积的柱平衡缓冲液冲洗柱子，洗去杂蛋白。随后使用咪唑浓度为80 mmol/L的洗脱缓冲液进行洗脱，收集洗脱峰。洗脱结束后，依次使用10倍柱体积的去离子水洗涤柱子，再用3倍柱体积的20%乙醇平衡，封柱后2~8 ℃保存。纯化结束后，利用SDS-PAGE蛋白电泳进行表达纯化的检测。
1.4.4 酶学性质研究 1.4.4.1 PLDEst10的Km和Vmax测定采用双倒数法测定PLDEst10的Km和Vmax值。底物PC浓度分别为0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0和4.0 mmol/L，在37 ℃恒温水浴锅内反应10 min，进行显色反应，根据PLD水解活力-酶联比色法测定相应酶活[20]，进一步计算Km和Vmax值。
1.4.4.2 PLDEst10水解活力最适pH和pH稳定性为考察pH对PLDEst10水解活力的影响，分别在pH为4.0~11.0的缓冲液中进行反应，反应结束后进行水解酶活力检测。为考察PLDEst10对pH的稳定性，将PLDEst10分别置于上述pH的缓冲液中，并在4 ℃冰箱内过夜放置，然后按照酶联比色法测定水解酶活，对残余酶活进行计算。
1.4.4.3 PLDEst10水解活力最适温度和温度稳定性为考察温度对PLDEst10水解活力的影响，分别将PLDEst10置于30、35、40、45、50、55和65 ℃条件下反应，并按照酶联比色法进行水解酶活的测定。为考察PLDEst10对温度的稳定性，将PLDEst10分别置于40、45和50 ℃下放置0、0.5、1、2、3和4 h，然后按照酶联比色法测定水解酶活，对残余酶活进行计算。
1.4.4.4 PLDEst10催化转酯反应转酯活力的测定采用粗酶粉，每组反应中冷冻酶粉用量均为60 mg，在两相反应体系[22]中利用PLDEst10催化合成PS和DHA-PS的反应体系为：1 mL 10 mg/mL乙醚溶解的大豆来源的磷脂PC/鱿鱼来源的磷脂DHA-PC与1 mL 1 mol/L丝氨酸溶液(溶于柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，20 mmol/L，pH 6.0)，混匀后在40 ℃震荡反应12 h。反应产物利用毛细管点样吹干后，将硅胶板在展开剂(三氯甲烷：甲醇：水=65：25：4(v/v/v))中展开，然后利用碘蒸气显色。
2 结果与讨论 2.1 PLDEst10-pET-28a(+)重组质粒的构建如图 1A所示，根据假定PLD基因设计引物扩增出的片段与目的片段大小一致，其分子量大约为1 500 bp。图 1B显示，连接有PLDEst10编码基因的pET-28a(+)构建成功。将阳性克隆子导入到E. coli BL21(DE3)感受态细胞中。随后进行了质粒提取并送去测序，经验证符合预期结果，表明用于表达PLDEst10的E. coli BL21(DE3)工程菌株构建成功。
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图 1 PCR扩增及阳性克隆验证结果 Fig. 1 Results of PCR amplification and positive clones verificatioin |
将构建成功的PLDEst10的表达工程菌株进行诱导培养，得到的PLDEst10粗酶液，用His标签蛋白纯化试剂盒对其进行纯化，将蛋白样品进行SDS-PAGE电泳检测，结果如图 2所示，与含pET-28a(+)空质粒的E. coli BL21(DE3)发酵上清液相比，表达PLDEst10的E. coli BL21(DE3)发酵上清液在63~75 kDa之间有一条明显的条带，预测的PLDEst10分子量约为60 kDa，与电泳结果相一致。已报道的磷脂酶D的分子量大小不等[23-24]，分布在16~120 kDa之间，以嗜麦芽窄食单孢菌为PLD的基因来源，得到了新的磷脂酶D-PLDEst10，丰富了磷脂酶D的来源。
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(A. M为Marker，1为含pET-28a(+)空质粒菌株上清，2为表达PLDEst10的E. coli BL21(DE3)上清；B. M为Marker，1为表达PLDEst10的E. coli BL21(DE3)上清，2为纯化的PLDEst10。A. M: Marker, 1: Supernatant of E. coli BL21(DE3) containing pET-28a(+)，2: Supernatant of E. coli BL21(DE3) expressing PLDEst10.B. M: Marker, 1: Supernatant of E. coli BL21(DE3) expressing PLDEst10，2: Purified PLDEst10.) 图 2 重组PLDEst10的异源表达和纯化 Fig. 2 Heterologous expression and purification of recombinant PLDEst10 |
测定PLDEst10的Km和Vmax值时，底物反应速度随底物浓度而变化，当底物PC浓度在0.5~1.0 mmol/L增加的过程中，反应速度基本上成线性增加，当底物PC浓度超过1.0 mmol/L时，反应速度增加缓慢，当底物PC浓度达到2 mmol/L时，反应速度趋于稳定。根据双倒数法计算，得到PLDEst10的Km和Vmax值分别为Km=0.77 mmol/L，Vmax=1.33 mmol·(L·min)-1。
2.3.2 PLDEst10水解活力最适pH和pH稳定性为考察pH对PLDEst10的影响，将酶液在不同pH条件下催化底物PC水解，由图 3显示的结果可知，PLDEst10在pH=9.0的Tris-HCl缓冲液中酶活最高，以该条件下对应的酶活为100%计算，可以发现PLDEst10在pH为6.0~10.0之间相对酶活均高于80%，可见其pH适应范围广泛，已报道的大多数磷脂酶D在碱性条件下水解活力较好[25]，与本研究结果相一致。不同缓冲液之间存在pH的交叉，经过对比可以发现不同的盐离子对PLDEst10的酶活有一定影响，在弱酸和强碱条件下，酶活差异更突出，pH同为6.0时，磷酸缓冲液中PLDEst10的酶活明显高于柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中的酶活，即使pH同为10.0，但不同缓冲液的碱性条件下，碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中PLDEst10的酶活比甘氨酸-氢氧化钠缓冲液的酶活低很多。
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图 3 pH对PLDEst10酶活的影响 Fig. 3 Effect of pH on the relative activity of enzyme |
PLDEst10对于pH稳定性的研究中，将PLDEst10在不同pH环境下4 ℃保存过夜后，进行酶活的测定，结果显示PLDEst10在pH=9.0的Tris-HCl缓冲液中酶活保留最高，残存酶活为66.2%，将该酶活计为100%，由图 4可以看出，PLDEst10在pH为6.0~10.0的条件下相对残留酶活能在50%以上，表明PLDEst10对pH耐受性较好。而在pH为4.0~5.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液和pH为10.0~11.0的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液中，相对残留酶活均较低，说明弱酸和强碱对PLDEst10的酶活影响较大。相对来说，PLDEst10在酸性环境下的稳定性比在碱性环境中的保持得更好。
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图 4 pH对PLDEst10稳定性的影响 Fig. 4 Effect of pH on the stability of PLDEst10 |
温度对PLDEst10酶活具有较大的影响，由图 5显示结果可知，反应温度是40 ℃时，PLDEst10的水解酶活力达到最高值，即40 ℃为最适温度，与抗辐射不动杆菌(A. radioresistens a2)为基因来源的PLDa2的最适反应温度相近[26]，将该温度条件下测定的水解活力记为100%，在30~45 ℃范围内，相对酶活力仍能高于60%。而当温度高于45 ℃时，PLDEst10酶活出现显著降低，高温达到55~60 ℃时，酶活力下降至20%左右，高温会引起蛋白变性而影响酶活。
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图 5 温度对PLDEst10酶活的影响 Fig. 5 Effect of temperature on the relative activity of PLDEst10 |
在温度稳定性方面，将40 ℃下的初始酶活记作100%，由图 6可知，40、45和50 ℃高温对PLDEst10酶活的影响都较大，当PLDEst10在40和45 ℃下放置30 min时，其酶活均出现明显下降，降低了50%左右，随后一直放置到4 h期间，酶活变化已经不太明显，呈现缓慢下降趋势。50 ℃对PLDEst10酶活的影响趋势，整体下降缓慢，应该是50 ℃条件下反应时，PLDEst10的蛋白结构本身已受到破坏，故在此高温放置更长时间，未产生更明显的影响。
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图 6 温度对PLDEst10稳定性的而影响 Fig. 6 Effect of temperature on the stability of PLDEst10 |
根据文献[3, 8]报道，酸性条件更利于磷脂酶D催化转酯化反应，本研究中采用pH=6.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，在两相体系下进行催化反应，利用反应产物中各组分的极性大小不同，在硅胶板上展开时迁移速率不同，从而实现磷脂各组分的分离，薄板层析结果如图 7所示，可以判断克隆表达出来的目的蛋白PLDEst10具有磷脂酶D的催化活性，能够催化PC和DHA-PC相应生成PS和DHA-PS。
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图 7 PLDEst10催化转酯产物的TLC图 Fig. 7 TLC analysis of transesterification product catalysed by PLDEst10 |
使用高效液相测定[26]也分别检测到了PS与DHA-PS的生成(见图 8)，这进一步印证了TLC的结果。如图 8A所示，大部分底物PC转化为产物PS，说明PLDEst10具有较强的转酯活性。但另一方面，当以DHA-PC为底物时，仍有大量底物剩余，仅有少量DHA-PS生成(见图 8B)，该结果显示PLDEst10对鱿鱼磷脂中DHA-PC的催化活性不及大豆磷脂PC，因此在将来的工作中需要进一步揭示PLDEst10的底物选择性机制，并在此基础上进行理性设计改造以获具有更高DHA-PS得率的人工设计PLD突变酶。
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(A. PLDEst10催化PC合成PS；B. PLDEst10催化DHA-PC合成DHA-PS。A. PLDEst10 catalysed PC synthesis PS. B. PLDEst10 catalysed DHA-PC synthesis DHA-PS.) 图 8 PLDEst10催化转酯产物的HPLC图 Fig. 8 HPLC analysis of transesterification product catalysed by PLDEst10 |
(1) 从海洋来源嗜麦芽窄食单胞菌OUC_Est10中克隆并表达了PLDEst10，丰富了磷脂酶D基因来源。
(2) 采用酶联比色法测定了PLDEst10的酶学性质，其米氏常数和最大反应速率分别为Km=0.77 mmol/L，Vmax=1.33 mmol·(L·min)-1；最适反应温度是40 ℃；最适反应pH=9.0，且在中性和碱性条件下酶活较稳定。
(3) 采用水-乙醚双相体系进行催化转酯反应，经过薄层层析法和高效液相法测定，证实PLDEst10可以催化PC和DHA-PC分别生成功能性磷脂PS和DHA-PS，这为新型DHA磷脂的制备提供了重要的工具酶。
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